氟比洛芬酯脂微球注射液的制備及不同蛋黃卵磷脂對(duì)其影響

單騰騰，潘海群，禹玉洪*

(1山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，晉中 030600；2北京鑫開(kāi)元醫(yī)藥科技有限公司；*通訊作者,E-mail:3024546064@qq.com)

乳劑是兩種不相混溶的液體在表面活性劑的作用下，經(jīng)超聲、均質(zhì)、高速剪切等方法形成的多分散體系[1]。由脂質(zhì)、卵磷脂等制備得到的納米級(jí)粒子稱作脂質(zhì)微球，也被稱作為脂微乳，最早主要用于為不能在正常飲食中獲得足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的患者提供能量，通常脂質(zhì)微球包括內(nèi)部油相和油相與水相的界層，疏水性藥物可被包裹在內(nèi)部的油相或油水分界層中。納米乳具有粒徑小，分散均勻度高，藥物分散度高，能提高藥物生物利用度，或改變藥物的組織分布的靶向性；同時(shí)對(duì)藥物透皮吸收也有促進(jìn)作用[2]。

氟比洛芬酯屬于非甾體抗炎藥物的一種，有止痛、抗炎以及解熱作用，臨床應(yīng)用廣泛，其氟比洛芬酯注射液主要用于術(shù)后及癌癥的鎮(zhèn)痛[3]。氟比洛芬酯脂微球注射液則是由脂微球和其所包裹的氟比洛芬酯組成的注射液，脂微球使藥物易于跨越細(xì)胞膜，加快藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，縮短起效時(shí)間[4]，且藥物進(jìn)入體內(nèi)能靶向分布于創(chuàng)傷及腫瘤部位[5]，氟比洛芬酯從脂微球中釋放出來(lái)在羧基酸酶的作用下，迅速水解成氟比洛芬，通過(guò)氟比洛芬抑制前列腺素的合成而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6]。

在治療術(shù)后疼痛或因癌癥引起的疼痛時(shí)，與口服制劑相比，氟比洛芬酯脂微球注射液可避免服用不方便和口服引起的不良反應(yīng)，并且起效更快。本文對(duì)氟比洛芬酯脂微球注射液的處方與生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，為氟比洛芬酯脂微球注射液的深入研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并且能夠適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

十萬(wàn)分之一電子天平(BSA3202S，賽多利斯公司)；百萬(wàn)分之一分析天平(BSA223S，賽多利斯公司)；pH計(jì)(FE28，梅特勒-托利多公司)；磁力攪拌器(RCT basic，IKA)；高剪切分散乳化機(jī)型號(hào)(T25，IKA)；納米均質(zhì)機(jī)(AH-1500，安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司)；小型臺(tái)式低溫冷卻水循環(huán)泵(XHDL-20，廣州市予華儀器有限公司)；醫(yī)用離心機(jī)(TGA-16A，湖南平凡科技有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2600，島津)；納米粒度電位儀(Zetasizer Nano-ZS90，英國(guó)Malvern公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-3OR，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；高效液相色譜儀(S02-HPLC-33，島津)；色譜柱(NX-C18，phenomenex)；循環(huán)水真空泵(S02-ZSB-10，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑與試藥

注射用氟比洛芬酯(20210619，南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司)；含量測(cè)定用氟比洛芬酯對(duì)照品(100696-202003，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；注射用大豆油(20210901，浙江田雨山藥用油有限公司)；蛋黃卵磷脂E80 ST(512320-2190001-01，Lipoid)；9種蛋黃卵磷脂磷脂酰膽堿含量70%，80%，98%各3種(含量數(shù)據(jù)由廠家的質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告提供)；注射用泊洛沙姆-188(GNE32721B，Basf)；注射用甘油(20210306，浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司)；水合磷酸氫二鈉(210201，四川金山制藥有限公司)；枸櫞酸(210101，四川金山制藥有限公司)；注射用油酸(20210801K，南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；乙腈(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；冰乙酸(分析純，天津市大茂試劑廠)；無(wú)水乙醇(色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 氟比洛芬酯脂微球注射液的制劑工藝

2.1.1 氟比洛芬酯脂微球注射液的處方篩選 氟比洛芬酯脂微球注射液的油相處方包括氟比洛芬酯、大豆油和油酸。水相處方包括甘油、蛋黃卵磷脂、泊洛沙姆188(F68)、水合磷酸氫二鈉和水。油相配制溫度以60～70 ℃為宜。蛋黃卵磷脂呈顆粒、黏稠狀，磷脂的加入方式通常有兩種：分散于水相中或溶解于油相中。本試驗(yàn)采用將蛋黃卵磷脂加于水中制備乳劑。

氟比洛芬酯脂微球注射液的處方優(yōu)化：采用正交試驗(yàn)法，以卵磷脂用量(1.0，1.2，1.4 g)、初乳pH值(7.0，8.0，9.0)、大豆油加入量(8.0，10.0，12.0 g)，泊洛沙姆188用量(0，0.3，0.6 g)為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以離心穩(wěn)定常數(shù)Ke為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

穩(wěn)定性常數(shù)(Ke)的測(cè)定：采用離心-光譜法測(cè)定Ke，以評(píng)價(jià)脂微球的穩(wěn)定性[7]，Ke越小，乳劑越穩(wěn)定[8]。取乳劑3 ml，4 000 r/min，離心15 min，取下層液50 μl，用水稀釋至10 ml，以水為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，取未離心乳劑50 μl，同法稀釋后測(cè)定吸光度A0，按Ke=(A0-A)/A0×100%，計(jì)算Ke。處方篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。結(jié)果分析：4個(gè)因素的主次關(guān)系為：C>D>B>A，以極差最小的因素A作為誤差來(lái)源，進(jìn)行方差分析，結(jié)果因素C、D差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而因素B不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處方篩選的最佳組合為A1B3C2D3，即蛋黃卵磷脂1.0 g，初乳pH=9，大豆油10.0 g，F(xiàn)68加入量0.6 g；次佳組合為A1B3C1D3，即蛋黃卵磷脂1.0 g，初乳pH=9，大豆油8.0 g，F(xiàn)68加入量0.6 g。大豆油加入量C1、C2的Ke均值分別為0.116和0.113，二者的Ke均值僅相差2.586%，考慮到制劑處方盡可能減少輔料用量的原則，故選擇A1B3C1D3。

優(yōu)選確定的制劑處方為氟比洛芬酯1.0%，大豆油8.0%，蛋黃卵磷脂1.0%，泊洛沙姆188 0.6%，濃甘油2.2%，水合磷酸氫二鈉0.068%，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=9，油酸0.4%，加超純水適量。

2.1.2 氟比洛芬酯脂微球注射液制備工藝研究 采用正交試驗(yàn)法。以剪切時(shí)間(6，7，8 min)、均質(zhì)壓力(700，800，900 bar)、均質(zhì)次數(shù)(4，6，8次)為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，對(duì)制備工藝進(jìn)行研究，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以粒徑(size)、粒度分布、ζ電位(zeta)、離心穩(wěn)定常數(shù)Ke為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法對(duì)脂微球進(jìn)行評(píng)價(jià)?？偡諰=L1+L2+L3+L4，其中，L1為平均粒徑，L2=多分散系數(shù)(PDI)×100，L3=100+ζ電位值，L4=Ke×100，總分越小，脂微球的穩(wěn)定性越好。

表1 處方篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test results of prescription screening

表2 處方篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 2 Analysis of variance of orthogonal test results for prescription screening

使用納米粒度儀測(cè)定粒徑(size)、PDI和ζ電位(zeta)，測(cè)試溫度設(shè)定為25 ℃，每個(gè)樣品測(cè)量3次。穩(wěn)定性常數(shù)(Ke)的測(cè)定：采用離心-光譜法測(cè)定Ke，以評(píng)價(jià)脂微球的穩(wěn)定性。取乳劑3 ml，4 000 r/min，離心15 min，取下層液50 μl，用水稀釋至10 ml，以水為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，取未離心乳劑50 μl，同法稀釋后測(cè)定吸光度A0，按Ke=(A0-A)/A0×100%，計(jì)算Ke。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。制備工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。結(jié)果分析：三個(gè)因素的主次關(guān)系為：B>A>C，以空白項(xiàng)D作為誤差來(lái)源，進(jìn)行方差分析，結(jié)果因素B差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而因素A、C不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。制備工藝篩選的最佳組合為A3B3C2，即剪切時(shí)間8 min，均質(zhì)壓力1 000 bar，均質(zhì)次數(shù)6次。

最終優(yōu)選的處方及制備工藝為：稱取大豆油8 g，加熱至65 ℃，稱取氟比洛芬酯1 g，油酸0.4 g，置上述大豆油中攪拌使溶解，為油相；取水50 ml加熱至65 ℃，加入水合磷酸氫二鈉0.068 g，濃甘油2.20 g，泊洛沙姆188 0.6 g，蛋黃卵磷脂1.0 g置上述水中，攪拌使溶解，為水相；將油相與水相混合，13 000 r/min剪切8 min制得初乳，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，以水定容至100 ml，以高壓均質(zhì)機(jī)1 000 bar循環(huán)6次將所得初乳進(jìn)行精制得微乳；以0.65 μm微孔濾膜過(guò)濾；分裝，充氮，封口，121 ℃濕熱滅菌15 min，即得氟比洛芬酯脂微球注射液。

表3 制備工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal test for preparation process

表4 制備工藝篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results for preparation process screening

2.1.3 考察高溫滅菌對(duì)氟比洛芬酯脂微球注射液的影響 將制得的氟比洛芬酯脂微球注射液灌裝熔封于5 ml安瓿瓶中，選用熱壓滅菌的方式進(jìn)行滅菌，分別采用：①115 ℃滅菌15 min，②115 ℃滅菌30 min，③121 ℃滅菌8 min，④121 ℃滅菌15 min，共4個(gè)條件進(jìn)行滅菌，考察滅菌前后乳劑的外觀，測(cè)定粒徑、電位以及pH變化，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：115 ℃條件下滅菌30 min會(huì)有輕微破乳現(xiàn)象，其余滅菌條件所得注射液的差異不大，為保證滅菌效果，滅菌條件選用121 ℃，15 min。

表5 滅菌條件對(duì)乳劑的影響Table 5 Effect of sterilization conditions on emulsion

2.2 不同磷脂酰膽堿(PC)含量的蛋黃卵磷脂對(duì)氟比洛芬酯脂微球注射液質(zhì)量性能的影響

采用不同型號(hào)及不同來(lái)源的9種蛋黃卵磷脂制備氟比洛芬酯脂微球注射液，稱取大豆油8 g，加熱至65 ℃，稱取氟比洛芬酯1 g，油酸0.4 g，置上述大豆油中攪拌使溶解，為油相；取水50 ml加熱至65 ℃，加入水合磷酸氫二鈉0.068 g，濃甘油2.20 g，泊洛沙姆188為0.6 g，蛋黃卵磷脂1.0 g置上述水中，攪拌使溶解，為水相；將油相與水相混合，13 000 r/min剪切8 min制得初乳，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，以水定容至100 ml，以高壓均質(zhì)機(jī)1 000 bar循環(huán)6次將所得初乳進(jìn)行精制得微乳；以0.65 μm微孔濾膜過(guò)濾；分裝，充氮，封口，121 ℃濕熱滅菌15 min，即得氟比洛芬酯脂微球注射液。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，結(jié)果分析見(jiàn)表7。

根據(jù)表6及表7可以得出不同PC含量卵磷脂做出的脂微球注射液性能指標(biāo)pH值差異不大；以粒徑、電位、離心穩(wěn)定常數(shù)及多分散系數(shù)為指標(biāo)，PC含量為70%和80%的蛋黃卵磷脂制備的脂微球注射液質(zhì)量性能差異不大，而PC含量為98%的蛋黃卵磷脂制備的氟比洛芬酯注射液質(zhì)量性能劣于以上兩種。因此，制備氟比洛芬酯脂微球注射液，可選擇PC含量為70%～80%的蛋黃卵磷脂。

表6 不同蛋黃卵磷脂做出的脂微球注射液性能對(duì)比Table 6 Comparison of performance of lipid microsphere injection made from different egg yolk lecithin

表7 不同蛋黃卵磷脂制備的脂微球注射液性能指標(biāo)比較Table 7 Comparison of performance indexes of lipid microsphere injection made from different egg yolk lecithin

2.3 氟比洛芬酯脂微球注射液制備工藝重現(xiàn)性考察

稱取大豆油8.0%，加熱至65 ℃，稱取氟比洛芬酯1.0%，油酸0.4%，置上述大豆油中攪拌使溶解為油相；取水適量加熱至65 ℃，加入水合磷酸氫二鈉0.068%，濃甘油2.2%，泊洛沙姆188 0.6%，蛋黃卵磷脂E80 ST 1.0%置上述水中，攪拌使溶解為水相；將油相與水相混合，13 000 r/min剪切8 min，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9，用水定容得初乳。以高壓均質(zhì)機(jī)1 000 bar循環(huán)6次將所得初乳進(jìn)行精制得微乳。以0.65 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝，充氮，封口，121 ℃濕熱滅菌15 min，即得氟比洛芬酯脂微球注射液。分別以外觀、pH值、含量、電位、平均粒徑以及粒徑分布為指標(biāo)，制備3批氟比洛芬酯脂微球注射液進(jìn)行重現(xiàn)性評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以上各指標(biāo)均RSD≤2%(見(jiàn)表8)，表明此處方及制備工藝的生產(chǎn)重現(xiàn)性良好。

表8 三批氟比洛芬酯脂微球注射液處方及制備工藝重現(xiàn)性考察Table 8 Reproducibility of prescription and its preparation process of three batches of flurbiprofen axetil lipid microsphere injection

2.4 制得的氟比洛芬酯脂微球注射液穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定在4～8 ℃(25%相對(duì)濕度,25%RH)，(25±2)℃(60%RH)，(40±2)℃(75%RH)，將乳劑分裝于安瓿瓶?jī)?nèi)，滅菌，避光保存。測(cè)定氟比洛芬酯脂微球注射液在不同條件下貯存30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表9；計(jì)算各指標(biāo)在0 d測(cè)定值與30 d測(cè)定值之間變化的絕對(duì)值均值和相對(duì)值均值，結(jié)果見(jiàn)表10及表11。結(jié)果表明：氟比洛芬酯脂微球注射液在不同溫度條件下貯存30 d，溫度越高，所測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)值變化越大，總體上在25 ℃以下的條件下貯存30 d，其穩(wěn)定性良好。

表9 氟比洛芬酯脂微球注射液在不同貯存條件下的穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 9 Stability of flurbiprofen axetil lipid microsphere injection under different storage conditions

表10 各指標(biāo)在0 d與30 d測(cè)定值之間變化的絕對(duì)值均值Table 10 Mean value of absolute value of difference of each index between the measured values at 0 d and 30 d

表11 各指標(biāo)在0 d與30 d測(cè)定值之間變化的相對(duì)值均值 (%)Table 11 Mean value of relative value of difference of each index between the measured values at 0 d and 30 d (%)

3 討論

磷脂和泊洛沙姆188以及油酸三者合用可提高乳劑穩(wěn)定性。因?yàn)榱字僧a(chǎn)生表面電荷，使得乳滴由于靜電斥力而不易聚集，泊洛沙姆188是高分子聚合物，其親水性的聚氧乙烯鏈吸附在乳滴表面。這種空間位阻作用進(jìn)一步抑制了乳滴聚集，另外，加入的少量油酸可增強(qiáng)泊洛沙姆l88和磷脂的相互作用，提高復(fù)合凝聚膜的穩(wěn)定性，同時(shí)可使電位絕對(duì)值增高[9]。

蛋黃卵磷脂加入大豆油中，加熱狀態(tài)下攪拌很長(zhǎng)時(shí)間仍不能完全溶解，乳化效果明顯降低，且由于卵磷脂易氧化，在加熱過(guò)程中不穩(wěn)定；而溶于水相中加熱攪拌便可很快形成均勻的膠體分散溶液，因此，將蛋黃卵磷脂加于水中制備乳劑。

高壓均質(zhì)過(guò)程中粒子的碰撞加劇，產(chǎn)生熱量，容易使乳劑粒徑增大，均質(zhì)過(guò)程中采用低溫冷卻液循環(huán)泵，使均質(zhì)溫度保持在10 ℃左右。

PC含量為98%的蛋黃卵磷脂中幾乎沒(méi)有酸性脂質(zhì)，乳化后乳粒的表面電荷減少，乳滴間的靜電斥力較小乳滴易聚集，粒徑容易增大，電位絕對(duì)值減小，Ke增大，不利于氟比洛芬酯脂肪乳的形成和穩(wěn)定性，因此并不是理想的乳化劑。

氟比洛芬酯脂微球注射液在4～8 ℃條件下貯存30 d其穩(wěn)定性良好，表明其不適宜在高溫下貯存；還需在25 ℃以下繼續(xù)放置60,90 d后測(cè)定其各項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)一步觀察其穩(wěn)定性，為后續(xù)加速或長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察積累數(shù)據(jù)，以便確定適宜的貯存條件。