犬ELF4基因原核表達及其卵黃抗體的制備

喻嬌，曹馨，唐青海，侯鑫軍，高翠翠，韓濤濤，黎露，劉會敬，唐斯萍

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院/南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室/動物微生物新型檢測技術(shù)及生物制劑衡陽市重點實驗室，湖南衡陽 421008）

0 引言

【研究意義】ELF4（E74-like factor 4）是ETS（E26 transformation specific）家族中的重要成員之一，最早是從人類巨核細胞系中克隆獲得，與人類ELF-1基因在結(jié)構(gòu)上存在一些相似之處，因此早期被命名為骨髓elf-1（E74-like factor 1）樣因子（Myeloid elf-1-like factor，MEF）（You et al.，2013；Szabo and Rajnavolgyi，2014），被認為是X染色體上一個潛在的腫瘤抑制子（Seki et al.，2002）。ELF4參與細胞多種生理或病理的過程，如腫瘤發(fā)生、DNA損傷修復反應、調(diào)控細胞周期和成骨分化（Baek and Baek，2013；Kosti et al.，2020；Sze et al.，2021；Du et al.，2021）。因此，克隆犬ELF4基因（cELF4）并制備抗cELF4蛋白的卵黃抗體，可為該蛋白生物學功能研究提供基礎(chǔ)材料。【前人研究進展】近年來，研究發(fā)現(xiàn)，ELF4在免疫應答方面發(fā)揮著重要功能，其能與血小板因子4（Platlet factor 4，PF4）和豬源干擾素刺激基因（Porcine interferon-stimulating gene）的啟動子相結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄，ELF4能在上皮細胞中上調(diào)溶菌酶基因啟動子的活性和人類β防御素2基因的轉(zhuǎn)錄水平，且能在造血細胞中激活白細胞介素-8（IL-8）（Kai et al.，1999；Lu et al.，2004；Suico et al.，2017）。2013年You等首次發(fā)現(xiàn)ELF4是一種Ⅰ型IFNs轉(zhuǎn)錄因子，并通過直接調(diào)節(jié)Ⅰ型IFNs反應來抑制病毒的復制。ELF4參與Ⅰ型干擾素（IFNs）的產(chǎn)生，IFNs是宿主建立抗病毒狀態(tài)阻止病毒在宿主細胞內(nèi)復制的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。此外，ELF4在機體抗病毒的細胞免疫反應中也起著重要作用，可調(diào)控CD8+T細胞的發(fā)育、增殖和歸巢等（Yamada et al.，2009）。ELF4基因缺失導致NK細胞或細胞毒性T細胞（CTL）發(fā)育及其穿孔素基因的表達障礙（Lacorazza et al.，2002）。ELF4是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫中至關(guān)重要的癌基因（Sashida et al.，2009），且作為抑癌或者促癌的研究均有報道。研究發(fā)現(xiàn)，ELF4基因在神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤中異常高表達，可通過直接激活機體細胞內(nèi)Sox2基因的表達從而賦予其干細胞特性，促使神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的形成（Bazzoli et al.，2012）。也有研究發(fā)現(xiàn)，ELF4可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，進而實現(xiàn)對胃癌細胞增殖和侵襲的正向調(diào)節(jié)作用（劉偉等，2021）。此外，ELF4基因高表達可促進人胰島素瘤細胞增殖，同時增強人胰島素瘤細胞抗凋亡能力，其作用機理是通過激活Akt通路而促進胰島素瘤細胞增殖和抗凋亡（衛(wèi)國紅等，2021）。然而，在急性髓性白血病中ELF4則是作為抑癌基因起作用（Okabayashi et al.，2013）。【本研究切入點】ELF4基因的功能具有多樣性，在抗感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但目前國內(nèi)外尚無有關(guān)犬ELF4基因克隆、表達及其功能的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆犬轉(zhuǎn)錄因子ELF4基因（cELF4），并通過原核表達制備免疫原，免疫蛋雞制備抗犬ELF4特異性卵黃抗體（IgY）并鑒定其免疫活性，為進一步研究犬ELF4蛋白功能提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞、質(zhì)粒、菌株及試驗動物感受態(tài)細胞DH5α、BL21（DE3）、Transtta（DE3）和Top 10購自天根生化科技（北京）有限公司；原核表達載體pET-28a、pEGFP-C1購自Novagen公司；120日齡左右的產(chǎn)蛋雞購自衡陽某養(yǎng)雞場。

1.1.2 主要試劑RNAiso試劑、PrimeScript II First Strand cDNA Synthesis Kit、GXL polymerase高保真酶、內(nèi)切酶及XfectTM轉(zhuǎn)染試劑均購自寶生物工程（北京）有限公司；His-Tag Mouse mAb、EGFP-Tag Mouse mAb、HRP-Goat-Anti-Mouse IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP-Goat-Anti-Chicken IgG購自Invitrogen公司；疫苗佐劑ISA 15AVG、ISA 71VG和ISA 201VG佐劑購自SEPPIC公司；增強型HRPDAB顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Hoechst 33342購自Abbkine Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1cELF4基因克隆及序列分析采用RNAiso試劑提取中華田園犬血液中總RNA，取20.0μL總RNA樣 品，采 用PrimeScript II First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。根據(jù)人ELF4基因序列（GenBank No.NM_001421）設(shè)計cELF4基因克隆引物cELF4-F1/cELF4 R1992（表1），并以2.0μL cDNA為模版進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pMD19-T，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞進行抗性篩選，重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和序列測定。利用DNAStar 7.0 MegAlign和MEGA 5.0對犬ELF4、人ELF4（Homo sapiens，NM_001421）、豬ELF4（Sus scrofa，KU097322）、牛ELF4（Bos taurus，NM_0011 92029）、小鼠ELF4（Mus musculus，NM_019680）及褐家鼠ELF4（Rattus norvegicus，NM_001191735）的核苷酸序列和氨基酸序列進行對比分析。

表1 引物序列及其反應條件Table 1 Primer sequences and their reaction conditions

1.2.2 重組原核表達載體構(gòu)建與鑒定以pMD19TcELF4載體為模板，參照GXL polymerase高保真酶說明書，利用表達引物cELF4-F1-B/cELF4 R1992-X擴增cELF4基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切后與pET-28a載體連接后，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，采用雙酶切和測序鑒定陽性克隆。

1.2.3 重組cELF4蛋白（rcELF4）的誘導表達及鑒定將雙酶切和測序結(jié)果正確的陽性菌株接種新鮮LB培養(yǎng)基，活化后擴大培養(yǎng)4 h，加入終濃度為1 mmol/L IPTG（王瑾等，2017），置于37℃、220 r/min的搖床誘導目的蛋白表達，設(shè)不加誘導劑重組菌株對照和含空載體菌株誘導對照。10000 r/min離心2 min收集菌體，超聲破碎，10000 r/min離心10 min、收集上清和沉淀。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用2%脫脂奶粉-PBS于37℃封閉1 h，PBST漂洗3次后與His-Tag Mouse mAb單克隆抗體（1∶3000稀釋）孵育1 h，PBST洗3次，與Gaot-Anti-Mouse IgG（1∶6000稀釋）孵育1 h，PBST洗滌后，用DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.4 rcELF4蛋白特異性卵黃抗體（IgY）的制備將重組蛋白表達菌株Rosetta（DE3）-pET28a-cELF4加入到新鮮LB培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min的搖床過夜，再進行二次活化，10000 r/min離心2 min收集濃縮菌體，10000 r/min離心10 min三次超聲破碎，取第1次超聲上清、第2次超聲上清、第3次超聲溶解蛋白樣品進行SDS-PAGE和Western blotting分析，將表達得到的蛋白分別與佐劑ISA 15VG、ISA 71VG、ISA 201VG按照3∶17、3∶7、1∶1的比例進行乳化，具體乳化參數(shù)參照說明書進行，制備好的免疫原于4℃保存?zhèn)溆?。?0周齡左右的產(chǎn)蛋雞，分為ISA 15VG組、ISA 71VG組、ISA 201VG組和空白組，每組6只，分兩次免疫，間隔21 d，免疫劑量為1 mL/羽。首次免疫后第21、38和51 d進行翼下靜脈采血，將采集到的血液于37℃靜置2 h，4℃過夜，5000 r/min離心分離血清，同時設(shè)不免疫雞作為陰性對照。收集首次免疫后第7、14、21、28、35、42和49 d的雞蛋，用聚乙二醇法提取卵黃抗體。

1.2.5 rcELF4蛋白特異性IgY抗體Western blotting效價檢測以rcELF4蛋白為抗原，采用Western blotting檢測血清及卵黃抗體滴度。血清稀釋方法：將血清按初始濃度1∶200稀釋，然后在此基礎(chǔ)上進行2倍比稀釋到1∶64000，反應結(jié)果為陽性的最大稀釋度即為血清抗體滴度。卵黃抗體稀釋方法：將卵黃抗體按初始濃度1∶200稀釋，然后在此基礎(chǔ)上進行2倍比稀釋直到1∶256000，反應結(jié)果為陽性的最大稀釋度即為卵黃抗體滴度。

1.2.6 卵黃中總IgY含量測定使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定提取的rcELF4蛋白IgY濃度。通過梯度稀釋配制0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000和1.500 mg/mL蛋白標準，取5μL不同濃度蛋白標準加入96孔板的蛋白標準孔內(nèi)，取5μL IgY樣品到96孔板的樣品孔中，各孔加入250μL G250染色液，用酶標儀測定吸光度值（A595nm），以標準蛋白質(zhì)濃度為橫坐標、A595nm為縱坐標，繪制蛋白質(zhì)標準曲線并計算樣品中的蛋白濃度。

1.2.7 重組真核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染以pMD19TcELF4載體為模板，參照GXL polymerase高保真酶說明書，利用表達引物cELF4-F1-S和cELF4-R1992-B擴增cELF4基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)S和BamH I雙酶切后與pEGFP-C1連接，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，采用雙酶切和測序鑒定陽性克隆。將生長狀態(tài)良好的Hela細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；形成單層細胞后，采用Xfect?轉(zhuǎn)染試劑將pEGFP-cELF4轉(zhuǎn)染細胞，同時設(shè)置空載體pEGFP-C1和不轉(zhuǎn)染空白細胞對照。轉(zhuǎn)染40 h后棄培養(yǎng)基，0.85%的生理鹽水洗滌1次，加入Hoechst 33342染液，室溫孵育3～5 min，棄染液，用0.85%的生理鹽水洗滌3次，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光。

1.2.8 cELF4特異性IgY與重組真核表達蛋白EGFPcELF4反應性檢測將pEGFP-cELF4轉(zhuǎn)染Hela細胞，方法同1.2.7。轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，加2%的BSA-PBS后37℃封閉1 h，分成兩組，其中一組使用本研究制備的cELF4特異性IgY作為一抗，另一組采用EGFP鼠單克隆抗體作為一抗，37℃孵育1 h，兩組的二抗分別為HRP標記的羊抗雞抗體和HRP標記的羊抗鼠抗體，37℃孵育1 h，加入AEC底物，室溫顯色15 min，加入蒸餾水終止反應，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 cELF4基因的克隆

經(jīng)RT-PCR擴增得到1條分子量大小約2000 bp的條帶，與預期結(jié)果相符（圖1泳道1）。提取重組菌的質(zhì)粒進行EcoR I和HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果（圖1）顯示，酶切產(chǎn)物分別得到片段約2000 bp的目的條帶和2500 bp的載體片段，表明目的基因已成功克隆到pMD-19T載體中。

2.2 cELF4基因的序列分析結(jié)果

序列分析結(jié)果顯示，cELF4基因的開放閱讀框（ORF）全長為1992 bp，編碼663個氨基酸殘基，蛋白分子量大小約70.7 kD。通過與GenBank染色體序列數(shù)據(jù)庫基因組序列（GenBank No.NC_006621.4）進行比對分析，結(jié)果顯示，cELF4基因位于豬X號染色體，由8個外顯子組成，覆蓋位置103071073～103080846 bp，5′端非編碼區(qū)至3′端非編碼區(qū)合計9774 bp（圖2）。將cELF4基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MZ198105。

目前，GenBank中已有人、牛、野豬、小鼠和褐家鼠5種動物的ELF4基因被測序，其他動物的ELF4基因mRNA序列均為預測序列。將犬ELF4基因編碼的氨基酸序列與被測序的5種動物ELF4蛋白氨基酸序列進行對比分析，結(jié)果顯示，該序列與人、野豬、牛、小鼠和褐家鼠的ELF4氨基酸序列在第198～304位氨基酸之間均高度保守，其他區(qū)段均存在不同程度的差異（圖3）。此外，同源比對結(jié)果顯示，將cELF4基因與狐、人、牛、野豬、小鼠和褐家鼠ELF4基因的核苷酸相似性分別為99.3%、89.4%、88.5%、89.8%、81.5%和82.0%，其編碼蛋白與狐、人、牛、野豬、小鼠和褐家鼠ELF4蛋白的氨基酸相似性依次為99.7%、89.6%、89.0%、91.8%、78.8%和78.4%。利用MEGA 5.0中的最大相似法對53個物種的ELF4基因進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示，cELF4基因與狐、大熊貓、歐洲雪貂、北美水獺等動物ELF4基因的親緣關(guān)系較近，而與人和猴等靈長類動物及嚙齒類鼠ELF4基因的親緣關(guān)系相對較遠（圖4）。

2.3 重組表達菌株鑒定結(jié)果

pET28a-cELF4分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞后，經(jīng)擴大培養(yǎng)后分別提取陽性克隆的質(zhì)粒，用XhoI和BamH I雙酶切后，酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從重組表達菌株BL21（DE3）-pET28a-cELF4和Rosetta（DE3）-pET28a-cELF4中提取的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物中均含有約1992 bp的目的條帶和5369 bp的載體片段，表明重組表達菌株BL21（DE3）-pET28a-cELF4和Rosetta（DE3）-pET28a-cELF4構(gòu)建成功。

2.4 重組蛋白rcELF4誘導表達及鑒定結(jié)果

重組表達菌株BL21（DE3）-pET28a-cELF4用1 mmol/L的IPTG誘導后未觀察到目的條帶（圖6-A）；Rosetta（DE3）-pET28a-cELF4用1 mmol/L的IPTG誘導后沉淀在100 kD附近出現(xiàn)目的條帶，且上清和包涵體中均有目的蛋白表達（圖6-B）。

2.5 重組蛋白rcELF4純化及檢測結(jié)果

將得到的rcELF4蛋白采用超聲法進行3次純化，對第1次超聲、第2次超聲上清和第3次超聲溶解蛋白進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100 kD附近出現(xiàn)清晰條帶，純化效果較好。對重組菌株大量表達的目的蛋白進行Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3次超聲溶解蛋白在100 kD處出現(xiàn)目的條帶（圖7）。

2.6 rcELF4卵黃抗體制備及檢測結(jié)果

收集免疫后第7、14、21、28、35、42和49 d的雞蛋，用聚乙二醇法提取卵黃抗體，并進行SDS-PAGA凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重鏈（70 kD）和輕鏈（25 kD）條帶明顯，提取的卵黃抗體分子完整性好、純度較高（圖8）。

2.7 rcELF4蛋白血清抗體免疫活性鑒定

對首免后第0、21、38和51 d的雞進行翅靜脈采血，將分離到的血清進行Western blotting滴度測定，結(jié)果如圖9所示。rcELF4蛋白可刺激雞產(chǎn)生相應抗體，ISA 15AVG組血清抗體滴度在首免后第21、38和51 d分別為1600、64000和8000倍；ISA 71VG組血清抗體滴度在首免后第21、38和51 d分別為12800、64000和8000倍；ISA 201VG組血清抗體滴度在首免后第21、38和51 d分別為25600、128000和64000倍。

2.8 rcELF4蛋白卵黃抗體滴度檢測

提取首免后第7、14、21、28、35、42和49 d的雞蛋卵黃中的抗體進行Western blotting滴度測定。由圖10可知，rcELF4蛋白可刺激雞產(chǎn)生相應抗體，ISA 15AVG組卵黃抗體滴度在首免后第14、21、28、35、42和49 d分別為1600、1600、1600、16000、8000和8000倍；ISA 71VG組卵黃抗體滴度在首免后第14、21、28、35、42和49 d分別為25600、6400、3200、32000、32000和16000倍；ISA 201VG雞卵黃抗體滴度在首免后第14、21、28、35、42和49 d分別為51200、6400、25600、256000、256000和16000倍。

2.9 卵黃中總IgY含量測定結(jié)果

采用Bradford法，以標準蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標制得標準曲線（圖11）。將提取成功的首免后第7、14、21、28、35、42和49 d的卵黃抗體進行IgY含量測定，結(jié)果如圖12所示。ISA 15AVG組雞所產(chǎn)雞蛋卵黃中抗體含量在首免后第7、14、21、28、35、42和49 d分別為3.99、3.88、3.84、3.88、3.50、3.80和3.57 mg/10 mL卵黃液；ISA 71VG組雞所產(chǎn)雞蛋卵黃中抗體含量在首免后第7、14、21、28、35、42和49 d分別為4.02、3.92、3.92、3.75、3.87、1.70、3.14 mg/10 mL卵黃液；ISA 201VG組雞所產(chǎn)雞蛋卵黃中抗體含量在首免后第7、14、21、28、35、42和49 d分別為3.93、4.09、3.43、3.54、3.08、2.45、3.73 mg/10 mL卵黃液。

2.10 cELF4基因真核表達載體的構(gòu)建結(jié)果

以pMD19T-cELF4載體為模板、cELF4-F1-S和cELF4-R1992-B為引物，PCR擴增獲得一條分子量大小約1992 bp的條帶，與預期結(jié)果相符。將目的片段連接至pEGFP-C1，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞。提取陽性克隆菌Top-pEGFP-cELF4的重組質(zhì)粒用SalI和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物分別得到片段為1992 bp的目的條帶和4700 bp的載體片段，表明目的基因已連接至pEGFP-C1載體，成功構(gòu)建真核表達載體pEGFP-cELF4（圖13）。

2.11 EGFP-cELF4融合蛋白熒光觀察及其與cELF4特異性IgY反應性檢測結(jié)果

結(jié)合綠色熒光和Hoechst 33342染色可看出，轉(zhuǎn)染pEGFP-cELF4細胞的綠色熒光主要呈現(xiàn)較規(guī)則的圓形或橢圓形，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1細胞的綠色熒光在細胞質(zhì)和細胞核中均勻分布，空白對照中則無綠色熒光，說明EGFP-cELF4融合蛋白細胞綠色熒光定位在細胞核中（圖14-A）。

EGFP單克隆抗體孵育組：Hela-pEGFP-cELF4呈細胞核特異性著色、Hela-pEGFP-C1細胞質(zhì)和細胞核均有著色，Hela細胞無反應。cELF4特異性IgY孵育組：Hela-pEGFP-cELF4、Hela-pEGFP-C1、Hela細胞均呈細胞核特異性著色，且Hela-pEGFP-cELF4細胞著色細胞數(shù)量最多，Hela-pEGFP-C1和Hela著色細胞數(shù)量相對較少。說明EGFP單克隆抗體和cELF4特異性IgY均可與EGFP-cELF4融合蛋白發(fā)生特異性反應；cELF4特異性IgY可與對照細胞Hela-pEGFP-C1和Hela細胞發(fā)生反應，且與Hela-pEGFP-cELF4一樣呈細胞核特異性著色（圖14-B）。

3 討論

ELF4基因在抗感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前GenBank數(shù)據(jù)庫中正式測定的ELF4基因序列僅有5種動物（人、牛、野豬、小鼠和褐家鼠），軟件預測的有47種動物。但目前尚無有關(guān)犬ELF4基因克隆、表達及其功能的研究報道。本研究克隆了犬ELF4基因（cELF4），并制備了其特異性的抗體，研究發(fā)現(xiàn)，cELF4基因與狐ELF4的核苷酸相似性最高（99.3%），氨基酸相似性最高（99.7%），其次是與野豬ELF4（GenBank No.KU097322）的核苷酸相似性較高（89.8%），氨基酸相似性較高（91.8%）。將系統(tǒng)進化分析結(jié)果與動物分類學相結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，犬與狐處于同一分支上，均屬于犬科，二者的ELF4基因親緣關(guān)系最近，雖然從動物分類學角度同科的物種親緣關(guān)系較近，其ELF4基因也應處于同一分支，但也有例外，如海豹、南象海豹和港海豹屬于豹科，北美水獺屬于鼬科，四者的ELF4基因處于同一分支；此外，鼠科動物（鼠和褐家鼠）的ELF4與cELF4的親緣關(guān)系相對較遠。

本研究將cELF4基因與pET28a載體連接，分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）和Rosetta（DE3）表達菌株，經(jīng)IPTG誘導表達發(fā)現(xiàn)，BL21（DE3）表達菌株未表達rcELF4蛋白，而Rosetta（DE3）表達菌株能表達rcELF4蛋白，其原因是Rosetta（DE3）菌株能提供稀有密碼子，而BL21（DE3）不能提供稀有密碼子；經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在Rosetta（DE3）表達菌株表達的rcELF4蛋白分子量約100 kD。本研究將cELF4基因插入pET-28a載體的BamHⅠ和XhoⅠ之間，cELF4基因上游從NcoⅠ到BamHⅠ之間有His與T7標簽基因、其編碼蛋白的分子量大小約為3.5 kD，與cELF4形成融合蛋白，而軟件預測的cELF4分子量約為70.7 kD，兩者之和（約74.2 kD）遠小于表達的rcELF4蛋白分子量，推測由于rcELF4蛋白在表達菌中被修飾所致（李曉蓉等，2015）。

本研究結(jié)果顯示，不同類型的免疫佐劑會對rcELF4蛋白抗原的免疫原性產(chǎn)生不同的影響，三組佐劑疫苗的雞血清抗體滴度均在首免后38 d達到最高值，以ISA 201VG組效價最優(yōu)；三組佐劑免疫雞的卵黃抗體均在首免后第14 d特異性抗體轉(zhuǎn)陽，在首免后35 d三組佐劑免疫雞的卵黃抗體滴度均達最高峰，首免后38 d三組蛋雞血清的效價也達到最高，且比首免后第35 d和42 d的卵黃抗體效價要高，ISA 201VG組除外，因為血清首免后第38 d為128000倍呈陽性，因此最高效價大于128000倍，可得出血清中的抗體效價與卵黃抗體的效價呈正相關(guān)，且血清抗體效價要高于卵黃抗體效價，與杭柏林等（2020）的研究結(jié)果一致。此外，三組雞蛋卵黃含量均在總體上表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢，隨著時間的推移，IgY含量逐漸減少，二次免疫后IgY含量增加。張小鶯和陳?。?011）研究表明，特異性血清抗體轉(zhuǎn)移到卵黃大約需要3～6 d，因此卵黃抗體峰值出現(xiàn)的時間相對血清抗體峰值出現(xiàn)的時間要晚。劉銘（2020）研究發(fā)現(xiàn)，水稀釋-硫酸銨二次沉淀法提取IgY含量為3.837 mg/mL卵黃液、辛酸法提取IgY含量為3.422 mg/mL卵黃液、氯仿法提取IgY含量為4.512 mg/mL卵黃液；路桂霞（2020）研究發(fā)現(xiàn)，水稀釋-硫酸銨二次沉淀法提取IgY含量為1.05 mg/mL卵黃液。本研究使用聚乙二醇法提取的IgY含量最高，為4.09 mg/10 mL卵黃液，與向冬梅等（2020）研究發(fā)現(xiàn)聚乙二醇法提取的IgY純度最高、雜質(zhì)最少的結(jié)論相符。上述研究所制備的IgY含量均有所差異，一方面跟提取方法不同有關(guān)，另一方面與個體差異和品種差異也有一定關(guān)系（路桂霞，2020）。

本研究通過不同佐劑試驗組比較發(fā)現(xiàn)，比ISA 15AVG佐劑相比，ISA 201VG佐劑和ISA 71VG佐劑激發(fā)的抗體水平更高。ISA 201VG是一種新型礦物水包油包水的佐劑，具有良好的耐受性，可快速誘導短期免疫反應并激發(fā)細胞免疫反應；ISA 71VG是一種新型礦物油包水佐劑，可誘導長期體液免疫反應，并能較好地激發(fā)細胞免疫反應。與標準佐劑相比，新型礦物油佐劑更能引發(fā)類似的IgG1反應，不僅增強IgG2a反應，還可增強雞艾美爾球蟲抑制蛋白亞單位疫苗的體液和細胞免疫應答反應（Jang et al.，2011），誘導肉雞對H5N1亞型禽流感滅活疫苗的細胞免疫應答、提高HI抗體水平（王彥妮等，2011）。卵黃抗體具有高特異性、高親和力（Lee et al.，2017）、化學性質(zhì)穩(wěn)定、生產(chǎn)制備過程簡單、經(jīng)濟產(chǎn)量高等優(yōu)點，可替代哺乳動物的IgG抗體，被廣泛應用于畜禽細菌性腸道疾病防治病、急性呼吸道感染、免疫分析檢測和食品行業(yè)的保鮮（王剛和呂殿紅，2002；Zhang et al.，2015；張璐等，2017；Constantin et al.，2020；Kota et al.，2020；賀維朝等，2021）。本研究所優(yōu)化的佐劑配伍免疫后的IgY產(chǎn)量高，為后續(xù)應用降低了成本。

本研究通過熒光觀察和免疫染色確定cELF4定位在細胞核中，與Suico等（2004）報道的人ELF4細胞核定位結(jié)果一致。此外，通過免疫染色發(fā)現(xiàn)，cELF4特異性IgY不僅與融合蛋白EGFP-cELF4反應良好，且與Hela細胞也呈特異性的細胞核染色反應，一個視野中僅為部分Hela細胞細胞核著色，部分細胞無著色。這可能是由于cELF4與人ELF4氨基酸序列相似性較高（89.6%），且存在保守區(qū)，故而產(chǎn)生交叉反應。至于其中僅部分細胞細胞核著色、部分不著色，可能與每個Hela細胞中ELF4表達量的大小有關(guān)。那么，cELF4特異性IgY是否還與其他物種的ELF4存在交叉反應，且交叉反應的強度是否有差異，交叉反應的具體抗原表位是否相同，這些問題是后續(xù)深入研究的方向。

4 結(jié)論

cELF4基因與狐的ELF4基因親緣關(guān)系最近，rcELF4蛋白在大腸桿菌中成功表達且存在翻譯后修飾現(xiàn)象。不同類型的免疫佐劑對rcELF4蛋白的免疫原性產(chǎn)生不同影響，所制備rcELF4抗體免疫活性良好、且與人ELF4蛋白存在交叉反應。