馬氏珠母貝TLRP基因克隆及其功能研究

張美珍，王志新，吳羽媛，梁海鷹

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類重要的模式識別受體，在炎癥發(fā)生、促免疫分子表達(dá)、免疫細(xì)胞成熟、配體識別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及抗病毒感染等方面發(fā)揮重要作用（唐深和冷靜，2004；唐沙等，2021）。TLRP（Toll-like receptor protein）屬于TLRs家族成員之一，但其序列特征和功能尚未清楚。因此，克隆TLRP基因cDNA序列并進(jìn)行表達(dá)特征分析，可為后續(xù)研究TLRP基因功能提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TLRs家族種類較多，按細(xì)胞定位可分為細(xì)胞表面TLRs和細(xì)胞內(nèi)TLRs。其中，細(xì)胞表面TLRs包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要識別脂多糖、脂蛋白等微生物膜 成 分；細(xì) 胞 內(nèi)TLRs包 括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，主要識別細(xì)菌和病毒 的 核酸（Manavalan et al.，2011；Kawasaki and Kawai，2014）。除上述TLRs外，近年來在魚類中還鑒定出特有的TLR27（Wang et al.，2015）。TLRs主要由三大部分組成，包括富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine rich repeats，LRRs）的胞外區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane region，TM）及含有與白介素-1受體高度同源的TIR結(jié)構(gòu)域（Toll/I L-1receptor domain）的胞內(nèi)區(qū)（唐雪穎，2018），其中，LRRs的數(shù)量和序列特征決定了TLRs特異性識別病原的模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PAMPs），TIR結(jié)構(gòu)域可招募MyD88和TRIF等接頭蛋白，激活下游信號通路，從而啟動(dòng)免疫反應(yīng)（Narayanan and Park，2015；尹淑園，2020）。已有研究發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌感染短蛸后，其肝臟中的TLR13基因表達(dá)量升高且在感染后24 h達(dá)最大值，暗示該基因參與鰻弧菌病變過程（周建波等，2019）；大彈涂魚感染鰻弧菌后TLR5基因在其肝臟和脾臟中的表達(dá)量均呈先增加后減少的變化趨勢，說明TLR5基因在細(xì)菌刺激下能產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)（劉坪等，2020）；細(xì)粒棘球蚴感染小鼠肝臟組織后，TLR2基因表達(dá)量增加且出現(xiàn)明顯的炎癥癥狀（王金龍，2020）?？梢?，TLRs在不同物種的免疫防御反應(yīng)中扮演著重要角色?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要貝類之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，因海水水質(zhì)日益惡化導(dǎo)致馬氏珠母貝各種病害頻繁發(fā)生，產(chǎn)珠能力及珍珠質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢（何軍軍等，2019）；在馬氏珠母貝植核過程中通常會(huì)帶入大量病原體引起受體貝的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，而導(dǎo)致吐核甚至死亡（Wang et al.，2017）。在細(xì)菌感染或植核后，馬氏珠母貝部分免疫相關(guān)基因和蛋白會(huì)發(fā)生顯著變化，其中TLRs發(fā)揮著重要作用（Wang et al.，2017，2019）。本課題組前期已完成馬氏珠母貝基因組測序、組裝和注釋（Du et al.，2017），在基因組中發(fā)現(xiàn)多個(gè)TLRs基因，鑒定出TLR2（師尚麗等，2014）、TLR3（汪歡，2012）、TLR4（Wu et al.，2017）、TLR6（吳羽媛等，2017）和TLR13（吳羽媛等，2018），并進(jìn)行初步分析，但仍有部分TLRs基因尚未得到鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過RACE克隆馬氏珠母貝TLRP基因（PmTLRP）cDNA序列，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PmTLRP在馬氏珠母貝各組織中的表達(dá)情況和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）刺激、植核及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究TLRs在馬氏珠母貝中的免疫機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2齡馬氏珠母貝取自廣東省湛江市徐聞養(yǎng)殖場，在實(shí)驗(yàn)室海水中暫養(yǎng)7 d后挑選活性強(qiáng)、規(guī)格相近的馬氏珠母貝進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司；rTaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體及Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）等購自Ta-KaRa公司；純化回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；SYBR?Select Master Mix和TRIzol購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 cDNA合成

采用TRIzol法提取馬氏珠母貝肝胰腺等6個(gè)組織總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度；然后參照RACE試劑盒說明制備3′-RACE和5′-RACE模板，同時(shí)按照RNase H說明合成cDNA模板。

1.3 PmTLRP基因cDNA序列克隆

從本課題組前期構(gòu)建的馬氏珠母貝珍珠囊轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出注釋為TLR的Unigenes序列，并設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增5′和3′末端，普通PCR擴(kuò)增中間片段。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后回收目的基因進(jìn)行純化，連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，以LA固體培養(yǎng)基（含Amp+）進(jìn)行過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司廣州測序部測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果和Unigenes序列采用DNAMAN進(jìn)行比對分析，而拼接得到PmTLRP基因cDNA序列，以O(shè)RF Finder在線預(yù)測其氨基酸序列；采用ExPASy的ProtParam和ProtScale預(yù)測PmTLRP蛋白分子量、理論等電點(diǎn)（pI）及其親/疏水性；利用SignalP 4.0和TMHMM v.2.0分別預(yù)測其信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用SMART、SoftBerry Psite和SOPMA預(yù)測PmTLRP蛋白的結(jié)構(gòu)域、序列功能位點(diǎn)及其二級結(jié)構(gòu)；經(jīng)TLRs氨基酸多序列比對分析后，以MEGA X的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 PmTLRP基因組織表達(dá)分析

選取10只活性強(qiáng)、規(guī)格一致的馬氏珠母貝，采集其血淋巴、外套膜、性腺、肝胰腺、閉殼肌和鰓組織，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系10.0μL：cDNA模板0.5μL，SYBR?Select Master Mix 5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，滅菌ddH2O 3.7μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃15 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；添加1個(gè)熔解曲線（95℃10 s，60℃60 s，95℃1 s）；37℃延伸30 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)組織進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 哈維氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表達(dá)情況

復(fù)蘇保存的哈維氏弧菌菌株，取20 mL菌液加入至800 mL的TSB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，菌株以PBS洗滌3次后重懸于PBS。選取健康的馬氏珠母貝140只，分成哈維氏弧菌刺激組和PBS對照組，每組70只。采用閉殼肌注射法向哈維氏弧菌刺激組馬氏珠母貝注射哈維氏弧菌（1×107個(gè)/mL）進(jìn)行誘導(dǎo)，100μL/只，對照組注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、6、8、12、16和24 h各處理組隨機(jī)選取10只馬氏珠母貝，抽取其血淋巴，4℃下3500 r/min離心5 min，收集血細(xì)胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Pm-TLRP基因進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。同時(shí)，對暫養(yǎng)1周的80只馬氏珠母進(jìn)行植核試驗(yàn)，分別抽取植核前（0 h）及植核后5、10、15、20和30 d的血淋巴，4℃下3500 r/min離心5 min，收集血細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR對PmTLRP基因進(jìn)行定量分析。

1.7 LPS刺激后PmTLRP基因在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)情況

選取200只健康的馬氏珠母貝，分成LPS刺激組和PBS對照組，每組100只。采用從閉殼肌注射法向LPS刺激組馬氏珠母貝注射10μg/mL的LPS，100 μL/只，對照組注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、3、4、6、8、12、16、24和48 h各處理組隨機(jī)選取10只馬氏珠母貝，分別抽取血淋巴和采集肝胰腺，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR對PmTLRP基因進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

以GAPDH基因的表達(dá)量為校對基準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt法換算PmTLRP基因相對表達(dá)量，并以SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmTLRP基因序列特征分析結(jié)果

測序結(jié)果和Unigenes序列經(jīng)DNAMAN比對分析后拼接出PmTLRP基因cDNA序列全長為2214 bp，開放閱讀框（ORF）共編碼681個(gè)氨基酸殘基（圖1）；其5′非編碼區(qū)（5′-UTR）為33 bp，3′非編碼區(qū)（3′-UTR）為135 bp，且3′-UTR包含有27 bp的poly（A）尾巴和加尾信號序列AATAA。

2.2 PmTLRP蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

PmTLRP蛋白分子量為79.78 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.66，不穩(wěn)定系數(shù)為44.56，屬于不穩(wěn)定蛋白。ProtScale預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在第383位氨基酸達(dá)最大親水性，親水性系數(shù)為-2.956；在第440～441位氨基酸達(dá)最大疏水性，親水性系數(shù)為4.156；總平均親水性系數(shù)為-0.313，故確定為親水性蛋白（圖2）。PmTLRP蛋白在第12～34位和第423～445位氨基酸處存在跨膜結(jié)構(gòu)域，且在N-末端存在信號肽序列；TMHMM v.2.0預(yù)測結(jié)果（圖3）表明，PmTLRP蛋白含有LRRs重復(fù)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。SoftBerry Psite功能位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PmTLRP蛋白包含2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和CAAX box、3個(gè)cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)與N-豆蔻?；稽c(diǎn)、7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、10個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、12個(gè)微體C-末端定位信號序列及13個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。SOPMA預(yù)測結(jié)果顯示，PmTLRP蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲分別占39.21%、4.70%、19.68%和36.42%；采用SWISS-MODEL預(yù)測得知PmTLRP蛋白三維結(jié)構(gòu)與美洲牡蠣（Crassostrea virginica）TLP蛋白相似（圖4）。

2.3 多序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

運(yùn)用DNAMAN對PmTLRP氨基酸序列與歐洲扇貝（Pecten maximus）Tollo氨基酸序列（XP_03375 4674.1）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）Tollo氨基酸序列（XP_021374025.1）、美洲牡蠣TLP氨基酸序列（XP_022322147.1）、福壽螺（Pomacea canaliculata）TLR2氨基酸序列（XP_025114565.1）和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）TLR1氨基酸序列（DI511 60.1）進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果（圖5）顯示，PmTLRP氨基酸序列與其他物種的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中與美洲牡蠣TLP氨基酸序列的相似度較高，為48.75%。基于TLRs氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖6）也顯示，馬氏珠母貝與美洲牡蠣聚為一支，二者的親緣關(guān)系較近。

2.4 PmTLRP基因組織表達(dá)特征分析結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)，Pm-TLRP基因在馬氏珠母貝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鰓、性腺和閉殼肌中均有表達(dá)，以在外套膜、肝胰腺和血淋巴中的相對表達(dá)量較高，尤其是在肝胰腺中的相對表達(dá)量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量（P＜0.05，下同）。

2.5 哈維氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表達(dá)情況

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PmTLRP基因在哈維氏弧菌刺激及植核后不同時(shí)期血淋巴中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哈維氏弧菌刺激下，PmTLRP基因相對表達(dá)量在注射刺激后12 h開始上調(diào)，至注射刺激后16 h達(dá)最大值，約是注射刺激前（0 h）的19.0倍，其差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），但在注射刺激后24 h逐漸恢復(fù)至原有水平（圖8-A）。經(jīng)植核刺激后，PmTLRP基因相對表達(dá)量在植核后5～20 d呈逐漸上升趨勢（圖8-B），但差異不顯著（P＞0.05），于植核后30 d達(dá)最大值，約是植核前（0 h）的6.4倍，二者差異顯著。

2.6 LPS刺激后PmTLRP基因在血淋巴和肝胰腺的表達(dá)情況

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PmTLRP基因在LPS刺激后不同時(shí)期血淋巴和肝胰腺中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母血淋巴中的相對表達(dá)量先上升后下降，至注射刺激后3 h達(dá)最大值，約是對照組的5.0倍（圖9-A），二者差異顯著；PmTLRP基因在馬氏珠母肝胰腺中的相對表達(dá)量呈升高→降低→升高→降低→升高的波動(dòng)變化趨勢（圖9-B），至注射刺激后24 h相對表達(dá)量上調(diào)至最大值，約是對照組（0 h）的6.0倍。

3 討論

TLRs是病原微生物感染入侵后識別免疫系統(tǒng)PAMPs的關(guān)鍵分子，也是識別細(xì)胞損傷或死亡所產(chǎn)生內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的重要分子，更是連接先天性免疫與適應(yīng)性免疫的重要橋梁（Lu et al.，2016；尹淑園，2020）。本研究成功克隆獲得PmTLRP基因cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，PmTLRP基 因cDNA序 列 全 長 為2214 bp，共 編 碼681個(gè)氨基酸殘基；PmTLRP蛋白分子量為79.78 kD，pI為5.66，屬于不穩(wěn)定蛋白，含有信號肽、LRRs重復(fù)序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域，符合TLRs家族所具有的特征。PmTLRP氨基酸序列與其他物種的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中與美洲牡蠣TLP氨基酸序列的相似度較高。

了解基因在不同組織器官中的表達(dá)模式是研究基因功能的基本手段之一（Cui et al.，2010）。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，PmTLRP基因在馬氏珠母貝肝胰腺、鰓和血淋巴中高表達(dá)，與其他物種的表達(dá)模式類似，如青蛤TLR4和TLR13基因在血細(xì)胞中的相對表達(dá)量最高（Ren et al.，2016），厚殼貽貝新型TLRs在肝胰腺中的相對表達(dá)量高于在鰓組織中的相對表達(dá)量（Xu et al.，2018），厚殼貽貝McTLR2基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高且顯著高于其他組織（Li et al.，2019）。在軟體動(dòng)物中，肝胰腺、鰓和血細(xì)胞均是極其重要的免疫器官，其中，肝胰腺參與代謝和消化吸收，鰓可過濾水中的細(xì)菌和有害物質(zhì)及抵御細(xì)菌和毒性物質(zhì)（王志新等，2013）。PmTLRP基因在肝胰腺中高表達(dá)暗示其可能參與馬氏珠母貝免疫防御機(jī)制。

在貝類養(yǎng)殖過程中，微生物疾病危害可導(dǎo)致貝類死亡率增高，其中危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原菌是弧菌（陳皓文，2005；方皓，2019；張穎雪等，2020）。哈維氏弧菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，是多種海洋魚類和無脊椎動(dòng)物的病原體，主要通過包埋、侵襲宿主細(xì)胞，以及在宿主體內(nèi)增殖和產(chǎn)生毒素等形式促使貝類發(fā)病（Zhang et al.，2020）。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測哈維氏弧菌刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pm-TLRP基因相對表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢，與鮸魚TLR5S基因（Huo et al.，2018）和海鱸TLR1基因（Li et al.，2018）經(jīng)哈維氏弧菌刺激后在其肝臟中的表達(dá)趨勢基本一致，表達(dá)量上升可能是機(jī)體識別哈維氏弧菌或哈維氏弧菌在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖并產(chǎn)生毒素所致；但也有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)哈維氏弧菌刺激后TLR6基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達(dá)呈先上升后下降再上升趨勢（吳羽媛等，2017）?？梢?，哈維氏弧菌能激活TLRs參與應(yīng)答，但表達(dá)趨勢存在差異。

LPS是在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的分子（Park and Lee，2013），能激活NFκB信號通路，使機(jī)體分泌相關(guān)因子而介導(dǎo)免疫反應(yīng)。本研究通過探究LPS刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴和肝胰腺中的時(shí)序表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmTLRP基因在血淋巴中的相對表達(dá)量先上升后下降，而在肝胰腺中的相對表達(dá)量呈升高→降低→升高→降低→升高的波動(dòng)變化趨勢，第2次上升可能是由于機(jī)體所受感染程度增加而產(chǎn)生更多的TLRP來抵御病害。血淋巴是通過吞噬、傷口修復(fù)等方式參與細(xì)胞免疫，以及分泌非特異性體液分子參與體液免疫，因此PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中呈先上升后下降的表達(dá)變化趨勢，與LPS刺激后TLR4基因在血淋巴中的表達(dá)趨勢（Wu et al.，2017）一致，表明LPS刺激下不同組織中PmTLRP基因表達(dá)存在差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激和哈維氏弧菌刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達(dá)趨勢相同，但前者的相對表達(dá)量在刺激后2 h開始上升，而后者在刺激后12 h才開始上升且最大值出現(xiàn)在刺激后16 h，說明不同刺激下PmTLRP基因在同一組織中均產(chǎn)生免疫效應(yīng)但作用時(shí)間存在明顯差異。

植核是珍珠培育的關(guān)鍵步驟，是指向育珠貝內(nèi)臟團(tuán)中移植供體貝的細(xì)胞小片或珠核，通常會(huì)引起免疫排斥，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致育珠貝死亡（Wei et al.，2017），因此，檢測植核后馬氏珠母貝免疫相關(guān)基因在一段時(shí)間內(nèi)的時(shí)序表達(dá)對開展移植免疫機(jī)制研究具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PmTLRP基因相對表達(dá)量在植核后5 h即開始上升，可能與移植過程中切入外套膜組織造成的傷口有關(guān)（Adzigbli et al.，2020）。PmTLRP基因相對表達(dá)量在植核后5～30 d呈持續(xù)上升趨勢，且在植核后30 d達(dá)最大值。Jiao等（2019）研究表明，同種異體植核和異種植核30 d后馬氏珠母貝血淋巴中差異基因數(shù)量明顯增多，且異種植核較同種異體植核損傷程度高。故推測本研究中植核后30 d的PmTLRP基因相對表達(dá)量達(dá)最大值是傷口感染程度增加所導(dǎo)致。吳羽媛等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，TLR6基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達(dá)最大值也是出現(xiàn)在植核后30 d，但TLR6基因表達(dá)量在植核后15 d才開始上升，說明植核能引起TLRs的免疫反應(yīng)，但引起反應(yīng)的時(shí)間有所差異。

4 結(jié)論

PmTLRP基因在馬氏珠母貝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鰓、性腺和閉殼肌中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異，經(jīng)哈維氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明顯上調(diào)表達(dá)趨勢，說明TLRP在馬氏珠母貝的免疫防御反應(yīng)中扮演重要角色。