LED 多波段光譜治療對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響

柏 鑫，侯雪峰，何文芳，何癑穎，王中琪，吳 西，陳克明

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050）

皮膚是人體最大的器官，具有保護(hù)、感覺、分泌、排泄、呼吸等功能，具有重要的屏障保護(hù)作用[1]。由于皮膚直接與外界環(huán)境接觸，因而皮膚創(chuàng)傷也是臨床上常見問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，在美國，受到傷口長期難以愈合影響的人數(shù)超過650 萬，年治療費(fèi)用超過97 億美元。近年來，針對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面的研究不斷深入，其治療手段也逐漸豐富，如負(fù)壓封閉引流技術(shù)、血小板血漿、外用重組人表皮生長因子、自體全血及各種功能性敷料等都取得了較好的治療效果[3-6]。光生物調(diào)節(jié)療法（photobiomodulation therapy，PBMT）是一種安全、無痛、易操作的治療手段，主要利用光的輻射能治療疾病。研究表明[7]，PBMT 能夠減輕創(chuàng)面疼痛、促進(jìn)創(chuàng)面血管新生、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、加快組織愈合和再生。目前PBMT 的光源類型包括低水平激光（low-level laser，LLL）及發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）光源[8]，而且對(duì)于PBMT的研究也更多集中于LLL 上。為研究LED 多波段光譜治療能否促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合，本研究采用LED 多波段光譜治療儀照射大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面，檢測(cè)其對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 LED 多波段光譜治療儀（河北奧特維力科技有限公司）；組織勻漿儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；熒光酶標(biāo)儀（美國美谷分子公司）；電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，半干轉(zhuǎn)膜儀（美國BIO-RAD）；病理切片掃描儀（山東志盈醫(yī)學(xué)科技有限公司）；自制直徑18 mm 打孔器；4%多聚甲醛中性組織固定液（塞維爾生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶科技有限公司）；免封閉PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%），彩虹180kd 廣譜蛋白Marker（上海翊圣生物科技有限公司）；VEGF 抗體（美國Santa cruz 公司）；EGF、TGF-β1抗體（美國affinity 公司）;β-actin 抗體（英國abcam公司）。

1.2 動(dòng)物分組與處理 50 只雄性Wistar 大鼠，體重（200±10）g，購自解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCYK（軍）2017-0023，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后建立大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)傷模型，再按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組（model control group，MC）、LED 治療組（light-emitting diode treatment group，LEDT）、紅外線治療組（infrared，IR）、紅光治療組（red light，RL）和紫外線治療組（ultraviolet，UV），每組10 只。各治療組大鼠暴露于對(duì)應(yīng)光源下照射20 min，模型對(duì)照組大鼠放入治療儀但不通電，2 次/d。其中，LEDT 由IR、RL 及UV 三種光源的混合光組成，具體光源參數(shù)見表1。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審批編號(hào)：2020KYLL128。

表1 LED 多波段光譜治療參數(shù)

1.3 造模方法 按照趙京禹等[9]的方法建立大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面模型。大鼠麻醉后將背部剃毛，面積約7 cm×5 cm，在后背中部脊柱兩側(cè)各旁開1 cm，距肩胛骨以下2 cm 處使用直徑18 mm 的圓鉆垂直于皮膚壓出圓形痕跡（面積2.54 cm2），再使用手術(shù)剪沿壓痕剪去全層皮膚，深達(dá)筋膜層，紗布?jí)浩戎寡獋溆?。每只大鼠制? 個(gè)創(chuàng)面，由于皮膚的牽拉，造模后創(chuàng)面的面積約為3.675 cm2。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 創(chuàng)面面積測(cè)量 在創(chuàng)傷造模后的即刻及干預(yù)的第3、7、14 天后，將大鼠麻醉，在固定的高度與角度下對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照記錄。利用Photoshop 裁剪圖片，利用Image-Pro Plus 對(duì)創(chuàng)面面積進(jìn)行計(jì)算。創(chuàng)面愈合率=（初始面積-當(dāng)日面積）/初始面積×100%。

1.4.2 組織病理學(xué)檢測(cè) 治療第3、7、14 天后，隨機(jī)從各組中取3 只大鼠，將創(chuàng)面剪下，置于4%多聚甲醛中性組織固定液中固定48 h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，以及HE 染色處理。將制作好的切片置于病理切片掃描儀下觀察組織病理病理學(xué)變化。

1.4.3 蛋白免疫印跡 治療第14 天后，對(duì)創(chuàng)面中表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）以及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)從各組中取3 只大鼠，將創(chuàng)面剪下，液氮冷凍后置于組織研磨儀中研磨3 次，90 s/次，研磨后按比例加入高效組織蛋白裂解液冰上裂解30 min，裂解完成后12 000 r/min離心30 min，收集上清液放置于冷凍工作站。使用BCA 法檢測(cè)樣品中蛋白濃度，完成蛋白定量檢測(cè)后加熱變性，-80 ℃保存。檢測(cè)時(shí)應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒配置10%的分離膠和5%濃縮膠，待其凝固后取5 μl 變性蛋白上樣，電泳完成后使用干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，按照抗體說明在對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜，次日，復(fù)溫1 h 后使用TBST 清洗5 次，10 min/次。二抗按照來源不同分別使用山羊抗兔與山羊抗鼠，按照1∶10 000 稀釋，將按照屬性對(duì)應(yīng)加入蛋白孵育盒中，搖床震蕩孵育2 h 后，使用TBST 溶液清洗，清洗完成后進(jìn)行曝光。利用Photoshop 軟件統(tǒng)一裁剪條帶，Image J 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠創(chuàng)面愈合率比較 隨著時(shí)間延長，各組大鼠創(chuàng)面逐漸愈合。治療第3 天，各組大鼠創(chuàng)面均已結(jié)痂（圖1A），其中LEDT 組、IR 組、RL 組和UV 組創(chuàng)面愈合率高于MC 組（P＜0.05，圖1B）；治療第7 天，LEDT 組、IR 組、RL 組創(chuàng)面愈合率均高于MC 組（P＜0.05），但UV 組與MC 組創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1C）；治療第14 天，LEDT 組、IR 組、RL 組和UV 組創(chuàng)面愈合率高于MC 組（P＜0.05），其中RL 組的愈合率最高（圖1D）。

圖1 LED 多波段光譜治療對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響

2.2 創(chuàng)面HE 染色結(jié)果 治療第3 天，各組大鼠創(chuàng)面均有結(jié)痂覆蓋創(chuàng)面，創(chuàng)面可見大量炎性細(xì)胞浸潤；治療7 天后可見表皮層明顯增厚，LEDT 組、IR 組、RL組和UV 組的炎性細(xì)胞已逐漸減少，成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞逐漸增多，角質(zhì)形成細(xì)胞由圓形變?yōu)殚L條形增生活躍，而MC 組的炎性細(xì)胞較多，成纖維細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少；治療14 天后，LEDT 組、IR 組、RL 組和UV 組的創(chuàng)面已經(jīng)由再上皮化組織覆蓋整個(gè)創(chuàng)面，可見新生毛囊結(jié)構(gòu)，MC 組部分再上皮化組織不連續(xù)，再生不完全，見圖2。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)HE 染色結(jié)果比較

2.3 各組大鼠創(chuàng)面EGF、TGF-β1、VEGF 表達(dá)水平比較 治療第14 天后，LEDT 組、IR 組、RL 組和UV 組EGF、VEGF、TGF-β1表達(dá)量均高于MC 組（P＜0.01），但LEDT 與IR 組TGF-β1比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 LED 多波段光譜治療對(duì)大鼠創(chuàng)面EGF、TGF-β1、VEGF 表達(dá)水平的影響

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過程，主要包括炎癥期、增生期和重塑期，這幾個(gè)過程相互重疊，其中任何一個(gè)過程異?；驎r(shí)間延長均會(huì)導(dǎo)致傷口愈合的延遲。創(chuàng)傷早期傷口局部組織遭到破壞，多伴有組織壞死和血管的破裂，短時(shí)間即會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。創(chuàng)傷早期組織主要以炎癥細(xì)胞為主，有利于異物及壞死組織的吞噬，同時(shí)傷口中的血液和滲出液中的纖維蛋白原形成凝塊，在創(chuàng)傷表面結(jié)痂，能夠?qū)谄鸬奖Ｗo(hù)作用。炎癥反應(yīng)后成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞在損傷部位大量增多，創(chuàng)面由新生的肉芽組織逐漸覆蓋，同時(shí)傷口邊緣新生的肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生牽拉作用，引起傷口的收縮，加快創(chuàng)面的修復(fù)。肉芽組織表面則由角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增生為主的表皮，通過再上皮化進(jìn)程覆蓋肉芽組織進(jìn)而完成組織的修復(fù)。創(chuàng)面完全覆蓋后，幼稚肉芽組織逐漸經(jīng)過組織改建轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織，而后還會(huì)經(jīng)過較為漫長組織改建的過程，即組織重塑期[10]。

隨著現(xiàn)代光醫(yī)學(xué)的發(fā)展，PBMT 的應(yīng)用越來越廣泛，研究證明PBMT 具有減輕炎癥反應(yīng)、降低疼痛、增加循環(huán)血量及促進(jìn)組織修復(fù)等多種治療作用，在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛[11，12]。本研究所使用的LED 多波段光譜治療儀具有IR、RL 及UV三種光源，研究表明[13，14]，IR 與RL 能夠提升傷口溫度、減輕疼痛、促進(jìn)傷口愈合，UV 能夠刺激新生組織的生長，提高局部血液循環(huán)和供氧，降低水腫，抑制細(xì)菌生長。通過比較各組大鼠創(chuàng)面愈合率可以看出，LEDT、IR、RL 及UV 組治療第3 天后創(chuàng)面愈合率高于MC 組，治療第14 天后愈合率更高，說明LED 多波段光譜治療能夠有效促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合。通過比較HE 染色結(jié)果可以看出，LED 多波段光譜治療能夠減輕大鼠創(chuàng)面早期的炎癥反應(yīng)，并且能夠促進(jìn)再上皮化的進(jìn)程，從而加速創(chuàng)面的愈合。

EGF 作為一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，具有提高細(xì)胞再生能力，加快表皮生長的作用[15]。TGF-β1是促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖和趨化的重要的生長因子，并且有研究發(fā)現(xiàn)[16]，TGF-β1能夠加速愈合初期上皮細(xì)胞的增殖。VEGF 是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，是促進(jìn)血管生成的直接相關(guān)因子[17]。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LEDT 組、IR 組、RL 組 和UV 組 治 療 第14 天 后EGF、VEGF、TGF-β1表達(dá)量均高于MC 組（P＜0.01），但LEDT 與IR 組TGF-β1比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示LED 多波段光譜治療能夠有效促進(jìn)大鼠創(chuàng)面中相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)創(chuàng)面愈合起到有效的促進(jìn)作用。

綜上所述，LED 多波段光譜治療能夠有效提高大鼠創(chuàng)面各個(gè)階段的愈合率，促進(jìn)皮膚再上皮化進(jìn)程，提高創(chuàng)面中EGF、TGF-β1及VEGF 蛋白表達(dá)水平。