腎安方對慢性腎臟病大鼠EGFR介導(dǎo)的PI3K/Akt通路的影響

宋 堅，王旭東，劉宏斌，曹興建

（1.南通市第一人民醫(yī)院，江蘇 南通 226000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046）

腎纖維化是晚期腎病的常見病理特征，是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）進(jìn)展為終末期腎衰竭（end stage renal disease，ESRD）最可靠的預(yù)測指標(biāo)。腎安方是以脾腎雙補，調(diào)和氣血陰陽，泄?jié)嵬ńj(luò)為治法治療慢性腎臟病的經(jīng)驗方。前期臨床試驗[1-2]已證實腎安方可以保護(hù)慢性腎臟病患者殘余腎單位，減緩腎臟纖維化，延緩慢性腎臟病的進(jìn)程。本實驗旨以EGFR/PI3K/Akt為靶點，探討腎安方干預(yù)CKD腎臟纖維化的機制作用，為腎安方的臨床運用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡健康雄性SPF級SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0001。飼養(yǎng)于南通大學(xué)實驗動物中心。動物實驗室為清潔級，環(huán)境溫度（21±3）℃，相對濕度60%～70%，12 h明暗循環(huán)；實驗大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。動物倫理經(jīng)南通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)，動物倫理編號：S20200522-408。實驗過程嚴(yán)格遵守動物福利與倫理原則。

1.2 藥品與試劑 腎安方，方藥組成：黃芪30 g，茯神20 g，炒白術(shù)15 g，六月雪30 g，生大黃10 g，川牛膝10 g，太子參15 g，豬苓20 g，澤瀉15 g，車前子30 g，益母草20 g，南沙參15 g，丹參30 g，全瓜蔞15 g。黃芪（批號：211130）、茯神（批號：211215）、炒白術(shù)（批號：211116）、六月雪（批號：200201）、生大黃（批號：211012）、川牛膝（批號：210601）、太子參（批號：211110）、豬苓（批號：210514）、澤瀉（批號：210101）、車前子（批號：210801）、益母草（批號：210817）、南沙參（批號：210901）、丹參（批號：210121）、全瓜蔞（批號：211129）均購自華潤南通醫(yī)藥有限公司；腺嘌呤（批號：110886-200001）購自上海優(yōu)選生物技術(shù)有限公司；羥苯磺酸鈣膠囊（國藥準(zhǔn)字H20203548，規(guī)格：0.5 g/粒）購自江蘇萬高藥業(yè)股份有業(yè)公司；肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白（24 h UTP）定量均委托南通市第一人民醫(yī)院檢驗科檢驗；大鼠β2微球蛋白（β2-MG）ELISA試劑盒（批號：DS006）、大鼠甲狀旁腺激素（PTH）ELISA試劑盒（批號：a12087）均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；TNF-α ELISA試劑盒（批號：ERA56RB）、IL-6 ELISA試劑盒（批號BMS625）、TGF-β1 ELISA試劑盒（批號：BMS623-3）均購自Thermo Fisher Scientific公司；動物RNA提取試劑盒（批號：BTN71201）、RTqPCR試劑盒（批號：WE0139）均購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源Anti-EGFR一抗（批號：AF6043）、兔源Anti-p-EGFR一抗（批號：AF3052）、兔源Anti-PI3K一抗（批號：AF6241）、兔源Anti-p-PI3K一抗（批號：AF3241）、兔源Anti-Akt一抗（批號：AF6261）、兔源Anti-p-Akt一抗（批號：AF0016）、Antiβ-actin一抗（批號AF7018）、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗（批號：S0002）均購自美國Affinity公司。

1.3 主要儀器 Nano Drop 2000C型紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Allegra X-15R型離心機（美國Beckman Coulter公司）；RM2135型石蠟切片機（德國LEICA公司）；Shandon Pathcentre脫水機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CX31-32RFL光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；BMJ_B型病理組織包埋冷凍臺（常州中威電子儀器廠）；Chemi Doc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Stepone plus熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4 造模與分組 48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，逐個稱體質(zhì)量，按隨機數(shù)字表法分為正常組12只，造模組36只。造模組大鼠按250 mg/（kg·d）劑量灌服腺嘌呤（腺嘌呤以生理鹽水配成濃度為2.5%混懸液）；正常組大鼠每日給予等體積生理鹽水（5 mL/只）灌胃，連續(xù)造模4周。在第29天，正常組隨機取大鼠2只，造模組隨機取大鼠6只，腹腔注射硫噴妥鈉（200mg/kg）處死大鼠，取全血標(biāo)本，檢驗BUN、Scr，取左腎制作病理切片。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：（1）BUN、Scr較正常組明顯升高；（2）光鏡下見造模組大鼠腎組織纖維化，有炎癥細(xì)胞浸潤。

造模成功后，造模大鼠繼續(xù)隔天灌胃給予250 mg/（kg·d）腺嘌呤混懸液以維持病程進(jìn)展至第8周。在此期間將造模成功的30只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、羥苯磺酸鈣組、腎安方組，每組10只。

1.5 實驗給藥 按照體表面積換算，腎安方組大鼠給予腎安方灌胃，24.1 g/（kg·d）（相當(dāng)于臨床70 kg成年人等效劑量）；羥苯磺酸鈣組大鼠給予羥苯磺酸鈣灌胃，100 mg/（kg·d）；正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)給藥4周。實驗過程中，模型組大鼠死亡1只。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 生化指標(biāo) 第8周末禁食不禁水24 h，代謝籠收集大鼠24 h尿液；腹腔注射硫噴妥鈉（200 mg/kg）處死大鼠，取全血標(biāo)本，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心3 min，分離出血清。使用生化分析儀檢測大鼠血清BUN、Scr、24 h UTP。β2-MG、PTH、TNF-α、IL-6、TGF-β1按試劑盒說明以ELISA法測定。

1.6.2 腎臟病理學(xué)觀察 取各組大鼠左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、組織用石蠟包埋，切成4 μm厚石蠟切片，分別行HE、Masson染色。

腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)測定：在高倍鏡（×200）下隨機選取10個不重疊視野測定小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比，進(jìn)行半定量評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：無病變，計0分；≤25，計1分；26～50，計2分，＞50，計3分。每張切片取10個視野的平均積分，計算各組的平均值。

1.6.3 各組大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平比較 取剩余適量腎組織，采用Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR反應(yīng)條件為：45 ℃10 min，95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃45 s，40個循環(huán)。采用實時熒光定量PCR得到EGFR、PI3K、Akt擴(kuò)增曲線與熔解曲線，記錄Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.4 各組大鼠腎組織EGFR、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平比較 取各組大鼠腎組織，加入RIPA裂解液提取蛋白，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，加入5%BSA封閉1.5 h，分別加入β-actin、EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖液（TBST）洗膜重復(fù)3次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，ECL試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計算灰度值，采用目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 通過GraphPad Prism 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（）表示，方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

2.1.1 各組大鼠血清BUN、Scr含量比較 模型組大鼠血清BUN、Scr含量均明顯高于正常組（P＜0.01）；腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠血清BUN、Scr含量均明顯低于模型組（P＜0.05）；腎安方組大鼠血清BUN、Scr含量均明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠血清BUN、Scr 含量比較（）

2.1.2 各組大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平比較 模型組大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明顯低于模型組（P＜0.05）；腎安方組大鼠血清PTH、β2-MG、24 h UTP水平均明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠血清PTH、β2-MG、24h UTP 水平比較（）

2.1.3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量比較 模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明顯高于正常組（P＜0.01）；腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明顯低于模型組（P＜0.05）；腎安方組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1含量均明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1 含量比較（）

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變情況 正常組大鼠腎組織可見腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清楚，腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤，無纖維組織增生。模型組大鼠腎組織可見腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，系膜增生，腎小球周圍纖維化；腎小管管腔擴(kuò)張明顯，腎小管纖維化，管徑縮窄；腎間質(zhì)水腫，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分腎間質(zhì)纖維化。腎安方組大鼠腎組織可見腎小球病變程度較模型組明顯減輕，有系膜增生，腎小球呈局灶節(jié)段性硬化，部分腎小管上皮細(xì)胞混濁腫脹，管徑變小，部分腎小管擴(kuò)張；腎間質(zhì)水腫，有炎癥細(xì)胞浸潤。羥苯磺酸鈣組大鼠腎組織可見腎小球結(jié)構(gòu)清晰，有系膜增生，腎小球未見明顯萎縮；腎小管管腔未見明顯擴(kuò)張，部分腎小管上皮細(xì)胞略腫脹，管徑稍窄；腎間質(zhì)輕度水腫，可見局灶性炎癥細(xì)胞浸潤。（見圖4）

Masson染色結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟纖維化指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠腎臟纖維化指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；腎安方組大鼠腎臟纖維化指數(shù)明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖4～5）

圖4 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變情況（×200）

圖5 各組大鼠腎臟纖維化指數(shù)比較（）

2.3 各組大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平比較 模型組大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達(dá)量均明顯高于正常組（P＜0.01）；腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組（P＜0.05）；腎安方組大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達(dá)量均明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組大鼠腎組織EGFR mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA 相對表達(dá)量比較（）

2.4 各組大鼠腎組織EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠腎組織p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明顯高于正常組（P＜0.01）；腎安方組、羥苯磺酸鈣組大鼠腎組織p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明顯低于模型組（P＜0.05）；腎安方組大鼠腎組織p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K均明顯低于羥苯磺酸鈣組（P＜0.05）。（見圖7～8）

圖7 各組大鼠腎組織EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白相對表達(dá)量比較（）

圖8 各組大鼠腎組織EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

3 討論

慢性腎臟病臨床上常見水腫、惡心嘔吐、乏力、食欲不振、小便不通等癥狀，在中醫(yī)學(xué)中屬于“水腫”“關(guān)格”“虛勞”“溺毒”等范疇。國醫(yī)大師鄒燕勤繼承并發(fā)展其父鄒云翔理論，認(rèn)為慢性腎衰竭的病機為腎元衰竭，濁毒潴留[3]。由于腎元衰竭、濁毒潴留而致腎臟纖維化不斷進(jìn)展。南通市名中醫(yī)王旭東在此理論基礎(chǔ)上，結(jié)合三十余年的臨床經(jīng)驗總結(jié)出脾腎雙補、調(diào)節(jié)氣血陰陽佐以泄?jié)岬闹委煷蠓?，并擬定腎安方。方中取大黃通利腸腑，使邪毒從腸道而走；以茯苓、豬苓、車前子、澤瀉利水滲濕，使邪毒從小便排解而出；佐以黃芪健脾行氣、利水消腫，六月雪、益母草、丹參、川牛膝等活血化瘀、利水消腫；太子參、南沙參清熱養(yǎng)陰，利水而不傷陰；全瓜蔞清熱潤燥滑腸。諸藥相合以達(dá)益氣健脾、固本培腎、調(diào)和氣血陰陽、泄?jié)峤舛局Α?/p>

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，大黃中的有效成分包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚[4]。其中大黃素可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF/PDGFR-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，逆轉(zhuǎn)腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡以抗腎臟纖維化[5]。黃芪的有效成分包括黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪類黃酮等[6]。黃芪多糖可通過抑制TGF-β1/ILK途徑來抑制炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程，從而保護(hù)腎功能[7]。丹參的主要有效成分丹參酮含有超過50種化合物，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡB，以及水溶性化合物丹酚酸A、丹酚酸B和丹參醇等[8]。丹參酮ⅡA和丹酚酸可以激活A(yù)kt/GSK-3β/Nrf2信號通路，上調(diào)BMP-7和Smad6，抑制NF-κB/p38/MAPK和TGF-β/Smad信號通路，從而減輕氧化應(yīng)激和炎癥[9-10]；丹酚酸B可以通過HPSE/SDC1軸減輕腎損傷[11]。

羥苯磺酸鈣為微血管保護(hù)藥物，是較為公認(rèn)的能直接用于預(yù)防和治療微血管循環(huán)障礙的藥物，能夠抗炎、抗氧化、改善內(nèi)皮功能紊亂、抑制纖維組織和新生血管增生，并可以通過減少足細(xì)胞融合來減輕蛋白尿，從而保護(hù)腎臟，因此本實驗以羥苯磺酸鈣為陽性對照藥物[12-13]。

表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR），是一種多功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子，在細(xì)胞增殖、存活、分化、遷移、炎癥等細(xì)胞過程和基質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[14]。EGFR可能通過激活多種信號通路，特別是PI3K/Akt/mTOR信號通路介導(dǎo)器官纖維化，尤其是腎臟纖維化[15-16]。過量的EGFR通過增加TGF-β1的表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β信號的激活，誘導(dǎo)腎纖維化，促進(jìn)上皮細(xì)胞G2/M阻滯，并增強炎癥細(xì)胞因子或化學(xué)激酶的產(chǎn)生[17-19]。PI3K/Akt信號通路是一條經(jīng)典的信號傳導(dǎo)途徑，它們參與了細(xì)胞的存活與凋亡、增殖與分化等多種生理病理過程。研究證明，在缺氧誘導(dǎo)的腎臟纖維化實驗中，PI3K/Akt通路激活與腎臟纖維化進(jìn)程密切相關(guān)，抑制PI3K活化可減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積累，而抑制Akt則可降低梗阻性腎病的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物[17,20]。本實驗結(jié)果顯示腺嘌呤所致的慢性腎臟病模型大鼠腎臟纖維化與EGFR激活的PI3K/Akt信號通路過度活化相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示羥苯磺酸鈣與腎安方均可抑制EGFR磷酸化，從而抑制PI3K/Akt通路的激活，減少TGF-β1的含量；且腎安方較羥苯磺酸鈣的作用更為明顯。

炎癥細(xì)胞是纖維化微環(huán)境的重要組成部分。腎臟損傷后持續(xù)存在的炎癥促進(jìn)了纖維化的發(fā)生發(fā)展；如巨噬細(xì)胞激活M1型在損傷早期釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，導(dǎo)致組織損傷和腎臟纖維化的發(fā)生；隨著腎臟損傷加重，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型，通過產(chǎn)生并分泌TGF-β1、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF-2）等細(xì)胞因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化及ECM產(chǎn)生[21]。其中TGF-β1是腎纖維化的關(guān)鍵因子，可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞活化，導(dǎo)致多種ECM成分沉積于腎小球，減少ECM的降解，導(dǎo)致腎臟進(jìn)行性纖維化改變[22-23]。因此，抑制炎癥因子活性能緩解腎臟纖維化進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，羥苯磺酸鈣和腎安方均能減輕慢性腎臟病大鼠炎癥反應(yīng)，二者相比，腎安方具有更明確的療效。

由此可見，腎安方能夠減輕慢性腎臟病大鼠的腎臟纖維化進(jìn)程，可能與以下幾種原因有關(guān)：（1）通過腸道排毒減少血液中的各種毒素，包括尿素氮、肌酐、甲狀旁腺激素等；（2）減少尿蛋白排泄，維持血液蛋白含量，提高機體免疫力；（3）減輕血管微炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子釋放，減少進(jìn)一步的免疫反應(yīng)；（4）抑制EGFR磷酸化，從而抑制PI3K/Akt通路的激活，減少TGF-β1的含量。

綜上，腎安方可以減少慢性腎臟病大鼠血液中各種毒素，減少蛋白尿，減輕腎臟炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎臟；其延緩腎臟纖維化進(jìn)程可能與抑制EGFR磷酸化，抑制PI3K/Akt通路的激活有關(guān)。