雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑的處方工藝篩選與評價*

史亞玲，李淼蘭，謝立穎，姚志喻，陳 卉

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541199)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。根據(jù)2018 年WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)肺癌病例超過200萬人，因肺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過170萬[1-2]，給家庭和社會帶來巨大挑戰(zhàn)。

雷公藤甲素(Triptolide,TP)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤等藥理作用[3-5]。TP可通過抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡以及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等發(fā)揮治療肺癌作用[6-7]。雖然TP具有高效治療肺癌活性，但給藥后主要在肝臟代謝，肝毒性明顯，化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和脂質(zhì)體等納米遞藥系統(tǒng)等方法一定程度上可降低其全身毒性[8]，仍需要根據(jù)疾病情況開發(fā)新型給藥方式。

肺部給藥是一種非侵入性的局部給藥方式，可直接作用于病灶，避免全身給藥造成的生物利用度低和毒副作用，可減小給藥劑量[9]。而以脂質(zhì)體為載體的粉霧劑給藥后可形成儲庫，達(dá)到長效緩釋效果；并具有給藥劑量小、肺部靶細(xì)胞藥物沉積量高等特點(diǎn)，降低毒性的同時提高治療指數(shù)[10]。因此，圍繞增效減毒的目的，本實驗制備雷公藤甲素脂質(zhì)體，凍干后得到了雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑，為雷公藤甲素治療肺癌提供了新策略和實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

LC-20AD高效液相儀,日本島津；Evolion201紫外可見分光光度計,賽默飛世爾；TGL-16C高速離心機(jī),上海安亭；ME204E電子天平,梅特勒-托利多；S10-3磁力攪拌器,上海司樂；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化；Nano ZS激光粒度儀,英國馬爾文；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝；ALPHA1-2凍干機(jī),德國Christ；顯微鏡,日本 OLYMPUS。

1.2 材 料

雷公藤甲素原料藥(純度>95%)，桂林三棱生物科技有限公司；蛋黃卵磷脂,北京索萊寶；膽固醇,上海阿拉丁公司；吐溫80,北京索萊寶；乙腈(TEDIA，色譜純)；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇等試劑(分析純),西隴科學(xué)。

2 實驗與結(jié)果

2.1 雷公藤甲素含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相:乙腈:水=35:65(V/V)；檢測波長：217 nm；流速：1.0 mL/min；溫度：30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

對照品溶液精密稱取TP對照品11 mg，用無水甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中定容，制成1.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品的儲備液。

供試品溶液取雷公藤甲素脂質(zhì)體溶液，加無水甲醇超聲破乳離心，取上清液過0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液即得。

空白對照溶液 取空白脂質(zhì)體溶液，加無水甲醇超聲破乳離心，取上清液過0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.1.2 專屬性

取對照品溶液、供試品溶液及空白脂質(zhì)體溶液1 mL于液相瓶中，按“2.1.1”項色譜條件進(jìn)行分析。

圖1 TP對照品、TP供試品、空白脂質(zhì)體的HPLC圖譜Fig.1 HPLC diagram of TP,TP-L,blank liposome

結(jié)果顯示，使用HPLC檢測TP含量，TP峰型較佳，出峰時間在10 min左右，空白脂質(zhì)體無干擾，表明此方法測定TP含量的專屬性良好。

2.1.3 TP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取TP標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，配置成濃度為0.0226、0.0679、0.0905、0.1131、0.1357、0.1810、0.2262 mg·mL-1TP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。根據(jù)“2.1.1”項色譜條件進(jìn)行測定，以濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為A=14927316C+260982(r2=0.999)，該結(jié)果說明TP溶液其濃度在0.0226～0.2262 mg·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

2.1.4 精密度試驗

將濃度為20、40、100 μg·mL-1的TP標(biāo)準(zhǔn)溶液，于“2.1.1”項下的色譜條件重復(fù)分析5次進(jìn)樣，測出其峰面積，并計算RSD。其峰面積RSD值分別為1.03%、0.98%、1.06%，均小于2%，表明精密度良好。

2.1.5 加樣回收率

往空白脂質(zhì)體溶液中加入不同體積的雷公藤甲素溶液，用甲醇分別配制成15、50、100 μg·mL-1的不同濃度的樣品，依據(jù)“2.1.1”項的色譜條件，對所制備的樣品進(jìn)行5次進(jìn)樣，測定峰面積，計算雷公藤甲素濃度和加樣回收率。加樣回收率結(jié)果分別為：99.38%、101.96%、98.73%，RSD <2%，表明該方法測定TP的準(zhǔn)確度高。

2.2 乙醇注入法制備TP脂質(zhì)體

2.2.1 載藥及空白脂質(zhì)體的制備

稱取適量卵磷脂、膽固醇、雷公藤甲素于燒杯中，加入2 mL無水乙醇攪拌使完全溶解；將此溶液緩慢滴入10 mL純水中，在磁力攪拌器上以300 rpm攪拌0.5 h，用超聲波細(xì)胞破碎儀處理10 min，旋蒸回收乙醇溶劑，透析后得到雷公藤甲素脂質(zhì)體混懸液(TP-L)，于4 ℃條件下保存。采用相同方法制備其空白脂質(zhì)體。

往上述脂質(zhì)體樣品中加入凍干保護(hù)劑，溶解搖勻后置西林瓶中，凍干12 h，過180目篩即可得到TP-LD，置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 處方工藝

單因素考察：以包封率及載藥量為指標(biāo)對Tween-80用量、藥脂比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間4個因素進(jìn)行考察。

凍干保護(hù)劑：根據(jù)凍干粉外觀、粒徑和流動性等指標(biāo)，篩選不同種類及合適比例的凍干保護(hù)劑。

表1 單因素設(shè)計水平表Table 1 Single factor design level table

表2 凍干保護(hù)劑種類篩選Table 2 Screening of freeze-drying protective agents

通過對雷公藤甲素脂質(zhì)體的處方和工藝進(jìn)行單因素篩選，可以得出用乙醇注入法制備雷公藤甲素脂質(zhì)體的較優(yōu)處方為蛋黃卵磷脂16 mg、膽固醇4 mg、雷公藤甲素原料藥2 mg。雷公藤甲素屬于脂溶性藥物，主要是嵌入在脂質(zhì)層中，藥物量過多會影響脂質(zhì)層的分子結(jié)構(gòu)，從而包封率降低，保持磷脂比例不變，增加原料藥的投入量，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)投入藥量增加到2 mg時，脂質(zhì)體的包封率和載藥量都有明顯的提高。適量的0.5%Tween-80-乙醇溶液可以促進(jìn)雷公藤甲素的溶解，減少因雷公藤甲素不完全溶解造成包封率低的誤差，并起到潤滑和乳化的作用。乙醇注入法制備雷公藤甲素脂質(zhì)體，載藥溫度和載藥時間對包封率的影響也較大。經(jīng)過考察，發(fā)現(xiàn)隨著載藥溫度的升高，雷公藤甲素脂質(zhì)體的包封率也有明顯增高的趨勢，而載藥時間則對雷公藤甲素脂質(zhì)體的包封率影響不大，考慮到耗時耗材問題，最終選擇載藥溫度55 ℃、載藥時間0.5 h來制備雷公藤甲素脂質(zhì)體。

表3 單因素考察結(jié)果Table 3 Results of single factors

2.2.3 工藝驗證

根據(jù)上述單因素實驗中得出制備TP-L的條件，即Tween-80 2.5 mL、藥脂比為1:10、載藥溫度55 ℃、載藥時間0.5 h，按此法制備3批較優(yōu)的TP-L樣品，按“2.2”項下方法測定TP-L包封率及RSD。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 Verification of test results

2.3 制劑學(xué)評價

2.3.1 外觀形態(tài)

圖2 加入不同凍干保護(hù)劑的粉霧劑外觀Fig.2 Appearance of powder mist with different types of lyophilized protectants

加入不同的凍干保護(hù)劑，觀察樣品的外觀、復(fù)溶速度。從圖2可以看出，加入甘露醇凍干保護(hù)劑的TP脂質(zhì)體凍干粉呈白色，且飽滿，加入蔗糖的TP脂質(zhì)體凍干粉呈白色，貼壁，萎縮。不同凍干保護(hù)劑對粉霧劑外觀、復(fù)溶速度有影響，從表5結(jié)果可知，甘露醇對脂質(zhì)體粉霧劑保護(hù)效果較好，樣品復(fù)溶速度較快。

表5 不同凍干保護(hù)劑對脂質(zhì)體凍干粉的影響Table 5 Effects of different lyophilized protectants on lipid body freeze-drying powder

2.3.2 流動性、松密度

將TP-LD通過下孔徑為5 mm的玻璃漏斗，并從10 cm的高度緩慢、均勻地落入平板上，形成圓錐體。測量圓錐體的高度(h)和基底的半徑(r)，按公式計算休止角(θ，tanθ=h/r)。粉末休止角為38.7°，說明粉末流動性較好。取量筒，以自由落體方式裝入脂質(zhì)體凍干粉，記錄質(zhì)量與體積，計算得松密度約0.24 g/mL。

2.3.3 包封率和載藥量的測定

取適量TP-L溶液和TP-LD復(fù)溶后樣品，加甲醇破乳、離心取上清液過0.22 μm濾膜，續(xù)濾液按“2.1.1” 項下色譜條件進(jìn)樣測定。計算總藥量(W總)、包封率(EE)和載藥率(LE)，計算公式如下。

(1)

(2)

2.3.4 粒徑及Zeta電位

取適量TP-L和復(fù)溶后的TP-LD 樣品溶液，用超純水稀釋10倍，利用馬爾文激光粒度分析儀測定其粒徑大小及Zeta電位值。取適量TP-LD樣品，加液體石蠟充分?jǐn)嚢璺稚⒑螅谡蔑@微鏡下觀察并測定粉霧劑粒徑大小，平均粒徑為(1.17±0.047) μm，顯微鏡下粉霧劑形狀見圖3(C)。復(fù)溶前后包封率、粒徑及Zeta電位變化結(jié)果見表6。

表6 LTP及LTPD復(fù)溶后包封率、粒徑、電位結(jié)果Table 6 Results of entrapment efficiency, particle size and potential of LTP and LTPD after redissolution

按照篩選的方法制備的脂質(zhì)體包封率約74.6%，凍干后的包封率約為72.9%，凍干前后包封率數(shù)據(jù)差別不大。于馬爾文粒徑儀下檢測，結(jié)果顯示凍干前的溶液粒徑約為113 nm，電位約為-43 mV，凍干后的電位約為-35 mV。 取TP脂質(zhì)體凍干粉復(fù)溶液適量，用純化水再次稀釋到約100倍，在電鏡下測得凍干后的粒徑為1.17 μm左右。

圖3 TP-L 粒徑圖(A),TP-L Zeta電位圖(B),TP-LD粒徑圖 (C,100×R=1.1 μm),復(fù)溶后的TP-LD Zeta電位圖(D)Fig.3 TP-L particle size distribution (A),TP-L zeta potential(B),TP-LD particle size distribution (C,100×r=1.1 μm),TP-LD zeta potential(D)

2.3.5 肺部沉積率的測定

分別稱取30 mg雷公藤甲素脂質(zhì)粉霧劑裝入3號羥丙甲纖維素膠囊中, 然后取上述膠囊10粒, 逐粒置于藥粉吸入器內(nèi), 連續(xù)吸入10粒, 每次10 s, 停泵后打開測定儀, 用10 mL無水乙醇清洗每個接收盤 (裝置、喉部、1～8級共10個接收盤), 連續(xù)2次, 合并后轉(zhuǎn)入50 mL量瓶, 將量瓶中的液體用無水乙醇定容，參考“2.1.1”項色譜方法測定每個接收盤中雷公藤甲素的含量, 按公式計算藥物肺部沉積率 (FPF)，測得FPF為20.57%。

(3)

2.3.6 體外釋放度評價[11]

對于多數(shù)固體劑型來說，藥物的溶出速度直接影響藥物的吸收速度。采用動態(tài)透析法進(jìn)行原料藥TP與TP-LD體外釋藥評價。

圖4 TP-LD和TP原料藥的體外釋放圖Fig.4 In vitro release diagram of TP-LD and TP

分別取TP原料藥和LTPD適量，用3 mL人工肺液完全分散后置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量8000～14000)，以50 mL含0.2%Tween-80的人工肺液為釋放介質(zhì)，控制溫度為37±0.5 ℃，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，分別于5、10、15、30、40、60、90、120、180、240、300、480、720、1440、2160、2880 min取樣1 mL，同時補(bǔ)充同溫等量釋放介質(zhì)。采用“2.1.1”項所建立的HPLC法測定TP含量并計算制劑的溶出度。以時間為橫坐標(biāo)，以藥物累積釋放百分率為縱坐標(biāo)繪制體外釋放曲線。

由以上結(jié)果表明，雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑和雷公藤甲素原料藥在24 h后，體外釋放曲線趨于平緩。雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑在人工肺液里釋放24 h后，累計釋放量達(dá)到約62.5%，而雷公藤甲素在24 h后，累計釋放量達(dá)到約87.1%。由此可見在人工肺液中，雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑同原料藥相比，具有明顯的緩釋效果。

3 結(jié) 論

雷公藤甲素具有抗炎和抗腫瘤等藥理活性，但常規(guī)制劑的全身毒副作用較大。吸入粉霧劑與其他肺吸入劑型如氣霧劑、霧化吸入溶液相比，具有攜帶方便、穩(wěn)定性更好以及靶向遞送病灶等優(yōu)勢，適合肺癌治療。根據(jù)文獻(xiàn)以及預(yù)實驗結(jié)果，本實驗采用乙醇注入法和冷凍干燥法制備的雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑，凍干前和復(fù)溶后粒徑、Zeta電位及雷公藤甲素包封率變化不大，處方工藝簡單可行，穩(wěn)定性和粉體學(xué)參數(shù)良好。接下來，本項目將進(jìn)一步評價粉霧劑的空氣動力學(xué)參數(shù)特征，并進(jìn)行體內(nèi)外抗肺癌療效評價，為雷公藤甲素脂質(zhì)體粉霧劑的開發(fā)提供更充足的實驗數(shù)據(jù)。