老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡藥理學研究與體外實驗驗證

付 沖,吳 超，張焰平*

(1安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安慶 246000；2皖南醫(yī)學院病理生理教研室；*通訊作者,E-mail:Zyping001@126.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病。病變主要位于降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸，可進一步擴散至整個結(jié)腸并反復發(fā)作[1]。與健康人相比，UC患者常有腹痛、腹瀉、黏液膿性和血便，如果病情進展不及時治療，可導致貧血、消瘦、低蛋白血癥和水電解質(zhì)紊亂。UC的病因和發(fā)病機制非常復雜，與腸道菌群失調(diào)、免疫系統(tǒng)障礙以及遺傳、環(huán)境和心理因素等有關[2]，現(xiàn)階段，美沙拉嗪和生物制劑等其他治療藥物也常規(guī)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療，但由于價格昂貴，不僅會增加患者的經(jīng)濟負擔，而且存在耐藥及停藥后嚴重反彈等情況[3]。近年來，我國政府對中藥的發(fā)展給予了積極的支持，中草藥含有多種活性成分，并且價格低廉，具有長期使用的可能性，因此中草藥療法引起了臨床醫(yī)生的極大興趣，所以，尋找具有有效抗炎作用的中草藥，對于改善臨床治療效果，提高病人的生活品質(zhì)至關重要。

在我國，傳統(tǒng)醫(yī)學理論認為潰瘍性結(jié)腸炎為“休息痢”“久痢”[4]。該病位于大腸，涉及脾、肝、腎、肺臟。以濕熱蘊腸、氣滯血瘀為根本病機，以脾虛為主要病因，以飲食不調(diào)為主。本病是本虛表實的證候，其病程以表實為主，以濕熱蘊腸、氣血不暢為特征；老鸛草是一種多年生草本，辛、苦、平、入肝、腎、脾經(jīng)，是一種常見的中藥，具有清熱化濕、排毒、止痢的功效。Bastani團隊[5]在之前的一項動物實驗證實老鸛草提取物可以明顯緩解葡聚糖硫酸鈉導致的大鼠急性結(jié)腸炎的炎癥反應；劉榮漢[6]報道了一項納入了67名潰瘍性結(jié)腸炎患者的研究，結(jié)果顯示老鸛草對潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果明顯優(yōu)于柳氮磺嘧啶。以上的研究表明老鸛草是治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在藥物,但目前在老鸛草抗炎機制的研究上鮮有報道,因此本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，以探討老鸛草對潰瘍性結(jié)腸炎的可能的作用機制，最后通過細胞實驗進行證實，從而為其在潰瘍性結(jié)腸炎的臨床應用上奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學預測靶點

1.1.1 中藥老鸛草活性成分的篩選 以“老鸛草”為檢索詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，獲得老鸛草的化學成分。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug Likeness，DL)≥0.18為條件，篩選得到中藥老鸛草有效成分。在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫中，通過有效成分查找其對應靶點，將靶點輸入蛋白質(zhì)組常用數(shù)據(jù)庫(Unified Protein Database，Uniprot，https//www.uniprot.Org)實現(xiàn)基因名稱標準化。

1.1.2 潰瘍性結(jié)腸炎靶點的預測 以潰瘍性結(jié)腸炎為關鍵詞，檢索人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database,GeneCards,https://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://mirror.omim.org)獲得潰瘍性結(jié)腸炎潛在相關基因，最后通過VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得潰瘍性結(jié)腸炎靶點與老鸛草化合物間存在重疊靶點。

1.1.3 藥物-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡及蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件建立網(wǎng)絡圖，以構(gòu)建老鸛草的活性化合物和潰瘍性結(jié)腸炎相關靶點。將重疊靶點導入String網(wǎng)站(https://string-db.org/)，物種設定為人類，蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡信息獲得后使用R軟件繪制度值排名前20的的靶點。

1.1.4 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析 利用R軟件的clusterProfiler包進行基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析。以P<0.05作為基因本體富集和京都基因與基因組百科全書通路富集的閾值，并選取部分排名靠前的條目進行可視化。

1.2 體外實驗

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物制備 人髓系白血病單核細胞系THP-1細胞取自中國科學院細胞庫。THP-1細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清(美國賽默飛世爾科技公司，貨號A3160802)和0.25%胰酶(美國賽默飛世爾科技公司，貨號BL006A)，放置在恒溫37 ℃且含有5%二氧化碳的加濕空氣的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。老鸛草購自安慶市立醫(yī)院中藥房。用去離子水(1 ∶10～5 ∶1,W/V)煎煮老鸛草，每次30 min。加入Te緩沖液搖勻濃縮后在20～40 ℃保存。

1.2.2 THP1-M0/M1細胞模型的建立 參照薛婧團隊[7]近期的一項體外細胞實驗結(jié)果，使用佛波酯復蘇THP-1細胞，誘導其貼壁生長并使其分化為未活化的MO巨噬細胞，按照隨機數(shù)字法將細胞分為對照組、LPS模型組、老鸛草低劑量組(LPS+12.5 g/ml老鸛草)、老鸛草中劑量組(LPS+25 g/ml老鸛草)、老鸛草高劑量組(LPS+50 g/ml老鸛草)。不同劑量老鸛草組以誘導的M0巨噬細胞為基礎加入不同濃度的老鸛草提取液預處理6 h，除對照組以外，其余組均加入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導4 h得到M1巨噬細胞，加入F4/80+(北京索萊寶科技有限公司，貨號:28463-1-AP)和CD86抗體(北京索萊寶科技有限公司，貨號:13395-1-AP)檢測M1巨噬細胞比例。

1.2.3 細胞活力測定 通過CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1210)測定細胞活力，將誘導成功的MO巨噬細胞細胞以4×103/孔的密度置于96孔板中。孵育12 h后，用不同濃度的含藥物的培養(yǎng)基處理24 h。然后將10 μl CCK-8試劑添加到每個孔中，并將板孵育1～4 h。最后，在450 nm波長下測量吸光度。

1.2.4 ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6及IL-8的含量 將抗原與固相載體連接，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，加酶標抗體進行孵育，固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。經(jīng)過再次洗滌后加底物溶液進行顯色，待反應終止后在450 nm波長下檢測吸光度，并根據(jù)標準曲線計算IL-1β、IL-6、IL-8的水平，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，并按照試劑盒標準進行測定。

1.2.5 qRT-PCR法檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6及IL-8的mRNA含量 使用TRIZOL試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司，貨號：12183-555)提取總mRNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，貨號：RR036A)生成gDNA。然后使用TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒(大連TakaRa公司，貨號：RR820A)進行定量PCR。人類GAPDH基因被用作內(nèi)標基因，并通過2-ΔΔCt方法定量分析數(shù)據(jù)。對照組中的值設置為1.0，所有數(shù)據(jù)均顯示為相對mRNA表達。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負責合成?；虻囊镄蛄腥缦拢篒L-6上、下游引物序列分別為5′-AATAACCACCCCTGACCC-AACC-3′和5′-TGACCAGAAGAGGAATGCCC-3′；IL-1β上、下游引物序列分別為5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′和5′-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3′；人GAPDH引物序列分別為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測 在以上處理完畢后，每一組采集106細胞，然后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次。添加200 μl磷酸緩沖鹽溶液重懸，將CD86抗體5 μl(Proteintech,貨號13395-1-AP)加入后進行避光孵育30 min，完成孵化后，用PBS沖洗2次，然后加入200 μl磷酸緩沖鹽溶液重懸后上機檢測。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)分析，若差異有顯著性，進一步兩兩比較用LSD法;采用Graphpad7.0對結(jié)果進行統(tǒng)計作圖，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡藥理學分析

2.1.1 活性化合物的篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫中檢索老鸛草的活性成分，共得到39個相關化合物。符合OB≥30%，DL≥0.18條件的化合物共7個(見表1)。

表1 中藥老鸛草中7個有效成分基本信息Table 1 The information of 7 active compounds in Geranium wilfordii

2.1.2 老鸛草作用靶點與潰瘍性結(jié)腸炎相關靶點重疊靶點篩選 利用小分子藥物靶點預測在線平臺(Swiss target prediction,STP,http://swisstargetprediction.ch)刪除重復靶點，從老鸛草的7個活性化合物中篩選出161個化合物靶點，通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選，共獲得2 412個潰瘍性結(jié)腸炎相關靶點。將161個化合物靶點與2 412個潰瘍性結(jié)腸炎相關靶點相交，得到122個重疊靶點(見圖1)。我們還利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(見圖2)，進一步闡明老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制。

2.1.3 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡構(gòu)建 122個重疊靶點的蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡網(wǎng)絡包含121個節(jié)點，2 256條邊,平均度值為37.3，平均局部聚類系數(shù)為0.685，PPI富集P<1.0×10-16(見圖3)。根據(jù)拓撲分析得到的大于平均度值的靶點作為重要靶點(見圖4)，再進一步選擇10個核心靶點，包括JUN、IL-6、PTGS2、FOS、EGF、MMP9、IL-8、MAPK1、CASP3、IL-1β。

圖1 中藥老鸛草作用靶點和潰瘍性結(jié)腸炎相關靶點韋恩圖

圓圈之間的連線代表兩個基因之間的相互關系，線條越粗，相關性越強圖3 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點相互作用網(wǎng)絡Figure 3 PPI network of the overlapping targets of Geranium wilfordii against ulcerative colitis

相互作用的蛋白數(shù)條形圖越長代表度值越高，為核心靶點的可能性越大圖4 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點度值條形圖Figure 4 The degree values of overlapping targets for Geranium wilfordii in the treatment of ulcerative colitis

2.1.4 基因本體功能富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析 對122個重疊靶點進行了基因本體富集分析，其中P<0.05的基因本體項共2 077個，其中生物過程(BP)1 900個，細胞成分(CC)40個，分子功能(MF)137個。生物過程類別中排名前5位的分別為:對脂多糖的免疫反應、對細菌的免疫反應、氧化應激反應、對活性氧的反應和細胞應激反應。這些生物學過程與以下分子功能密切相關:轉(zhuǎn)錄因子直接與DNA結(jié)合、受RNA聚合酶調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、核受體活性。此外，這些過程主要發(fā)生在膜筏、膜微域、細胞表面的穴樣內(nèi)陷、囊泡腔、質(zhì)膜筏?；虮倔w分析排名前10的條目被可視化，結(jié)果見圖5。京都基因與基因組百科全書通路富集分析結(jié)果顯示，122個重疊靶點在157個信號通路中富集，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應力、動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路，京都基因與基因組百科全書分析排名前20的條目被可視化，結(jié)果見圖6。

基因富集數(shù)目圖5 中藥老鸛草與潰瘍性結(jié)腸炎的重疊靶點基因本體功能富集Figure 5 GO enrichment analyses for the overlapping targets between Geranium wilfordii and ulcerative colitis

基因富集數(shù)目圖6 中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎重疊靶點京都基因與基因組百科全書通路富集條形圖Figure 6 KEGG pathway enrichment analyses for the overlapping targets for Geranium wilfordii in the treatment of ulcerative colitis

2.2 體外實驗驗證

2.2.1 老鸛草對巨噬細胞活性的影響 THP-1經(jīng)佛波酯誘導分化的M0巨噬細胞加入不同劑量的老鸛草處理24 h后，與對照組相比，12.5 mg/L老鸛草組、25 mg/L老鸛草組及50 mg/L老鸛草組中巨噬細胞活力沒有明顯降低(見圖7)。

圖7 不同劑量老鸛草水煎液對巨噬細胞活力的影響Figure 7 Influence of Geranium wilfordii on the activity of macrophages

2.2.2 M1巨噬細胞模型的鑒定 光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，THP-1細胞狀態(tài)良好時細胞形態(tài)呈圓形，大小均一，為單個懸浮細胞；經(jīng)佛波酯誘導后，對照組中部分細胞形態(tài)不規(guī)則，有些細胞帶偽足；經(jīng)佛波酯誘導后加入LPS繼續(xù)誘導4 h，LPS模型組中不規(guī)則細胞較前更多，有些細胞出現(xiàn)多邊形，此時誘導分化成的細胞為M1型巨噬細胞(見圖8)。與LPS模型組相比，LPS+12.5 mg/L老鸛草組、LPS+25 mg/L老鸛草組及LPS+50 mg/L老鸛草組不規(guī)則細胞的比例較前明顯減少。從流式檢測結(jié)果中可以看出，與對照組相比，LPS模型組M1型巨噬細胞比例顯著升高(P<0.01，見圖9)。

2.2.3 ELISA及qRT-PCR實驗檢測老鸛草對細胞因子的影響 ELISA結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS模型組細胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β含量顯著升高(P<0.01，見圖10)；與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組細胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β的含量顯著降低(P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示，相比于對照組，LPS模型組細胞上清液中IL-6、IL-1βmRNA表達豐度顯著升高(P<0.01)。與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組(LPS+12.5 mg/L、LPS+25 mg/L、LPS+50 mg/L)細胞上清液中IL-6、IL-8和IL-1β的mRNA表達豐度顯著降低(P<0.01)。

圖8 不同劑量老鸛草水煎液對巨噬細胞形態(tài)的影響 (×20)Figure 8 Influence of Geranium wilfordii on the shape of macrophages (×20)

圖9 流式細胞檢測脂多糖誘導的M0細胞中M1細胞比例Figure 9 Analysis of lipopolysaccharide-induced M1 cells by flow cytometry

2.2.4 流式細胞實驗檢測老鸛草對M1巨噬細胞比例的影響 從M1型巨噬細胞流式檢測結(jié)果中可以看出，與對照組相比，LPS模型組中M1型巨噬細胞比例顯著升高(P<0.01)；與LPS模型組相比，不同劑量老鸛草組中M1型巨噬細胞比例顯著降低(P<0.01，見圖11)。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種以胃腸道慢性炎癥為主要特征的復雜性疾病，病理生理基礎是腸黏膜上皮細胞破壞以及免疫失調(diào)導致過度激活[8]，大量炎癥因子的產(chǎn)生導致了一種不受控制的炎癥反應。盡管在慢性炎癥的機制方面進行了深入的研究并取得了重大進展[9]，但潰瘍性結(jié)腸炎的確切病因和發(fā)病機制仍不清楚。近年來，巨噬細胞被認為是維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡以及炎癥反應和黏膜愈合的基本要素，巨噬細胞根據(jù)微環(huán)境刺激的不同被極化成兩種不同的表型：經(jīng)典激活途徑的(M1)巨噬細胞，它通過分泌促炎細胞因子導致組織損傷而參與疾病的發(fā)展；另一種是替代性激活途徑的(M2)巨噬細胞，它分泌參與抗炎的抑炎因子[10]。由于腸道巨噬細胞數(shù)量的失衡可以改變炎癥過程，調(diào)節(jié)M1/M2平衡最近被認為是潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療策略[11]。M1激活的巨噬細胞的特征是促炎癥細胞因子的表達增加，如腫瘤壞死因子-α、IL-6和IL-1β，這些被認為是典型的M1巨噬細胞標志物[12]。IL-8是一種趨化因子，通過促進嗜中性粒細胞聚集到炎癥部位而在炎癥過程中發(fā)揮重要作用，與其他促炎細胞因子一樣，在炎癥性腸病患者中的含量也顯著增加。所以抑制M1巨噬細胞的極化是治療潰瘍性結(jié)腸炎的一種方法。

與對照組相比，**P<0.01，與LPS模型組相比，##P<0.01圖10 ELISA和qRT-PCR檢測老鸛草對細胞上清液中細胞因子表達的影響Figure 10 The influence of Geranium wilfordii on the expression of cytokines by ELISA and qRT-PCR

與對照組相比,**P<0.01;與LPS模型組相比,##P<0.01圖11 老鸛草對M1巨噬細胞比例的影響Figure 11 The influence of Geranium wilfordii on the proportion of M1 macrophages

現(xiàn)代很多研究證實老鸛草具有抗菌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉等藥理作用[13-18]，其中槲皮素、木樨草素以及老鸛草素均被發(fā)現(xiàn)有調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的作用；槲皮素具有活化M2型巨噬細胞的作用，有報道將槲皮素與能抑制M1型巨噬細胞的納米二氧化鈰連接后，其化合物顯著降低巨噬細胞M1和M2的比例[19]；鄭瑩團隊[20]近期的的一項研究發(fā)現(xiàn)木犀草素通過上調(diào)hsa_circ_0001326的表達來促進M2極化并抑制M1極化，從而介導了has-miR-136-5p和USP4的表達。有研究稱老鸛草素可下調(diào)LPS誘導的M1巨噬細胞促炎細胞因子，包括TNF-α和IL-6，以及ROS和NO。此外，老鸛草素可以上調(diào)SOCS1的表達，由于SOCS1是NF-κB活化的上游調(diào)節(jié)劑，可以直接與NF-κB-p65結(jié)合并下調(diào)其表達，從而抑制NF-κB活化[21]。大部分的實驗均集中在老鸛草的提取物上，對于老鸛草水煎液調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的研究幾乎沒有。網(wǎng)絡藥理學結(jié)果顯示，JUN、IL-6、PTGS2、FOS、EGF、MMP9、IL-8、MAPK1、CASP3、IL-1β的度值排名靠前，通路富集結(jié)果顯示治療靶點集中在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應力、動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路。其中，腫瘤壞死因子信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎的疾病發(fā)展中起著重要的作用，且與M1巨噬細胞極化有關，最近該通路中IL-6、IL-1β、IL-8及其上游信號調(diào)節(jié)蛋白NF-κB已成為治療炎癥性腸病的新的有希望的抗炎目標[22]，且通路富集結(jié)果提示IL-6、IL-1β、IL-8富集在腫瘤壞死因子信號通路，因此選擇IL-1β、IL-6和IL-8進行進一步驗證，我們通過體外實驗建立M1巨噬細胞極化模型，加入不同濃度的水煎液，利用ELISA及qRT-PCR測量IL-6、IL-8和IL-1β的濃度，實驗結(jié)果表明老鸛草的水煎液可以下調(diào)上述促炎細胞因子的表達，最后我們通過流式細胞技術(shù)測量了不同分組M1巨噬細胞的比例，結(jié)果證實老鸛草水煎液可以顯著抑制M1型巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)換；但本實驗也有不足之處，我們未能對該通路的上游信號調(diào)節(jié)蛋白進一步實驗，所以老鸛草水煎液通過抑制M1細胞極化治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制仍需進一步驗證。

本實驗中我們通過網(wǎng)絡藥理學理論分析，預測了中藥老鸛草治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制，最后通過體外實驗驗證了中藥老鸛草是通過抑制M1巨噬細胞極化進一步下調(diào)促炎細胞因子的表達而達到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的，為后續(xù)的試驗研究提供理論基礎。