玉米醇溶蛋白/阿維菌素納米制劑的制備與性能*

陳樹茂，李梓泳，何培浩，周紅軍，周新華

(1 深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司，廣東 深圳 518102；2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東省普通高校農(nóng)用綠色精細(xì)化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225)

隨著全球人口增加、氣候變化、害蟲和病害爆發(fā)，對糧食的需求量大大增加，農(nóng)用化學(xué)品的用量上升[1]。大量的使用農(nóng)用化學(xué)品對環(huán)境造成很大的污染，一方面，因?yàn)檗r(nóng)藥制劑本身的性質(zhì)直接導(dǎo)致的環(huán)境污染和在使用過程中未作用到目標(biāo)上而流失到環(huán)境中而造成污染；另一方面，農(nóng)民未經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，常常在使用時加大使用劑量，造成大量農(nóng)藥流失。因此有必要對制劑的性能進(jìn)行提升，以減少環(huán)境的污染和提高作物的產(chǎn)量。目前，隨著國家環(huán)保政策和農(nóng)藥管理制度的不斷完善，農(nóng)藥劑型向著綠色水劑化方向發(fā)展[2]。

玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白，因?yàn)槠涮貏e的氨基酸組成，玉米醇溶蛋白能溶解于乙醇與水的混合溶液，但不溶于水和100%的乙醇[3]。其疏水特性能夠很好地封裝疏水性的農(nóng)藥活性組分。蛋白質(zhì)自身富含二硫鍵，因此可以在昆蟲的消化系統(tǒng)中分解，從而釋放載體包封的藥物，起到刺激響應(yīng)的作用[4]。

在本工作中，利用玉米醇溶蛋白的疏水特性對阿維菌素進(jìn)行包封。探究不同混合溶劑與水的比例、不同玉米醇溶蛋白質(zhì)量、不同乙醇濃度對玉米醇溶蛋白粒子粒徑的影響。使用掃描電鏡對其形貌進(jìn)行觀察分析；對粒子在黃瓜葉面上的接觸角和葉面滯留量等進(jìn)行探究，研究了AVM@Zein粒子的抗紫外線性能、緩釋性能及殺蟲活性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要試劑

玉米醇溶蛋白(Zein)、還原型谷胱甘肽(分析純)、胰蛋白酶(豬胰臟)，上海麥克林生化科技有限公司；阿維菌素(AVM，工業(yè)級，純度為95%)，河北威遠(yuǎn)生物化工有限公司；無水乙醇(分析純)，天津大茂化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

激光粒度儀(90 Plus型)，英國馬爾文儀器有限公司；分析天平(SQP型)，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；接觸角儀(Theat型)，瑞士百歐林儀器公司；高效液相色譜儀(1200 S型)，安捷倫科技有限公司。

1.3 AVM@Zein的制備

把0.1 g的Zein和0.01 g阿維菌素溶解在10 mL 70%乙醇溶液，迅速倒入水中，攪拌30 min后轉(zhuǎn)至燒瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，經(jīng)過上述的反溶劑法即可制備載藥粒子(AVM@Zein)。制備過程如圖1所示。

圖1 制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation

1.4 結(jié)構(gòu)表征及性能測試

1.4.1 動態(tài)光散射粒度測試

取稀釋后的樣品溶液于塑料比色皿中，穩(wěn)定2 min后，測定樣品的動態(tài)光散射粒徑，重復(fù)測試3遍。

1.4.2 掃描電鏡(SEM)

將樣品溶液稀釋后取1滴在導(dǎo)電膠上，在室溫下干燥，噴金后在加速電壓為15 kV下獲得樣品形貌圖。

1.4.3 載藥性能

稱取10 mg冷凍干燥后的載藥粒子置于離心管后加入5 mL乙醇，以洗滌載藥顆粒外表面的阿維菌素，12000 rpm離心5 min。取1 mL上清液于10 mL棕色容量瓶中，并用無水乙醇定容。用高效液相在245 nm下測阿維菌素的濃度，根據(jù)公式(1)計算出阿維菌素的包封率(EE)，其中mtotalAVM為體系A(chǔ)VM總質(zhì)量(mg)，mfreeAVM為體系中未包封的阿維菌素質(zhì)量(mg)。

EE=(mtotalAVM-mfreeAVM)/mtotalAVM

(1)

1.4.4 抗紫外性能

把10 mL新鮮制備的載藥懸浮液分散于90 mL水溶液中，在距離20 cm的紫外光源(300 W, Emax=365 nm)的照射下，進(jìn)行抗紫外性能試驗(yàn)。然后每隔一段時間取出一部分溶液，并用高效液相色譜進(jìn)行濃度測定，流動相為乙腈:水=1:9(V/V)。由公式(2)可得殘留率(Rv)，其中A0為AVM在溶液中的初始濃度(mg/L)，Ai為不同光照時間后樣品中的AVM濃度(mg/L)。

(2)

1.4.5 接觸角和葉面滯留量測試

配制2 mg/mL的樣品溶液和AVM溶液，采用光學(xué)接觸角儀測量在黃瓜葉片上的接觸角。黃瓜葉片采摘后用去離子水沖洗干凈，放置于干凈的玻片上晾干。用微量進(jìn)樣器將不同樣品的溶液滴到葉子表面，記錄接觸角，每種樣品在葉片不同部位進(jìn)行3次重復(fù)操作。

將沖洗后晾干的包菜和黃瓜葉片裁成2.5 cm×2.5 cm，浸泡在樣品溶液15 s后，用鑷子垂直提起至無液滴落下，放置于分析天平上稱重。滯留量(LHC)公式如下：

(3)

其中M0和M1分別表示浸泡前后葉片的重量(mg)，S表示葉片的面積(cm2)。

1.4.5AVM緩釋試驗(yàn)

將新鮮制備的載藥粒子懸浮液(5 mL)放入含有1 mg/mL谷胱甘肽(1 mL)的透析袋中，作為氧化還原緩釋刺激響應(yīng)組，用繩子綁緊后置于錐形瓶中，然后在室溫下加入40%乙醇水溶液(50 mL)進(jìn)行緩釋。同時將1 mg/mL谷胱甘肽(1 mL)換成相同濃度胰蛋白酶(1 mL)和水(1 mL)，作為酶刺激響應(yīng)組和空白對照組。在一定的時間間隔，取1 mL樣品于棕色容量瓶后，用高效液相色譜儀測定樣品溶液的AVM濃度，并及時加入1 mL相應(yīng)的乙醇水溶液至錐形瓶。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=8042.8129C-635.125(R2=0.996)計算AVM濃度。累積釋放率(Ri)按照式(4)計算，Ci為每個樣品在不同時間間隔時AVM的質(zhì)量濃度(mg/L)，mAVM為錐形瓶中AVM的總質(zhì)量(mg)。

(4)

1.4.6 殺蟲活性

將上海青葉子(大小：2.5×2.5 cm2)浸泡在濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/L的載藥粒子溶液里，待其自然干燥后，與10頭2齡的小菜蛾一同放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫室中培養(yǎng)48 h后觀察其死亡情況，刺激時不能移動則視為死亡。用AVM乙醇溶液處理昆蟲作為對照組，并計算死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果與討論

通過調(diào)整Zein在混合溶劑的溶解度來探究對AVM@Zein粒徑的影響，控制其自組裝成納米粒子。調(diào)整二元混合溶液中乙醇含量與水相體積比、Zein質(zhì)量、二元混合溶液中乙醇含量等條件來優(yōu)化制備參數(shù)。

2.1 二元混合溶液與水相體積比對粒徑的影響

表1 AVM@Zein在二元混合溶液與水相不同體積比下的粒徑變化Table 1 Particle size change of AVM@Zein under different volume ratio of binary mixed solution and aqueous phase

將100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液里，探究改變水相的體積(25、50、75、100 mL)對粒徑的影響。由表1可知，提高水相的比例可減小粒子的粒徑，但粒子的多分散指數(shù)也升高，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后水相占比高的粒子發(fā)生沉淀，可能是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)加熱時，粒徑分布寬的粒子中的Zein鏈段展開，溶液中的大粒子較多容易發(fā)生聚沉[5]。

2.2 Zein質(zhì)量對粒徑的影響

上述單因素試驗(yàn)中，二元混合溶液:水相的比例(體積比)為10:75條件下制備的粒子粒徑最小。故將不同質(zhì)量(100、400、700、1000 mg)的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液里，倒入75 mL的水相中。探究不同質(zhì)量Zein對粒徑的影響。隨著Zein濃度的增加，原液的黏度上升，影響分散液滴的擴(kuò)散速率，Zein在溶液的形成“核”后有較長的時間可以使粒子不斷長大，導(dǎo)致較大的液滴和更大的粒子。相對來說，較低濃度的Zein擴(kuò)散速率快，成核和生長的時間較短，生成更小的顆粒[6]。

表2 AVM@Zein在不同Zein質(zhì)量下的粒徑變化Table 2 Particle size variation of AVM@Zein under different Zein mass

2.3 二元混合溶液中乙醇含量對粒徑的影響

上述單因素試驗(yàn)中，用質(zhì)量為100 mg的Zein制備的粒子粒徑最小。故將100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL不同濃度的乙醇溶液(70%、75%、80%、85%、90%)里，倒入75 mL的水相中。探究二元混合溶液中乙醇含量對粒徑的影響。隨著乙醇濃度的增加，乙醇濃度從70%增加到90%，納米粒子粒徑從83.72 nm增大到140.92 nm，由于不同溶劑的極性不同，Zein的氨基酸殘基發(fā)生重排，當(dāng)疏水鏈段暴露在聚集體表面時，Zein分子之間的疏水作用使粒子發(fā)生不同程度的團(tuán)聚導(dǎo)致粒徑變大[7]。

表3 AVM@Zein在二元混合溶液中不同乙醇含量下的粒徑變化Table 3 Changes in particle size of AVM@Zein with different ethanol contents in binary mixed solution

2.4 最小粒徑的AVM@Zein的包封率

表4 最小粒徑的AVM@Zein的包封率Table 4 Encapsulation efficiency of AVM@Zein with smallest particle size

從上述的單因素試驗(yàn)可知，100 mg的Zein和10 mg AVM溶解于10 mL 70%的乙醇溶液條件下制備的粒子粒徑最小，故以此為最優(yōu)樣品進(jìn)行包封率及其他試驗(yàn)表征。如表4所示，AVM@Zein的包封率為48.45%。

2.5 納米粒子形貌

圖2為Zein粒子的掃描電鏡圖，AVM@Zein為較為規(guī)則的球狀顆粒。Zein的蛋白質(zhì)鏈段在70%乙醇溶液中為舒展?fàn)顟B(tài)，倒入水后溶劑極性增加，蛋白質(zhì)鏈段發(fā)生卷曲，形成較為規(guī)則的納米球體，在制樣的干燥過程中，粒子外部的氨基酸鏈段因疏水作用使部分粒子之間發(fā)生黏連。

圖2 AVM@Zein的SEM圖Fig.2 SEM image of AVM@Zein

2.6 緩釋性能分析

Zein粒子在不同條件下釋放AVM的曲線如圖4所示。不外加酶的Zein粒子(圖中圖例為CK)在前10 h釋放速率較快，累積緩釋率為27%，在這之后釋放速率變慢，在96 h時的累積緩釋率在59%左右。加了胰蛋白酶的Zein粒子在前10 h釋放與CK的差別不大，隨后的階段，釋放速率相對較快，因?yàn)橐鹊鞍酌改芊纸鈀ein。但在此處的分解速率沒有Monteiro等[8]報道的大，可能是緩釋的介質(zhì)不一樣，胰蛋白酶在40%的乙醇溶液里活性不高[9]。緩釋介質(zhì)中加了谷胱甘肽來模擬氧化還原刺激響應(yīng)，此時Zein粒子釋放AVM的速率最快，因?yàn)楣入赘孰目梢云茐倪B接蛋白質(zhì)鏈段的二硫鍵[10]，使Zein粒子破裂，最終在15 h時到達(dá)一個“平臺期”，Zein粒子具有明顯的氧化還原刺激響應(yīng)。

圖3 AVM在不同條件下的釋放曲線圖Fig.3 Release curves of AVM under different conditions

2.7 抗紫外性能

AVM在紫外線照射下容易分解，原藥在5 min內(nèi)殘留率就降到50%以下，持續(xù)照射140 min后殘留率僅2%。商業(yè)乳油比AVM原藥的抗紫外線性能好，可能是表面活性劑膠束對紫外線的阻隔和特殊紫外線保護(hù)助劑的加入，最終的殘留率有14%。沾在Zein粒子外部的AVM容易分解，故AVM殘留率曲線斜率在10 min內(nèi)比較大。Zein在紫外線的照射下會將疏水基團(tuán)暴露在溶液中，產(chǎn)生的疏水作用力會引起聚集，增加物理屏障作用；同時粒子內(nèi)部發(fā)生重組，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)更加緊密[11]，使AVM的釋放更慢，所以殘留率曲線10 min后變得平緩。最終殘留率23%，比商業(yè)乳液高，能較好地防止AVM的降解。

圖4 AVM@Zein中AVM的光降解曲線Fig.4 Photodegradation curve of AVM in AVM@Zein

2.8 葉面潤濕性能

水、商業(yè)乳油、Zein粒子水分散液在黃瓜上的接觸角如圖5所示，水在黃瓜葉片上的接觸角為(92.64±1.64)°，商業(yè)乳油和Zein粒子水分散液的接觸角分別為(61.63±0.32)°和(81.50±0.83)°。液滴接觸角越小越容易在植物葉面分布，商業(yè)乳油在黃瓜葉面的接觸角較小，因?yàn)槠渲泻袧舛容^高的油脂和特殊潤濕劑，與葉面有較好的親和性。Zein粒子水分散液的接觸角介于水和商業(yè)乳油之間，也有一定的鋪展作用。

圖5 AVM@Zein的接觸角圖Fig.5 Contact angle of AVM@Zein

圖6 水、商業(yè)乳油、AVM@Zein粒子在黃瓜葉和包菜面的 滯留量Fig.6 Retention of water, commercial EC, and AVM@Zein particles in cucumber leaves and cabbage noodles

農(nóng)藥噴施后在葉面滯留的藥量對其利用率影響很大。水、商業(yè)乳油和AVM@Zein在黃瓜葉面和包菜葉面滯留情況如圖6所示。水在黃瓜葉面和包菜葉面的滯留量相差不大，商業(yè)乳油在潤濕劑的作用下能較好地潤濕葉面，故其滯留量比水大。包菜葉面屬于疏水葉面，而黃瓜葉屬于弱親水葉面，且黃瓜葉面存在的絨毛起到阻礙液滴滑落的作用，所以在黃瓜葉面上的滯留量更大[12]。AVM@Zein的疏水基團(tuán)較多與葉面的蠟質(zhì)層等有疏水作用力，能滯留更多的藥物在葉面上，說明AVM@Zein比商業(yè)乳油的滯留性能好。

2.9 殺蟲活性

不同樣品的毒力活性如表5所示，原藥、商業(yè)乳油和AVM@Zein的半致死濃度分別為3.39、0.12、0.66 mg/L。商業(yè)乳油和AVM@Zein表現(xiàn)出更好的殺蟲活性，阿維菌素既有胃毒作用又有觸殺作用，因?yàn)檫@兩者在葉面的潤濕性好使AVM與小菜蛾接觸的比表面積大。AVM@Zein被害蟲攝入后，蛋白鏈段之間的二硫鍵被體內(nèi)的谷胱甘肽分解，釋放藥物，達(dá)到更好的殺蟲效果[13]。

表5 毒力測試結(jié)果Table 5 Virulence test results

3 結(jié) 論

通過反溶劑法制備Zein負(fù)載阿維菌素納米粒子，通過混合溶劑與水不同的體積比、不同Zein質(zhì)量、不同乙醇濃度的單因素試驗(yàn)，得出最小載藥粒子的動態(tài)光散射粒徑為83.72 nm； AVM@Zein對AVM有保護(hù)作用，經(jīng)過140 min紫外線照射后殘留率為23%比未包封的AVM高10倍； AVM的釋放具有氧化還原和酶刺激響應(yīng)性；AVM@Zein的殺蟲活性明顯高于原藥。