Collybistin對神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控作用

韋 佳，丁韶麗，高學(xué)明，張雅敏，吳樹金，孫延慶

(1.甘肅省人民醫(yī)院功能科，2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

神經(jīng)病理性疼痛在普通人群中的發(fā)病率為10%左右，其特點(diǎn)是反復(fù)、持續(xù)發(fā)作[1]。迄今，傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥物治療效果很差、副作用大。資料顯示，外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變都可引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛，具體表現(xiàn)為痛覺過敏 (hyperalgesia)、痛覺超敏 (allodynia) 和自發(fā)性疼痛等。神經(jīng)病理性疼痛不僅嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量 (食欲、睡眠等)，還會增加精神類疾病的發(fā)生率。然而，目前，誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制仍不清楚。

脊髓背角作為痛覺信息從外周向中樞傳遞的初級整合中樞，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。脊髓背角中的抑制性中間神經(jīng)元在痛覺傳遞中發(fā)揮“剎車”作用，而抑制性受體介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞負(fù)責(zé)其“剎車”作用[2-3]。外周神經(jīng)損傷之后，抑制性突觸傳遞減弱；而提高抑制性突觸傳遞，則能夠緩解痛敏癥狀[3-4]，突觸可塑性參與了痛覺調(diào)控，我們以往的研究表明，抑制小鼠海馬組織ChAT活性，提高ChAT活性、升高ChAT蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)腦內(nèi)乙酰膽堿的合成，可能是增強(qiáng)突觸可塑性的重要機(jī)制之一[5]。Collybistin是一種鳥嘌呤交換因子，與突觸可塑性密切相關(guān)[6-7]，有文獻(xiàn)報(bào)道，collybistin表達(dá)于抑制性突觸傳遞中，與抑制支架蛋白gephyrin相互作用，穩(wěn)定抑制性受體在突觸后的表達(dá)[8-10]。Collybistin可能參與癲癇、焦慮等病理過程的發(fā)生、發(fā)展[8-9]，但是否參與神經(jīng)病理性疼痛，仍不清楚。因此，本研究利用免疫組織化學(xué)、行為學(xué)和電生理等技術(shù)，探究collybistin在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用。這一研究極有可能為神經(jīng)病理性疼痛的預(yù)防、治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級C57BL/6小鼠，♂，6～8周齡，(18～22) g，購買于蘭州大學(xué)動(dòng)物中心。每籠飼養(yǎng)3～5只，自由進(jìn)水、食，控制飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22～26) ℃、相對濕度40%～60%。

1.2 主要試劑shRNA-collybistin和scrambled shRNA購買于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；抗collybistin抗體 (SAB4500963) 和河豚毒素 (tetrodotoxin;TTX) 購買于sigma；CNQX和DAP-5購買于愛必信生物科技有限公司；CY3和Alexa Fluor 488 標(biāo)記的熒光二抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購買于Abcam。

1.3 主要方法

1.3.1坐骨神經(jīng)分支損傷(spared nerve injury,SNI)模型的制備 手術(shù)器械和手術(shù)臺面消毒完成后，腹腔注射戊巴比妥鈉 (45～60 mg·kg-1) 麻醉成年小鼠，乙醚輔助麻醉。剪開皮膚、鈍性分離肌肉，充分暴露坐骨神經(jīng)及其分支 (脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)、腓腸神經(jīng))；玻璃分針慢慢分離腓腸神經(jīng)，結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，并在離結(jié)扎處2 mm的位置將神經(jīng)剪斷；對肌肉和皮膚依次縫合，術(shù)后用碘伏進(jìn)行消毒。對照側(cè)暴露坐骨神經(jīng)，腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)。確保造模成功后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2行為學(xué)測試

1.3.2.150%機(jī)械縮足閾值 (paw withdrawal thresholds,PWTs)檢測 實(shí)驗(yàn)采用“Up-Down”法測試小鼠的機(jī)械縮足閾值。測試前將小鼠放置于底部有鐵絲網(wǎng)的行為籠中，適應(yīng)30 min，待小鼠處于安靜狀態(tài)(停止探索行為及梳理毛發(fā))后。用von Frey纖維垂直刺向小鼠足底掌心區(qū)域，使其彎曲至30°，單次刺激時(shí)間控制在3～5 s，間隔應(yīng)不少于2 min。觀察小鼠的反應(yīng)，若小鼠出現(xiàn)縮足、舔足或甩腿反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)；反之，則記為陰性反應(yīng)。通過以下公式計(jì)算50%縮足閾值 (PWT):50% PWT=10[Xf+Kδ]/10 000。xf為最后一個(gè)使用的Von Frey纖維的力度值，k值查表可得，δ為0.26。

1.3.2.2熱縮足潛伏期 (paw withdrawal latencies;PWLs) 檢測 實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于儀器的透明玻璃板上方，適應(yīng)30 min。測試時(shí)，將熱刺痛儀上的“十”字形標(biāo)記置于小鼠后足足底掌心，記錄從開始照射到小鼠出現(xiàn)縮足回避的時(shí)間，單次測試時(shí)間上限為10 s，以免出現(xiàn)組織損傷。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，求平均值作為小鼠的PWLs，測量間隔為5 min。測試期間及時(shí)清理小鼠在玻璃板上的排泄物，防止其影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染 首先將小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺上，使其背部朝上，穩(wěn)定小鼠脊椎，手持25 μL 微量進(jìn)樣器從小鼠L5～L6棘突間隙進(jìn)針，以空洞感及小鼠甩尾視為針尖到達(dá)蛛網(wǎng)膜下腔處。緩慢推注shRNA，待推注完后，針頭稍作停留緩慢拔出，防止?jié)B出。

1.3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液 (80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，行椎板切開術(shù)，分離L4～L5節(jié)段脊髓，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的蛋白裂解液裂解30 min。離心 (14 000 r·min-1,4 ℃,10 min) 后，取上清，加入4×Sample Buffer，振蕩混勻、煮沸3 min，冷卻上樣。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜。d2,再用相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。最后使用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色 實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液 (80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，暴露心臟，經(jīng)左心室灌流20 mL含肝素鈉生理鹽水，10 mL 4%多聚甲醛。分離小鼠脊髓轉(zhuǎn)移4%多聚甲醛中后固定2 h，再移至30%蔗糖溶液脫水過夜。d2,冰凍切片機(jī) (CM1860,Lecia) 切取厚40 μm的脊髓片。脊髓片轉(zhuǎn)移至包含0.25% Triton X-100和10%山羊血清 (normal goat serum,NGS) 的PBS中封閉過夜。一抗孵育脊髓片24 h。PBS 溶液清洗脊髓片5次，每次20 min。脊髓片與相對應(yīng)的熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS 清洗脊髓片切片 5次，每次20 min。PVP封片液封片，激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.3.6電生理記錄 實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后，行椎板切開術(shù)，分離脊髓快速轉(zhuǎn)移至切片液中。剝離脊髓軟硬脊膜后，利用震動(dòng)切片機(jī)切取厚400 μm的脊髓片。電生理記錄前先將脊髓片置于切片液中室溫孵育至少1 h，持續(xù)通入95% O2和5% CO2恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)。將脊髓片轉(zhuǎn)移至操作臺上，持續(xù)灌流氧飽和的人工腦脊液 (artificial cerebrospinal fluid,ACSF)，以維持細(xì)胞的活性。在顯微鏡下挑選健康的II板層外側(cè)神經(jīng)元，記錄微小抑制性突觸后電流 (miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)，記錄過程中電壓鉗制在0 mv。在ACSF中加入10 μmol·L-1CNQX和50 μmol·L-1DAP-5、以阻斷興奮性突觸傳遞，加入1 mol·L-1TTX、以阻斷鈉通道電流。

2 結(jié)果

2.1 Collybistin表達(dá)于脊髓神經(jīng)元中為了觀察collybistin在脊髓中的表達(dá)情況，我們進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)。Fig 1A顯示，抗Collybistin抗體在小鼠脊髓裂解液中發(fā)現(xiàn)了明顯的信號，說明collybistin分布在脊髓中。利用免疫組織化學(xué)染色，分析collybistin是否分布在脊髓神經(jīng)元中。如Fig 1B所示，神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN與collybistin共染，表明脊髓神經(jīng)元中表達(dá)collybistin。

2.2 外周神經(jīng)損傷減少脊髓collybistin的蛋白表達(dá)為了明確外周神經(jīng)損傷對脊髓collybistin表達(dá)的影響，我們選取成年小鼠，制備坐骨神經(jīng)分支損傷 (spared nerve injury,SNI) 模型，14 d后，進(jìn)行Western blot。行為學(xué)測試結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SNI明顯降低了小鼠的機(jī)械性縮足閾值 (Fig 2A)，說明神經(jīng)病理性疼痛模型成功建立；Western blot結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，SNI明顯降低了脊髓中collybistin的蛋白表達(dá) (Fig 2B)。

Fig 1 Collybistin expressed in spinal cord of mice

2.3 敲低脊髓collybistin的表達(dá)導(dǎo)致痛覺敏化為了探究collybistin在痛覺調(diào)控中的作用，我們首先構(gòu)建了針對collybistin的shRNA (shRNA-collybistin)，通過抑制內(nèi)源性collybistin蛋白的表達(dá)驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，shRNA-collybistin明顯降低了collybistin的蛋白表達(dá)，而scrambled shRNA 組無明顯變化 (Fig 3A)。接著我們進(jìn)行了行為學(xué)測試，如Fig 3B和3C顯示，與scrambled shRNA組相比，鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA-collybistin明顯降低了小鼠的縮足閾值 (paw withdrawal thresholds,PWTs) 和縮足潛伏期 (paw withdrawal latencies;PWLs)，表現(xiàn)出機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。

2.4 脊髓過表達(dá)collybistin緩解痛覺敏化Fig 4結(jié)果顯示，SNI模型小鼠的PWTs和PWLs值明顯降低；與GFP組相比，鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染collybistin能夠明顯提高小鼠的PWTs (Fig 4A) 和PWLs值 (Fig 4B)，說明過表達(dá)collybistin可緩解外周神經(jīng)損傷誘發(fā)的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。

2.5 敲低脊髓collybistin降低抑制性突觸傳遞電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)值相比，collybistin抗體明顯降低脊髓背角神經(jīng)元中的微小抑制性突觸后電流 (miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs) 的幅值和頻率 (Fig 5A)，說明collybistin能夠維持正常的抑制性突觸傳遞。為了再次驗(yàn)證這一現(xiàn)象，我們在小鼠鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA-collybistin后，記錄mIPSCs。結(jié)果顯示，與scrambled shRNA組相比，鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA-collybistin同樣明顯降低了mIPSCs的幅值和頻率 (Fig 5B)。

2.6 過表達(dá)collybistin增強(qiáng)神經(jīng)病理性疼痛小鼠的抑制性突觸傳遞Fig 5表明，collybistin在維持正常的抑制性突觸傳遞中發(fā)揮重要作用，那么我們猜測，過表達(dá)collybistin可緩解外周神經(jīng)損傷對抑制性突觸傳遞的減弱作用。Fig 6結(jié)果顯示，與空白對照組相比，SNI模型組小鼠的mIPSCs的幅值和頻率明顯降低；與SNI模型組相比，過表達(dá)collybistin能夠明顯提高SNI模型組小鼠mIPSCs的幅值和頻率 (Fig 6A)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，collybistin表達(dá)于脊髓神經(jīng)元中，外周神經(jīng)損傷可明顯降低脊髓collybistin的蛋白表達(dá)。結(jié)果提示，collybistin可能在痛覺調(diào)控中發(fā)揮作用。接著，行為學(xué)測試觀察collybistin對小鼠痛行為學(xué)的影響，結(jié)果表明，干擾collybistin可誘發(fā)正常小鼠的痛覺敏化。最后，全細(xì)胞電記錄結(jié)果表明，collybistin在維持正常小鼠的抑制性突觸傳遞中發(fā)揮核心作用。

Fig 2 The reduced expression of collybistin observed after peripheral nerve injure

Fig 3 Knockdown of collybistin in spinal cord of mice induced pain n=6)

Fig 4 Spinal overexpression of collybistin attenuated neuropathic n=6)

文獻(xiàn)報(bào)道，collybistin分布在海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元中，與突觸傳遞以及可塑性密切相關(guān)，參與癲癇、焦慮等神經(jīng)退行性疾病[9,11]。大量資料已經(jīng)證明，脊髓背角是傳遞、整合痛覺信息的初級中樞[12]。我們的研究顯示，collybistin大量表達(dá)在脊髓神經(jīng)元中；神經(jīng)病理性疼痛小鼠脊髓中collybistin的蛋白表達(dá)明顯降低。這一結(jié)果提示，collybistin可能參與痛覺突觸傳遞。然而，collybistin在脊髓中分布的細(xì)胞類型以及是否在外周神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，還需要進(jìn)一步的探究。

Fig 5 Collybistin regulated inhibitory synapse n=6)

Fig 6 Spinal overexpression of collybistin prevented peripheral nerve injury from decreasing inhibitory synaptic transmission. n=6)

在成年哺乳動(dòng)物脊髓中，抑制性突觸傳遞能夠門控外周傷害性信息向腦區(qū)的傳遞[2,3,13]。鞘內(nèi)給予化學(xué)抑制劑阻斷抑制性受體、或利用基因技術(shù)沉默受體，都可誘發(fā)正常小鼠的痛覺中樞敏化[3,14]。最近的研究表明，collybistin可與抑制性突觸支架蛋白gephyrin相互結(jié)合，維持抑制性受體在突觸的聚集。結(jié)果顯示，鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA-collybistin，誘發(fā)正常小鼠的痛覺過敏和痛覺超敏。同時(shí)，我們利用collybistin的特異性抗體、或shRNA-collybistin拮抗細(xì)胞內(nèi)collybistin功能之后，發(fā)現(xiàn)脊髓背角神經(jīng)元中的抑制性突觸傳遞明顯降低。有研究表明，collybistin還可能通過與GABAAR α2亞基和甘氨酸受體α1亞基的相互作用，增加抑制性受體的突觸表達(dá)[9-10]。

當(dāng)小鼠發(fā)生外周神經(jīng)損傷之后，GABAAR和甘氨酸受體介導(dǎo)的抑制性功能受損，表現(xiàn)出痛覺敏化[4,15]。然而，增強(qiáng)抑制性突觸傳遞能夠緩解小鼠的痛敏癥狀[3]。我們發(fā)現(xiàn)，脊髓過表達(dá)collybistin，可明顯緩解外周神經(jīng)損傷誘發(fā)的痛覺敏化。此外，還能恢復(fù)外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致的“去抑制”。

綜上所述，本研究揭示了collybistin在痛覺調(diào)控中的作用，為闡明神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制提供相應(yīng)依據(jù)，這一研究為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新的思路。