湖北擬酵母發(fā)酵制備甘露糖赤蘚糖醇脂的研究

朱年青，贠雪，申小倩，徐佳慧，李澤宇，夏文靜

（1.泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.南京師范大學(xué)泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

甘露糖赤蘚糖醇脂不僅具備作為表面活性劑優(yōu)良的界面特性，而且還具有多功能的生物活性，如對人類白血病、大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤和小鼠黑色素瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)；對不同的免疫球蛋白和凝集素也表現(xiàn)出很高的結(jié)合親和力[1]。甘露糖赤蘚糖醇脂（MELs）包含4-O-β-D-甘露糖基赤蘚糖醇或1-O-β-D-甘露糖基赤蘚糖醇作為親水基團(tuán)，脂肪酸作為疏水鏈，是由假絲酵母屬菌株大量產(chǎn)生的功能性糖脂[2]。其中，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂和二乙?；母事短浅嗵\糖醇脂，能夠提高陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的效率。此外，甘露糖赤蘚糖醇脂具有抗炎作用，能夠抑制肥大細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，這使得甘露糖赤蘚糖醇脂在化妝品、醫(yī)藥等方面具有廣泛應(yīng)用價值。

甘露糖赤蘚糖醇脂包括4 種不同的結(jié)構(gòu)[3]。其中，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上含有2 個乙?；珺 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上C-6 位含有1 個乙?；珻 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上C-4 位含有1 個乙酰基，D 型甘露糖赤蘚糖醇脂中甘露糖上不含乙?；?。甘露糖赤蘚糖醇脂的界面性能和自組裝性能的研究表明，分子結(jié)構(gòu)（包括乙?；臄?shù)量）的微小差異，會導(dǎo)致臨界膠束濃度（CMC）的顯著差異和液晶相的形成[4]。A 型甘露糖赤蘚糖醇脂在處理水溶液方面存在缺陷，因為它的水溶性和親水性很低，限制了其實際應(yīng)用。另一方面，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂的脫乙酰衍生物B 型和C 型比A 型具有更高的親水性和臨界膠束濃度[5]，使得它們在油包水型乳化劑和/或洗滌劑中具有極大的優(yōu)越性，在環(huán)保、日化、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注。有關(guān)學(xué)者報道了非對映體B 型甘露糖赤蘚糖醇脂的水相行為，其在非常寬的濃度和溫度范圍內(nèi)自發(fā)組裝成層狀相，并在低濃度下形成相對較大的囊泡（1～5 μm）[6]。這些結(jié)果表明，非對映體B 型甘露糖赤蘚糖醇脂作為囊泡形成脂質(zhì)具有巨大的潛力，在藥物和基因傳遞等方面有很大的應(yīng)用需求。同時，由于中心位紅糖醇部分的獨(dú)特構(gòu)型，非對映體糖脂表現(xiàn)出更優(yōu)越的護(hù)膚性 能。

鑒于此，本文從三個方面研究湖北擬酵母發(fā)酵合成B 形甘露糖赤蘚糖醇脂的影響因素，分別是：（1）橄欖油、玉米油、大豆油和花生油四種碳源對甘露糖赤蘚糖醇脂產(chǎn)量的影響；（2）酵母提取物、麥芽提取物、玉米浸粉和蛋白胨四種有機(jī)氮源對甘露糖赤蘚糖醇脂產(chǎn)量的影響；（3）在氮源總量不變的情況下，無機(jī)氮源硝酸鈉與有機(jī)氮源酵母提取物之間的配比對甘露糖赤蘚糖醇脂產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

湖北擬酵母（Pseudozyma Tsukubaensis）購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵

（1）YM 活化培養(yǎng)基（g/L）：麥芽汁提取物3.0、酵母提取物3.0、蛋白胨5.0、葡萄糖10.0、瓊脂20.0。配制后121 ℃滅菌20 min，適溫倒平板，無菌環(huán)境下操作。

（2）液體種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物3.0、麥芽汁提取物3.0、葡萄糖10.0、蛋白胨5.0、（pH 值6.0）。配制后按10 mL/瓶（100 mL 三角瓶）分裝，121 ℃滅菌20 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ（g/L）：酵母提取物3.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、碳源種類和添加量根據(jù)試驗設(shè)計進(jìn)行，pH 值為6.0。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）進(jìn)行分裝，121 ℃滅菌20 min。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ（g/L）：橄欖油120.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、有機(jī)氮源種類和添加量根據(jù)試驗設(shè)計進(jìn)行，（pH 值6.0）。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）分裝，121 ℃滅菌20 min。

將4 ℃斜面保藏的菌種通過平板劃線法轉(zhuǎn)接于YM 活化培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d；于平板上挑取單菌落于10 mL 液體種子培養(yǎng)基中，25 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)24 h；將種子培養(yǎng)液混勻，按照4%（V/ V）的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)7 天。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 不同碳源植物油對湖北擬酵母合成MELs 的影響

選取橄欖油、玉米油、大豆油和花生油作為湖北擬酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的的碳源，加入量為120 g/L，每組各設(shè)置3 個平行組。將活化好的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，對比發(fā)酵7 天后MELs 的產(chǎn)量。確定最優(yōu)碳源后，將最優(yōu)碳源分別按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 的加入量添加至于發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，并編號為A、B、C、D 組，每組各3 個平行組。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產(chǎn)量。

1.2.2 不同有機(jī)氮源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

實驗分別選取酵母提取物、麥芽浸粉、玉米浸粉和蛋白胨作為湖北擬酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，加入量均為3 g/L，并編號A、B、C、D 組，每組各設(shè)置3 個平行組。將活化好的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中，對比發(fā)酵7 天后MELs 的生物合成產(chǎn)量。

確定最優(yōu)氮源后，針對最優(yōu)氮源分別按照1.0 g/ L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 的加入量添加至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中，并編號為A、B、C、D 組，每組各3 個平行組。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產(chǎn)量。

1.2.3 氮源復(fù)配對湖北擬酵母合成MELs 的影響

為進(jìn)一步研究無機(jī)氮源和有機(jī)氮源組合對MELs發(fā)酵的影響，將硝酸鈉和酵母提取物進(jìn)行了復(fù)配。保持氮源的總添加量不變，調(diào)整兩種組分的含量，編號為A，B，C，D 和E，分別加入4.0 g/L 酵母提取物、3.0 g/L 酵母提取物+1.0 g/L NaNO3、2.0 g/L 酵母提取物+2.0 g/L NaNO3、1.0 g/L 酵母提取物+3.0 g/L NaNO3、4.0 g/L NaNO3。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產(chǎn)量。

1.3 甘露糖赤蘚糖醇脂定量分析

甘露糖赤蘚糖醇脂利用Agilent 1100 HPLC檢測。色譜柱型號為Inertsil SIL 100A（5 μm，4.6 mm×250 mm），檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

固定除碳源以外的其他成分，A 組、B 組、C 組、D 組分別加入等量的不同碳源物質(zhì)，發(fā)酵7d 后，測定各組所產(chǎn)MELs 的量。結(jié)果如表1所示：四種碳源中，添加橄欖油為碳源時，MELs 產(chǎn)量最高，可達(dá)50 g/L，可能是橄欖油的脂肪酸的組成更適合MELs的合成。

表1 不同種類碳源對MELs 合成的影響Tab.1 Effects of different carbon sources on MELs production

橄欖油是最合適的碳源，繼而進(jìn)一步探究該碳源的最適加入量，在其他成分相同的情況下，A 組、B 組、C 組、D 組分別按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 添加量，將橄欖油加入培養(yǎng)基中，發(fā)酵7d 后，測定各組MELs 產(chǎn)量。結(jié)果如表2所示：4 個濃度中，120 g/L 的橄欖油添加量最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)MELs，產(chǎn)量可達(dá)52 g/L，當(dāng)橄欖油濃度高于120 g/L，則會抑制菌株代謝油脂合成MELs。

表2 橄欖油濃度對MELs 合成的影響Tab.2 Effects of olive oil concentration on MELs production

2.2 不同氮源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

固定除氮源以外的其他成分，A 組、B 組、C 組、D 組分別加入等量的不同的氮源物質(zhì)，發(fā)酵7 d 后，測定各組所產(chǎn)MELs 的量。結(jié)果如表3所示：4 種氮源中，添加酵母提取物為氮源時，MELs 產(chǎn)量最高可達(dá)50 g/L，可見酵母提取物中的維生素、生長因子等成分能顯著促進(jìn)MELs 的合成。

表3 不同種類氮源對MELs 合成的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on MELs production

通過實驗設(shè)計發(fā)現(xiàn)酵母提取物是最合適的氮源，為進(jìn)一步探究該氮源的最適加入量，在其他成分相同的情況下，A 組、B 組、C 組、D 組分別按照1.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 添加量，將酵母提取物加入培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d 后，測定各組MELs 產(chǎn)量。結(jié)果表4所示：4 個濃度中，3 g/L 的酵母提取物添加量最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)MELs，產(chǎn)量可達(dá)52 g/L。

表4 酵母提取物濃度對MELs 合成的影響Tab.4 Effects of yeast extract concentration on MELs production

2.3 氮源復(fù)配對湖北擬酵母合成MELs 的影響

為進(jìn)一步研究無機(jī)氮源和有機(jī)氮源組合對MELs發(fā)酵的影響，將硝酸鈉和酵母提取物進(jìn)行了復(fù)配。保持氮源的總添加量不變，對比A，B，C，D 和E 五個組合發(fā)酵7 天后MELs 的產(chǎn)量。結(jié)果如表5所示：當(dāng)?shù)磁浔葹锽 組合：1 g/L NaNO3+3 g/L 酵母提取物，即無機(jī)氮源/有機(jī)氮源=1/3 時，最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)MELs，產(chǎn)量可達(dá)55 g/L。無機(jī)氮源有利于MELs 的合成，有機(jī)氮源有利于菌體的生長，當(dāng)兩種氮源比例合適時，菌株才能夠生長并高效合成MELs。

表5 不同氮源復(fù)配比例對MELs 合成的影響Tab.5 Effects of different ratios of nitrogen sources on MELs production

3 結(jié)論與討論

本研究以湖北擬酵母為發(fā)酵菌株，探究不同碳源、有機(jī)氮源及二者的添加量對微生物合成MELs 的影響。結(jié)果表明碳源中橄欖油更有利于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs，而有機(jī)氮源中酵母提取物更有利于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs。在選取硝酸鈉和酵母提取粉進(jìn)行復(fù)配的實驗中發(fā)現(xiàn)：以3.0 g/L 酵母提取物和1.0 g/L 硝酸鈉組合時，最適合于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs。湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs 的最優(yōu)培養(yǎng)基組成成分為：橄欖油120 g/L、酵母提取物3.0 g/ L、NaNO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.30 g/L、KH2PO40.30 g/ L，此條件下湖北擬酵母發(fā)酵7 d 后MELs 產(chǎn)量可達(dá)55 g/L。