鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ的結構特性及分離檢測研究進展

虞誠瀟，陳健樂，2，葉興乾，2，陳士國，2*

(1 浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，智能食品加工技術與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江大學馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058；2 浙江大學 寧波研究院，浙江 寧波 315100)

果膠是一類廣泛存在于高等植物細胞初生壁和細胞中間片層的雜多糖[1]，1825年由法國藥劑師Bracennot從胡蘿卜中首次提取得到，并被命名為“pectin”。隨著對果膠結構的深入研究，同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(rhamnogalacturonan Ⅰ，RG-Ⅰ)、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(rhamnogalacturonan Ⅱ，RG-Ⅱ)、木糖聚半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan，XG)等不同結構域陸續(xù)出現(xiàn)[2]。其中，RG-Ⅰ的概念于1980年出現(xiàn)，用于描述果膠聚合物中富含鼠李糖的部分[3]。之后Komalavilas等獲得了大量重復的→2)-α-L-鼠李糖-(1→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→ 結構雙糖，表明包含鼠李糖半乳糖醛酸主鏈的二糖具有相當嚴格的重復序列[4]，首次證明了RG-Ⅰ的主鏈由以α-1,4糖苷鍵相連的鼠李糖和半乳糖醛酸構成。

RG-Ⅰ果膠多糖廣泛存在于日常飲食中，是人體腸道菌群的主要能量來源，具有多種生物學活性，如改善慢性代謝綜合征等。然而，以往研究對RG-Ⅰ的重視程度不足，甚至會刻意在提取過程中排除凝膠性弱的RG-Ⅰ組分，致使RG-Ⅰ在概念、提取、分離純化、檢測等方面不夠完善，存在諸多欠缺。迄今為止，RG-Ⅰ仍沒有統(tǒng)一的概念，例如半乳聚糖和阿拉伯聚糖是否屬于RG-Ⅰ仍存在質(zhì)疑，而概念模糊又導致RG-Ⅰ的提取和分離純化受到不同程度的影響。雖然RG-Ⅰ的活性已經(jīng)受到關注[5]，卻普遍存在RG-Ⅰ精細結構不清晰、構效關系不明確的問題，繼而對RG-Ⅰ的檢測和結構解析手段提出了新挑戰(zhàn)(圖1)?；诖?，本文對RG-Ⅰ果膠多糖的概念、分子結構、生物活性、提取純化以及檢測方法進行了系統(tǒng)歸納和總結，旨在為RG-Ⅰ果膠多糖的深化研究和后續(xù)開發(fā)應用提供基礎資料。

圖1 RG-Ⅰ果膠多糖在概念、分離純化、生物活性和檢測手段方面存在的問題Fig.1 Problems existed in concept, separation and purification, biological activity and detection methods of RG-Ⅰ

1 RG-Ⅰ果膠多糖的分子結構及生物活性

RG-Ⅰ果膠多糖的結構-功能活性關系是果膠研究的前沿與熱點。當前，部分研究中對RG-Ⅰ的概念和結構仍不清晰，阻礙了對RG-Ⅰ精細結構及其結構-功能活性關系的研究。因此，本章主要介紹RG-Ⅰ果膠多糖的概念、分子結構和生物活性。

1.1 RG-Ⅰ果膠多糖的概念

RG-Ⅰ最初是在懸浮培養(yǎng)的梧桐細胞壁中提取得到的一種果膠樣多糖，其主鏈由2-L-鼠李糖和4-D-半乳糖醛酸殘基依次相連構成，顯著區(qū)別于傳統(tǒng)結構，因此被命名為RG-Ⅰ[3]。十余年后，RG-Ⅰ的概念開始和多聚半乳糖醛酸聚糖(polygalacturonic acid，PGA)成對出現(xiàn)，推測PGA、RG-Ⅰ可能是構成果膠的主要結構域[6-7]；其中，RG-Ⅰ是主鏈由鼠李糖和半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵依次相連的酸性果膠樣多糖，其鼠李糖殘基可連接中性糖側(cè)鏈[6]。此概念至今仍是RG-Ⅰ的主流定義。Yapo認為RG-Ⅰ骨架由重復的雙糖基→2)-α-L-鼠李糖-(1→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→結構組成，在鼠李糖的O-4或O-3位可連接(1→5)-α-L-阿拉伯聚糖、(1→4)-β-D-半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖Ⅰ和阿拉伯半乳聚糖Ⅱ[8]。由上述RG-Ⅰ的概念描述可以看出，(1→5)-α-L-阿拉伯聚糖、(1→4)-β-D-半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖Ⅰ和阿拉伯半乳聚糖Ⅱ等應該被納入RG-Ⅰ結構域。除基于RG-Ⅰ果膠多糖結構對其概念進行定義外，RG-Ⅰ還被定義為一種主要的植物初生細胞壁中的果膠樣成分[9]、果膠中由鼠李糖醛酸聚糖組成的高度鼠李糖化的“多毛”區(qū)域[10]等。

1.2 RG-Ⅰ果膠多糖的分子結構

RG-Ⅰ是果膠的主要結構域之一，一般認為和HG、RG-Ⅱ等共同構成果膠的主體，在果膠多糖中占比為20%～35%[11]。果膠多糖的主要結構及RG-Ⅰ的主要結構分別如圖2、圖3所示。RG-Ⅰ的結構特征主要體現(xiàn)在2個方面：(1)主鏈含有鼠李糖，由鼠李糖和半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵依次相連，而其余結構域中均無鼠李糖存在。(2)鼠李糖殘基上可連接中性糖側(cè)鏈，絕大部分側(cè)鏈由半乳糖或阿拉伯糖構成;而構成RG-Ⅱ側(cè)鏈的單糖種類遠多于RG-Ⅰ側(cè)鏈，包括阿拉伯糖、半乳糖、巖藻糖、芹菜糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等[12]。研究表明RG-Ⅰ的聚合度大約為2 000，約有一半的鼠李糖殘基在O-4位上連接有側(cè)鏈，目前共發(fā)現(xiàn)有7種直接與鼠李糖

圖2 果膠多糖結構示意圖Fig.2 Schematic structure of the pectin polysaccharide注：參考自文獻[12]。網(wǎng)絡版為彩圖。

圖3 RG-Ⅰ果膠多糖結構示意圖Fig.3 Schematic structure of RG-Ⅰ pectic polysaccharide注：網(wǎng)絡版為彩圖。

O-4位相連的糖殘基，分別為5-L-阿拉伯糖、T-D-半乳糖、3-D-半乳糖、4-D-半乳糖、6-D-半乳糖、3,6-D-半乳糖和2,6-D-半乳糖[13]，揭示了RG-Ⅰ側(cè)鏈的復雜性，同時也說明RG-Ⅰ側(cè)鏈主要由阿拉伯糖和半乳糖構成。以上結構信息為RG-Ⅰ的后續(xù)含量檢測提供了理論依據(jù)。

1.3 RG-Ⅰ果膠多糖的生物活性

RG-Ⅰ果膠多糖廣泛存在于日常膳食的果蔬中，已被證實具有多種生物活性，如控糖、抗炎、提高免疫力、腸道益生等(表1)。Sun等發(fā)現(xiàn)口服10 mg/kg的人參RG-Ⅰ多糖可有效降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的血糖，增加胰島素水平和肝糖原生成[14]。秋葵RG-Ⅰ果膠能夠顯著降低血糖水平和葡萄糖耐量[15]。在改善高血脂方面，RG-Ⅰ通過減少肝臟脂肪堆積、改善脂肪酸代謝、促進丁酸鹽產(chǎn)生、促進白色脂肪棕色化等途徑降低血脂水平[16-18]。在改善肥胖方面，Zhu等指出RG-Ⅰ果膠可以通過逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的腸道菌群失衡、促進白色脂肪棕色化而改善肥胖，其效果優(yōu)于HG果膠，并推測了上述過程的構效機制：HG 果膠結構單一，在盲腸處會快速發(fā)酵導致盲腸腸道菌群紊亂，而結腸處菌群缺少必要的發(fā)酵底物致使菌群失衡，RG-Ⅰ果膠中性糖含量豐富，能充分刺激益生菌的生長[19]。在改善結腸炎方面，RG-Ⅰ的中性糖側(cè)鏈是改善腸道炎癥的關鍵結構，其可能的機制是中性糖能夠更有效地結合Toll樣受體，從而下調(diào)各種促炎因子的分泌；此外，RG-Ⅰ果膠還可以增強腸緊密連接蛋白的表達[20]。

表1 RG-Ⅰ果膠多糖的生物活性Tab.1 The bioactivities of RG-Ⅰ pectic polysaccharide

2 RG-Ⅰ果膠多糖的提取及分離純化

RG-Ⅰ果膠多糖提取是研究其結構和活性的基礎，相較于HG，RG-Ⅰ的占比及結構穩(wěn)定性受果膠來源和提取方法的影響更大，需要針對不同提取原料設計適宜的提取方法。此外，RG-Ⅰ粗多糖的快速分離純化對RG-Ⅰ的精細結構解析也至關重要。下面重點介紹現(xiàn)有的RG-Ⅰ果膠多糖提取和分離純化方法。

2.1 RG-Ⅰ果膠多糖的提取

果膠最常見的提取方法是高溫酸法，但長時間的加熱和酸環(huán)境會促進HG主鏈降解，導致果膠品質(zhì)下降及RG-Ⅰ側(cè)鏈丟失。這是因為在強酸(pH<2)、高溫(65 ℃以上)條件下，GalA-Rha比GalA-GalA的穩(wěn)定性弱，Ara、Gal、Rha等中性糖也呈現(xiàn)出酸不穩(wěn)定性?；谏鲜鲈?，有機酸、螯合劑、低濃度堿是提取RG-Ⅰ果膠多糖的理想溶劑(表2)。Kurita等在65 ℃條件下使用0.05～1 mol/L的檸檬酸提取柑橘皮中的RG-Ⅰ果膠，發(fā)現(xiàn)0.5 mol/L檸檬酸提取的果膠中RG-Ⅰ比例最高(57.5%)，且所提取RG-Ⅰ果膠的分子量分布范圍很大(50～2 000 kDa)，說明檸檬酸不會降解果膠[31]。與苛刻的高溫酸條件相比，Zhang等采用質(zhì)量分數(shù)為0.6%的NaOH溶液在32 ℃條件下提取柑橘皮中的RG-Ⅰ果膠，獲得了82.5%的RG-Ⅰ組分(酸法提取僅44%)，并發(fā)現(xiàn)提取的RG-Ⅰ果膠側(cè)鏈呈高度分支化[32]，這是由于在稀堿條件下RG-Ⅰ側(cè)鏈的Ara和Gal均穩(wěn)定。強堿環(huán)境不適用于RG-Ⅰ果膠多糖的提取，Ara和Gal側(cè)鏈在強堿作用下會被降解[33]，同時木糖和葡萄糖含量會顯著升高，說明強堿環(huán)境下有半纖維素或纖維素出現(xiàn)[34]。Li等先后采用水、螯合劑、碳酸鈉、1 mol/L KOH、4 mol/L KOH提取番茄細胞壁多糖，發(fā)現(xiàn)在1 mol/L KOH條件下體系中即可出現(xiàn)半纖維素組分[34]。Kostlov等分別采用水、螯合劑、稀鹽酸、不同濃度的堿提取南瓜果膠，發(fā)現(xiàn)各溶劑所提取果膠中RG-Ⅰ的比例由高到低依次為低濃度堿(49.6%)、高濃度堿(39.3%)、水(28%)、稀鹽酸(6.8%)和螯合劑(1.4%)[35]，說明強堿環(huán)境破壞了RG-Ⅰ果膠多糖的結構。

表2 RG-Ⅰ果膠多糖的提取方法Tab.2 The extraction methods of RG-Ⅰ pectic polysaccharide

除傳統(tǒng)溶劑提取，一些新型提取技術如酶輔助、超聲、超高壓等也逐漸被應用于RG-Ⅰ果膠提取，其原理均是加速細胞壁裂解，打斷RG-Ⅰ果膠與蛋白、半纖維素、纖維素之間的連接以釋放RG-Ⅰ。常用于RG-Ⅰ提取的酶包括蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酯酶和內(nèi)聚半乳糖醛酸酶等，酶提取法具有可定向提取高純度RG-Ⅰ、保留完整RG-Ⅰ果膠結構、消除惡劣提取條件等優(yōu)點，但也存在耗時長、低底物濃度等缺點[39]。超聲提取RG-Ⅰ果膠時，在溶液中施加的負壓超過拉伸強度后，氣泡會形成、生長直到坍塌，產(chǎn)生“空化”效應，有助于溶劑破壞細胞壁進入細胞，從而釋放果膠[40]。但超聲處理會嚴重影響RG-Ⅰ果膠的結構，甚至會導致RG-Ⅰ果膠降解[41]。超高壓提取技術因耗時短、環(huán)境友好、得率高等優(yōu)點，也逐漸被應用于RG-Ⅰ果膠提取。在超高壓提取的第一階段，外部壓力迅速上升，會加速細胞壁破裂和溶液滲透；在第二階段維持高壓，便于提高回收率；在第三階段急劇泄壓，致使細胞壁趨于膨脹，一些非共價鍵被破壞，易于RG-Ⅰ果膠提取[42]。超高壓提取會使RG-Ⅰ果膠的分子量、酯化度、中性糖側(cè)鏈量有不同程度的下降[2]。

2.2 RG-Ⅰ果膠多糖的分離純化

果膠的分離純化方法有沉淀法、鹽析法和柱層析法，其中陰離子交換層析分級是最常用的方法。果膠的分離純化一般使用陰離子交換填料柱分離系統(tǒng)(按帶電量進行分離)，包括 DEAE 或 Q(季銨型)填料[43]。果膠是酸性糖，當體系的pH值高于其等電點(3.38)時，果膠帶負電，其攜帶的酸性基團越多吸附能力越強，通過不斷增加洗脫液的離子強度，可將吸附的多糖從低電荷到高電荷梯度洗脫。Li等利用DEAE-纖維素柱分離柑橘罐頭加工水中的果膠，其通過0～0.3 mol/L的氯化鈉洗脫液獲取了中性糖組分和酸性糖組分，但二者的分子量分布非常寬，無法進行下一步的凝膠柱分離[44]。果膠經(jīng)過陰離子交換層析分級后只是根據(jù)帶電量分成了若干組分，還需要利用凝膠柱進行后續(xù)分離純化。凝膠層析的原理是大分子無法通過凝膠孔狀結構而先于小分子析出凝膠柱，從而實現(xiàn)基于分子量對多糖的分離。Zhang等先采用DEAE-纖維素柱分離得到5種柑橘果膠餾分，再對4種酸性餾分進行后續(xù)Sepharose CL-6B柱分離，繼而獲得了8種分子量相對均一的餾分[45]。

3 RG-Ⅰ果膠多糖的檢測

RG-Ⅰ果膠多糖的結構分析和活性探究需要多種檢測方法支撐。目前，RG-Ⅰ果膠多糖的檢測方法主要有單糖法、核磁法、質(zhì)譜法和抗體法，4種方法分別存在各自的短板：單糖法不適用于阿拉伯聚糖或半乳聚糖，核磁法解析困難，質(zhì)譜法需要先將RG-Ⅰ降解成寡糖，抗體法成本高。上述弊端導致目前缺少檢測RG-Ⅰ果膠多糖的標準方法。下面對4種現(xiàn)有RG-Ⅰ檢測方法的原理及其應用進行綜述。

3.1 基于單糖組成的RG-Ⅰ檢測方法

3.1.1 檢測原理

在單糖組成方面，相比于HG，RG-Ⅰ增加了主鏈特有的鼠李糖及側(cè)鏈獨有的阿拉伯糖和半乳糖中性糖(無糖醛酸結構的單糖)。目前，僅發(fā)現(xiàn)有7種可以直接與鼠李糖O-4位相連的糖殘基，且認為RG-Ⅰ側(cè)鏈只有阿拉伯糖、半乳糖2種單糖，在忽略RG-Ⅱ存在的情況下，可近似認為n(RG-Ⅰ)=2n(Rha)+n(Ara)+n(Gal)。但當半乳聚糖或阿拉伯聚糖存在時，運用上述公式可能會出現(xiàn)RG-Ⅰ比例超過100%的情況，這也是單糖法存在的主要問題。表3總結了近年來依據(jù)上述公式計算RG-Ⅰ含量的文獻。鑒于RG-Ⅰ、HG在單糖組成上的差異，也有文獻使用n(GalA)/n(Rha)表征果膠多糖中RG-Ⅰ和HG的比例[46]，使用n(Ara+Gal)/n(Rha)表征RG-Ⅰ的側(cè)鏈程度，使用n(Rha)/n(Ara+Gal)表征RG-Ⅰ的支鏈程度[19]。

表3 基于單糖組成的RG-Ⅰ檢測Tab.3 RG-Ⅰ detection based on monosaccharide composition

3.1.2 單糖法在RG-Ⅰ檢測方面的應用

現(xiàn)有基于單糖組成的RG-Ⅰ測定方法很多，主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效陰離子交換色譜法(HPAEC)等。GC法面臨的主要問題是：糖揮發(fā)性弱，需要適當?shù)囊阴；⒐柰榛蚣谆M行衍生以增強揮發(fā)性，且不同單糖的衍生效果不同。目前研究者已致力于簡化衍生步驟、增加衍生物回收率、穩(wěn)定衍生物、減少雜峰出現(xiàn)等研究[61]。Msakni 等利用三甲基氯硅烷將冰葉日中花葉多糖硅烷化，測定了Ara、Rha、Gal 3個中性糖的含量，結合間羥基聯(lián)苯法測得的GalA含量，計算出RG-Ⅰ占比為33.7%～39%[47]。HPLC法的主要問題是：多種單糖的性質(zhì)類似且在紫外下缺乏足夠區(qū)分的特征官能團，導致紫外檢測器不能進行單糖的直接測定。目前，解決這一問題的常用方法是對單糖進行柱前衍生，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)是最常用的單糖衍生劑[62]。Zheng等采用三氟乙酸水解聯(lián)合PMP衍生及HPLC法測定了柑橘罐頭水中果膠的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其富含阿拉伯糖(43.27%)，RG-Ⅰ占比達62.70%[57]。HPAEC法能夠?qū)⒅行蕴呛吞侨┧嵋匝蹶庪x子的形式分開，無需對樣品進行柱前衍生， 這在很大程度上減少了單糖的檢測步驟和時間，但HPAEC法一直存在鼠李糖和阿拉伯糖峰重疊、木糖和甘露糖峰重疊的問題[63]。該問題的解決方法是先對柱子進行強NaOH加載以分離鼠李糖和阿拉伯糖，再降低NaOH濃度以分離木糖和甘露糖。Ahmadi等通過先用18 mmol/L NaOH洗脫柱子15 min，再用18 mmol/L NaOH聯(lián)合100 mmol/L乙酸鈉洗脫的方式，測定出樹莓和枸杞果膠中RG-Ⅰ的占比為34.5%～86.9%[26]。

3.2 基于核磁共振技術(NMR)的RG-Ⅰ檢測方法

3.2.1 檢測原理

1H NMR可以提供異頭氫信息，確定糖苷鍵的α或β類型，但RG-Ⅰ結構復雜，致使1H NMR在3.0～5.0相對化學位移的信號嚴重重疊，糖苷鍵類型無法被區(qū)分。13C NMR可以提供異頭碳信息，確定某些特定基團，但RG-Ⅰ分子量大、溶解度低，在進行13C NMR測試時需要高磁場、高耗時以獲取強信號。RG-Ⅰ區(qū)別于HG的主要結構是主鏈的→2)-α-L-鼠李糖-(1→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→結構以及側(cè)鏈的→5)-α-阿拉伯糖-(1→、→3,5)-α-阿拉伯糖-(1→、→4)-β-半乳糖-(1→等結構，因此從糖苷鍵的種類可以區(qū)分RG-Ⅰ與HG，此時需要二維核磁來確定果膠的糖苷鍵。1H -1H COSY譜是定性證明核之間耦合常數(shù)存在的有效方法。當存在廣泛的二階耦合時，采用TOCSY譜進行補充和驗證；NOESY譜可提供糖苷鍵的連接順序；HSQC譜可給出直接相連的碳氫關系信息；HMBC譜可將1H核與遠程耦合的13C核關聯(lián)，提供分子骨架結構信息。NMR可用于RG-Ⅰ果膠的精細結構解析，其在分析單糖組成的同時也可獲得鏈構型、糖苷鍵等信息。NMR在使用中通常需要結合單糖組成信息及降解、甲基化等輔助手段，所需樣品純度高且數(shù)據(jù)采集和分析步驟繁瑣，一般不適用于快速的RG-Ⅰ檢測和定量。

3.2.2 核磁共振技術在RG-Ⅰ檢測方面的應用

相比于傳統(tǒng)的糖分析方法，如HPLC、LC-MS、GC-MS等，NMR具有穿透性強、適用性廣、非破壞性等優(yōu)點，已被廣泛應用于RG-Ⅰ果膠多糖的結構解析。Yao等對RG-Ⅰ果膠在NMR中常見信號峰的化學位移進行了綜述[64]。Zhang等通過對采用酸法、堿法提取的果膠進行1H NMR檢測，發(fā)現(xiàn)采用堿法提取的果膠在5.10～5.20相對化學位移內(nèi)出現(xiàn)了3種不同的阿拉伯糖，另有歸屬于半乳糖的信號峰出現(xiàn)，提示堿法提取果膠的RG-Ⅰ側(cè)鏈構型比酸法提取果膠更復雜，且RG-Ⅰ含量高于酸法提取果膠[32]。Zheng等在使用α-1,5-阿拉伯糖酶去除柑橘果膠中的阿拉伯糖側(cè)鏈后，利用1H NMR對果膠樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)酶切后果膠中阿拉伯糖的信號峰強度減弱，而其余單糖的信號峰強度沒有明顯改變[57]。Dourado等對杜仲多糖進行了COSY、HSQC、HMBC譜測定，推測杜仲多糖為一種阿拉伯聚糖樣果膠，其中，n(T-阿拉伯糖)∶n(1,5-阿拉伯糖)∶n(1,3,5-阿拉伯糖)∶n(1,2,3,5-阿拉伯糖)=3∶2∶1∶1[65]。Shen等對楤木葉果膠多糖進行了DEPT、HSQC、HMBC、COSY、NOESY和TOCSY譜測定，推測楤木葉果膠的主鏈由RG-Ⅰ和HG構成且n(RG-Ⅰ)∶n(HG)=1∶1，而RG-Ⅰ側(cè)鏈由直鏈阿拉伯聚糖和帶有阿拉伯糖的半乳聚糖構成，側(cè)鏈中有54.1%的鼠李糖殘基[66]。

3.3 基于質(zhì)譜技術的RG-Ⅰ檢測方法

3.3.1 檢測原理

質(zhì)譜法能夠先將樣品轉(zhuǎn)化為運動的氣態(tài)離子，再按質(zhì)荷比大小進行樣品分離并記錄樣品信息。一級質(zhì)譜可以提供果膠寡糖的分子量信息，串聯(lián)質(zhì)譜可以測定果膠寡糖的糖苷鍵、糖基化位置、連接順序等信息?；谫|(zhì)譜技術對果膠多糖進行分析需要先獲得大分子果膠的寡糖片段，找到可能的結構片段以排除替代物。根據(jù)質(zhì)譜高級斷裂中不同斷裂碎片與糖苷鍵之間的關系，能夠推測出果膠寡糖中不同糖殘基的糖苷鍵。GalA寡糖的一般裂解模式已經(jīng)被測定，其在MALDI-PSD-TOF-MS正模式下可以給出Bi-、Ci-、Yi-系列，在ESI-IT-MS/MS負模式下主要產(chǎn)生C、Z系列離子，這使得甲基酯化可以被定位，并允許對聚合度小于10的部分甲基酯化低聚半乳糖進行測序。

3.3.2 質(zhì)譜在RG-Ⅰ檢測方面的應用

Schols等早在1994年就對蘋果來源的RG-Ⅰ寡糖進行了HPAEC-MS分析，測定出(Rha)2-(GalA)2、(Rha)2-(Gal)1-(GalA)2、(Rha)2-(Gal)2-(GalA)2、(Rha)3-(GalA)3、(Rha)3-(Gal)2-(GalA)3、(Rha)3-(Gal)3-(GalA)3等不同寡糖結構[67]。一級質(zhì)譜(MS)存在無法準確測定半乳糖殘基連接方式的問題，二級質(zhì)譜(MS/MS)的應用彌補了一級質(zhì)譜對半乳糖殘基測定的局限性。Coenen等通過二級質(zhì)譜測定出蘋果的RG-Ⅰ寡糖結構為(Rha)2-(Gal)3-(GalA)2，其中半乳糖醛酸還原端的第一個鼠李糖連接二聚半乳糖，第二個鼠李糖連接單體半乳糖[68]。當前已有研究利用MSn對含有阿魏酸的阿拉伯寡糖和半乳糖寡糖進行結構鑒定。Quéméner等采用帶有離子阱或四級飛行時間質(zhì)譜的電噴霧電離質(zhì)譜分析對比了2-O-反式阿魏?；?L-阿拉伯吡喃糖、5-O-反式阿魏?；?L-阿拉伯呋喃糖、O-(2-O-反式阿魏酰基-L-阿拉伯呋喃?；?-1,5-L-阿拉伯呋喃糖、O-(反式阿魏酰基-D-半乳吡喃基)-1,4-D-半乳吡喃糖之間的差異，發(fā)現(xiàn)四級飛行時間質(zhì)譜的酯鍵斷裂離子更豐富，推測阿魏?；B接在阿拉伯糖殘基的O-2、O-5位或半乳糖殘基的O-6位[69]。

雖然質(zhì)譜法在解析RG-Ⅰ果膠多糖時具有所需樣品量少、允許以混合物形式檢測、能夠提供RG-Ⅰ序列信息等優(yōu)點，但樣品測定前需要先經(jīng)過酶解、化學降解等途徑獲得大分子果膠的寡糖片段。采用酶解方式獲取RG-Ⅰ寡糖碎片時需要利用多種酶進行順序降解，所需酶濃度高且降解不徹底。針對該問題，已有研究采用化學降解法破壞糖苷鍵來降解多糖，如利用受控的氧化反應產(chǎn)生自由基，此方法成本低、降解徹底，不會對糖單元造成明顯的結構改變[46]，但如何使用質(zhì)譜進行后續(xù)檢測仍有待深入探索。

3.4 基于單克隆抗體的RG-Ⅰ檢測方法

3.4.1 檢測原理

RG-Ⅰ在1980年代曾被用于產(chǎn)生多克隆抗體血清，研究人員將純RG-Ⅰ果膠與甲基化的牛血清白蛋白混合皮下注射到兔體內(nèi)，反復刺激12周后獲得了抗RG-Ⅰ抗體，雖然滴度很低(10)，仍證明RG-Ⅰ結構具有免疫原性，抗體與特定RG-Ⅰ表位的特異性結合過程屬于血清學反應[70]。1990年代，Puhlmann等將懸浮培養(yǎng)的懸鈴木細胞壁RG-Ⅰ果膠多糖和牛血清蛋白腹腔注射到小鼠體內(nèi)，首次得到了穩(wěn)定、能分泌抗RG-Ⅰ的雜交瘤細胞系，并獲得了抗RG-Ⅰ結構的抗體CCRC-M1，發(fā)現(xiàn)α-1,2連接的末端巖藻糖基是CCRC-M1識別RG-Ⅰ表位的關鍵結構，但配體競爭實驗表明CCRC-M1與1種半纖維素多糖的結合也非常緊密，說明CCRC-M1并非特異性識別RG-Ⅰ結構域[71]。后續(xù)研究人員經(jīng)過不斷改進，逐漸形成了2類抗RG-Ⅰ抗體，分別為特異性識別半乳聚糖側(cè)鏈和阿拉伯聚糖側(cè)鏈的抗體(表4)。2類抗體的制備方法大同小異。Jones等在1997年將番茄RG-Ⅰ多糖和甲基化的牛血清白蛋白混合注射到大鼠體內(nèi)，將脾臟淋巴細胞與IR983大鼠骨髓瘤細胞融合，雜交瘤細胞分泌LM5抗體[72]。LM5識別(1→4)-β-D-半乳聚糖中線性四糖的非還原端，與(1→3)-β-D-半乳聚糖或(1→6)-β-D-半乳聚糖無交叉反應[73]；LM26識別(1→4)-β-D-半乳聚糖中的(1-6)-半乳糖基取代，且不識別線性(1→4)-β-D-半乳聚糖[74]；LM6識別(1→5)-α-L-阿拉伯聚糖中的線性五糖，但并非特異性識別，且與阿拉伯樹膠無反應[75]；LM16識別與阿拉伯糖相關的表位，可通過阿拉伯呋喃糖苷酶的作用及阿拉伯糖基殘基的丟失產(chǎn)生，LM16結合對半乳糖苷酶作用敏感，表位可能涉及RG主鏈上的半乳糖殘基[76]；LM9識別阿魏?；?1→4)-β-D-半乳聚糖，該表位是莧菜科和藜科植物果膠的特征結構，與其他聚合物無反應[77]；LM13識別(1→5)-α-L-阿拉伯聚糖中的線性表位，該抗體與果膠阿拉伯糖的1個特定亞群結合，與1,5-連接的阿拉伯糖基殘基的更長片段結合，這些殘基在未分支的阿拉伯糖中可能更豐富[78]。

表4 與RG-Ⅰ特異性結合的單克隆抗體Tab.4 Monoclonal antibodies specifically binding to RG-Ⅰ

3.4.2 單克隆抗體在RG-Ⅰ檢測方面的應用

抗體檢測可在不破壞細胞壁的情況下檢測細胞壁中的RG-Ⅰ含量和分布，是一種原位可視化分析技術，多用于植物生理學領域[79]。目前用抗體檢測法定量RG-Ⅰ 的研究較少。Yu等對分離得到的2種富含RG-Ⅰ的人參根多糖組分進行了LM16結合能力測定，發(fā)現(xiàn)RG-Ⅰ能響應LM16，但是人參根細胞壁中普遍存在多糖表位掩蔽現(xiàn)象，導致與LM16的結合能力減弱[80]。Leszczuk等采用免疫組織化學技術和免疫金標記技術，結合LM16抗體，定量分析了阿拉伯聚糖在細胞壁-質(zhì)膜中的分布[81]。Torode等發(fā)現(xiàn)LM26可以與擬南芥、芒屬、甜菜等植物的韌皮部結合，可識別β-1,6-半乳糖基取代的β-1,4-半乳聚糖，通常需要3個以上主鏈殘基進行優(yōu)化識別；該分支半乳聚糖結構已經(jīng)在大蒜鱗莖中發(fā)現(xiàn)，且大蒜鱗莖細胞壁已被用于確認LM26表位與細胞壁果膠鼠李糖乳糖醛酸Ⅰ之間的關聯(lián)[74]。Rongkaumpan等分別利用LM5、LM26、LM6-M、LM13、LM16抗體定量了香蕉、芒果細胞壁及提取的細胞壁多糖中的半乳聚糖、支鏈半乳聚糖、阿拉伯聚糖、直鏈阿拉伯聚糖含量[82]。

4 結語與展望

RG-Ⅰ果膠多糖結構高度復雜，在傳統(tǒng)果膠制備工藝中往往被酸去除，其結構和功能的研究程度遠低于傳統(tǒng)HG果膠，學界當前對RG-Ⅰ果膠多糖的界定及檢測方法仍不清晰。本文系統(tǒng)綜述了RG-Ⅰ果膠多糖的概念、分子結構、生物活性、提取純化及檢測方法，其重點關注內(nèi)容及相應的RG-Ⅰ未來發(fā)展方向可參考以下幾個方面。

在RG-Ⅰ界定方面，總結指出RG-Ⅰ是一類主鏈由鼠李糖和半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵依次相連的酸性果膠樣多糖，其鼠李糖殘基可連接中性糖側(cè)鏈。后續(xù)研究應進一步明確RG-Ⅰ果膠多糖的定義，將阿拉伯糖側(cè)鏈、半乳糖側(cè)鏈等納入RG-Ⅰ結構域。

在RG-Ⅰ提取純化方面，RG-Ⅰ的提取方法較多，包括酸堿提取、酶法提取及超聲、微波、超高壓輔助提取等，當前應用最廣泛的為堿提取法，該方法操作簡單，RG-Ⅰ提取量高。果膠的分離純化研究較少，當前多利用陰離子交換填料進行純化，少量采用凝膠柱進行純化。未來可探索針對RG-Ⅰ的提取純化方法以服務RG-Ⅰ研究。偏堿性條件的順序提取可能是RG-Ⅰ的理想提取方法，而陰離子交換層析分級結合凝膠柱層析法可獲得不同電荷、不同分子量的RG-Ⅰ組分，可能是RG-Ⅰ的理想分離純化方法。

在RG-Ⅰ檢測方面，單糖法操作簡單、成本低、檢測方式多樣、重復性好、適用性廣，但存在如下問題：(1)鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖并不只存在于RG-Ⅰ中，RG-Ⅱ中也可能存在，檢測中無法排除RG-Ⅱ的干擾；(2)阿拉伯聚糖和半乳聚糖的存在使RG-Ⅰ的測定含量偏高；(3)不同多糖無法采用統(tǒng)一的水解條件，水解過程中可能降解不完全或過度降解。NMR法操作簡單、不破壞糖結構，但成本高、分析難、需結合糖的基本信息進行解析。質(zhì)譜法可測得RG-Ⅰ的精確結構，但需要先將RG-Ⅰ多糖降解為寡糖，目前仍沒有直接采用質(zhì)譜技術精確計算RG-Ⅰ含量的報道?？贵w法對RG-Ⅰ結構的針對性強，可在細胞壁中完成RG-Ⅰ含量、分布的可視化分析，但也存在如下問題：(1)成本高，不利于大規(guī)模檢測；(2)操作復雜且重復性差；(3)目前無針對鼠李糖的檢測抗體。未來可考慮建立RG-Ⅰ果膠的系統(tǒng)檢測方法，主要檢測依據(jù)為單糖組成，同時結合核磁、質(zhì)譜、抗體等手段進行輔助驗證?；贒NA雜交的探針型芯片技術可能是今后RG-Ⅰ結構檢測的努力方向。