壯藥千葛頸舒康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

覃文慧，梁可文，黃慧學(xué)

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2 廣西中藥藥效重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200；3 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；4 廣西麥克健峰豐制藥有限公司，廣西 南寧 530104)

千葛頸舒康方是廣西南寧市武鳴區(qū)中醫(yī)醫(yī)院的協(xié)定方，由千斤拔、雞血藤、粉葛等12味藥材組成，具有通龍路、化瘀毒、止疼痛之功效，臨床用于治療椎動(dòng)脈型頸椎病，療效顯著[1]。千葛頸舒康方由多味壯藥、中藥組成，其中千斤拔(壯藥名：土黃芩、大力黃、牛尾蕩)，味甘、淡，性平，通調(diào)龍路，祛風(fēng)毒，除濕毒，補(bǔ)陽(yáng)虛，強(qiáng)筋骨，主治風(fēng)濕痹痛，腰痛，咳嗽等證[2]；粉葛(壯藥名同中藥)味甘、辛，性涼，調(diào)龍路、火路，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)解毒；雞血藤(壯藥名：勾勒給)， 味苦微甘、性溫，通調(diào)龍路，活血補(bǔ)血，祛風(fēng)通絡(luò)，三藥為公藥。川芎、乳香、沒(méi)藥、三七行氣活血、化瘀止痛，桂枝解肌調(diào)和氣血為母藥。石菖蒲(壯藥名：棵息忍)，味辛、苦，性微溫，具有調(diào)巧塢，祛風(fēng)毒，調(diào)氣機(jī)，除濕毒，除瘴毒，通龍路，止痛等功效，為幫藥。白芍通調(diào)氣道，生姜(壯藥名：興)，土甘草調(diào)和諸藥，為帶藥。諸藥合用，共奏通龍路，化瘀毒，止疼痛之功效，可用于CSA導(dǎo)致的頸肩疼痛、眩暈等證。前期已進(jìn)行了制備工藝的研究，為更好地對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究開(kāi)展薄層色譜法對(duì)千斤拔、雞血藤和粉葛進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定粉葛中葛根素含量，為有效評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀 器

LC-10ATVP型高效液相色譜儀(含 VWD 檢測(cè)器),日本島津公司；DV215CD型電子分析天平(精度為 0.0001 g),奧豪斯儀器(上海)有限公司；ME203E/02型電子分析天平(精度為 0.001 g),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；F-040ST型超聲波清洗機(jī),深圳福祥科技集團(tuán)有限公司；薄層預(yù)制 G 板,青島海洋化工廠分廠。

1.2 試 藥

千斤拔對(duì)照藥材(121502-201803)；雞血藤對(duì)照藥材(121173-201805)葛根素對(duì)照品(110773-201816)；桂枝(121191-201605)；芍藥苷(110752-201816)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。10批次千葛頸舒康顆粒(批號(hào)分別為210301，210302，210303，210314，210315，210316，210401，210402，210403，210404)；缺千斤拔陰性樣品，缺雞血藤陰性樣品，缺葛根陰性樣品，由廣西麥克健峰豐制藥有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 千斤拔

取千葛頸舒康顆粒5 g，研細(xì)，放置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，揮干后加水溶解，再用石油醚(60～90 ℃)振搖提取2次，每次15 mL，分取合并石油醚層，濃縮至1 mL，備用。另取對(duì)照藥材(千斤拔)1 g，同法制備。再同法制備缺千斤拔的陰性樣品溶。吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷-苯(3.5:6.5)，展開(kāi)，顯色劑為10%磷鉬酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 千葛頸舒康顆粒中千斤拔的TLC圖Fig.1 TLC map of Qianjinba in Qiangejingshukang granules

2.1.2 雞血藤

圖2 千葛頸舒康顆粒中雞血藤的TLC圖Fig.2 TLC map of Caulis spatholobi in Qiangejingshukang granules

取千葛頸舒康顆粒5 g，研細(xì)，放置于具塞錐形瓶中，加入100 mL乙醇，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加入20 mL乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯液揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，備用。另取對(duì)照藥材(雞血藤)2 g，加乙醇40 mL，同法制備。再同法制備缺雞血藤的陰性樣品溶。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，展開(kāi)劑為二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(8:1.2:0.3:0.5)，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.1.3 粉葛

取千葛頸舒康顆粒2 g，研細(xì)，放置于具塞錐形瓶中，加入50 mL乙醇，超聲提取20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，備用。另取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺粉葛的陰性樣品，同法制備。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-氯仿-水(26:9.4:8.1:4)為展開(kāi)劑，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 千葛頸舒康顆粒中葛粉的TLC圖Fig.3 TLC map of Kudzu powder in Qiangejing Shukang Granules

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：AICHROM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)性：甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 供試品制備

取千葛頸舒康顆粒約0.5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，超聲處理30 min，補(bǔ)重，濾過(guò)，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，備用；取缺粉葛的陰性樣品，同法制備。取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含葛根素80 μg的溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

色譜峰分離良好，陰性無(wú)干擾。理論塔板數(shù)以葛根素計(jì)應(yīng)不低于4500，分離度大于1.5。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

線性關(guān)系考察：取葛根素對(duì)照品適量，制得每1 mL含葛根素171.0 μg的對(duì)照品母液，備用。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得回歸方程Y=10-5X+3.0927(R2=0.9998)。結(jié)果表明，葛根素在17.1～171.0 μg/mL范圍內(nèi)線性好。

精密度試驗(yàn)：按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液(102.6 μg/mL)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄葛根素峰面積。結(jié)果葛根素平均峰面積為6766869，RSD為0.70%(n=6)。

圖4 葛根素對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatogram of puerarin reference substance solution

圖5 供試品溶液高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of the test solution

圖6 陰性供試品溶液高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram of negative test solution

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，取千葛頸舒康顆粒樣品(210301)樣品溶液于0、2、4、6、12和24 h分別進(jìn)樣分析，結(jié)果計(jì)算RSD為1.84%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品(210301)，平行5份，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果葛根素平均含量為6.34 mg/g，RSD為1.80%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品(210301，葛根素含量為6.34 mg/g)9份，每份0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按供試品溶液方法制備，分析測(cè)定后計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Sample recovery test results (n=9)

2.2.4 樣品測(cè)定

取10批千葛頸舒康顆粒樣品，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定，千葛頸舒康顆粒含量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品中葛根素含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of determination of puerarin content in 10 batches of samples (mg/g)

3 結(jié) 論

3.1 TLC實(shí)驗(yàn)

桂枝：本研究曾參考文獻(xiàn)[3]，桂枝中含桂皮醛等成分，供試品加水溶解后用乙醚萃取，萃取液濃縮后，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17:3)為展開(kāi)劑，噴以二硝基苯肼乙醇試液，置日光下檢視。但與對(duì)照藥材和桂皮醛對(duì)照品相應(yīng)位置上，供試品斑點(diǎn)不明顯，因此最終未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

白芍：本研究還曾參考文獻(xiàn)[4]，白芍中含芍藥苷等成分，供試品加水溶解后用水飽和正丁醇萃取，萃取液濃縮后，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)為展開(kāi)劑比較實(shí)驗(yàn)，但供試品斑點(diǎn)干擾明顯，因此最終未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 HLPC實(shí)驗(yàn)

流動(dòng)相選擇：本研究曾采用甲醇-水(25:75)為流動(dòng)相，葛根素與相鄰峰分離度較好，但峰形差，常出現(xiàn)前延峰及拖尾現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)[5]后，采用甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75)為流動(dòng)相，葛根素與相鄰峰不僅分離度良好，且峰形良好，因此最終選擇甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75)為流動(dòng)相。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：參照文獻(xiàn)[6]，以250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，供試品色譜與葛根素對(duì)照品相應(yīng)位置有相同的色譜峰，且能達(dá)到基線分離、線性關(guān)系良好，陰性供試品無(wú)干擾，因此選擇250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本文建立的TLC和HPLC測(cè)定條件法重復(fù)性好、準(zhǔn)確，千葛舒康顆粒的質(zhì)量控制可采用該方法。