NKG2D基因多態(tài)性與喀什地區(qū)宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究

熱依漢古麗·阿不拉，海斯來提艾爾肯，萬迎香

(喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，喀什 844000；*通訊作者,E-mail:hanhuan7289139@163.com)

目前新疆特別是南疆維吾爾族婦女的宮頸癌發(fā)病率較高，并且發(fā)現(xiàn)時(shí)級(jí)別較晚，嚴(yán)重威脅著生活在此地的維吾爾族婦女生活質(zhì)量及生命，因此宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要[1,2]。相關(guān)研究顯示癌癥的發(fā)生可能受遺傳因素的影響，各類免疫相關(guān)基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程有一定的聯(lián)系[3,4]。NKG2D蛋白主要在細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞如NK細(xì)胞表面表達(dá)，是一種C型凝集素樣跨膜激活受體蛋白，編碼基因?yàn)镵LRK1[5,6]。NKG2D的表達(dá)和NK細(xì)胞活性關(guān)系密切，其表達(dá)水平的升高會(huì)提高NK細(xì)胞的活性，增加腫瘤的免疫應(yīng)答，NKG2D的表達(dá)可能與宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程的免疫應(yīng)答有關(guān)[7,8]。本研究以喀什地區(qū)宮頸癌患者和體檢的健康受試者為研究對(duì)象，研究?jī)山M受試者NKG2D基因中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)rs2255336T>C及rs2617160A>T在喀什宮碩癌婦女及健康婦女中分布頻率的差異，分析NKG2D基因中的多態(tài)性位點(diǎn)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 基本資料

選取2020年6月至2021年3月在喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院婦科經(jīng)病理檢查明確診斷且未行任何治療的各期宮頸癌患者100例作為病例組，其中腺癌14例、鱗癌61例、其他病理類型25例；淋巴轉(zhuǎn)移43例，無淋巴轉(zhuǎn)移57例；病理分化程度為高分化者63例，中低分化37例；臨床分期為ⅠB期者60例，ⅡA期40例；平均年齡(45.74±8.82)歲。選取同期來自本院體檢中心及住院患者中排除全身惡性腫瘤的高危型HPV感染的健康婦女100例作為對(duì)照組，平均年齡(45.92±9.02)歲。收集病例組和對(duì)照組受試者的血清標(biāo)本及宮頸分泌物標(biāo)本。病例組和對(duì)照組年齡比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

病例組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在21～65歲之間的已婚維吾爾族婦女；②無子宮切除病史，無合并婦科其他惡性腫瘤病史；③無其他重大疾病史(如心血管、糖尿病、呼吸道、消化道系統(tǒng))；④無心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)重大疾病史；⑤知情同意并且配合調(diào)查者；⑥如處于月經(jīng)期，待經(jīng)期完全結(jié)束1 d后可參加調(diào)查。

病例組患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①無先天性發(fā)育不良或智力障礙；②生殖道急性炎癥、月經(jīng)期；③嚴(yán)重內(nèi)外科疾病無法耐受檢查；④合并其他臟器惡性腫瘤；⑤有自身免疫性疾病患者；⑥排除HPV陰性的宮頸癌患者；⑦知情未同意者,并且不配合調(diào)查者。

1.2 樣本采集

1.2.1 組織病理 宮頸病理切片的制備和讀片均由喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院病理科負(fù)責(zé)。所有的宮頸病理檢查標(biāo)本將由一名喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院的病理學(xué)人員初次讀片，然后由一名本院病理科主任醫(yī)師再次讀片,兩次結(jié)果不一致時(shí)需要第3個(gè)病理學(xué)專家閱片。若為外院病理切片確診者將由我院病理科主任再次閱片。

1.2.2 宮頸分泌物標(biāo)本采集 讓檢查者在檢查床上躺好,用窺陰器充分暴露宮鎖。采用凱普HPV基因擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒,將專用宮頸刷在宮頸口輕輕搓動(dòng)并使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈后慢慢取出(如果宮頸分泌物多,最好在取樣前先用棉簽擦去),折斷其刷頭放入已有專用細(xì)胞保存液并標(biāo)好病人姓名和編號(hào)的取樣管中,擰緊瓶蓋。小樣本一經(jīng)采集,盡快送至實(shí)驗(yàn)室。如果不能馬上送檢樣本,將其于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存,并在兩周之內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 從每一例研究對(duì)象收集5 ml外周靜脈血,并且用2%乙二胺四乙酸二納抗凝管中,于2 h內(nèi)分裝至1.5 ml的EP管中,放置在-80 ℃低溫冰箱中保存。DNA提取采用蛋白酶K消化飽和氯化鈉鹽析法。

1.3.2 PCR擴(kuò)増及基因分型檢測(cè) 采用Nanodrop測(cè)基因組DNA濃度后進(jìn)行SNP分型,用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象中NKG2D基因的引物。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為10 μl，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變形15 s，60 ℃退火1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后40 ℃延伸5 min。用水代替模板DNA作為陰性對(duì)照組。采用羅氏LightCycler 480熒光定量分析軟件LCS480 1.5.1.62對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并進(jìn)行基因分型，隨機(jī)選取每個(gè)位點(diǎn)的不同基因型樣本進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證基因分型的結(jié)果。

1.3.3 NKG2D基因中多態(tài)性位點(diǎn)在各組的分布特征分析及NKG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡以及單倍型分析 分析NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2617160A>T和rs2255336T>C位點(diǎn)等位基因和基因頻率在病例組和對(duì)照組患者分布頻率的差異，比較NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2255336T>C及rs2617160A>T構(gòu)建的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5版軟件包(SPSS Company, Chicago, Illinois, USA)進(jìn)行,采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。比較各位點(diǎn)基因型頻率的觀察值與預(yù)期值并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)行Hardy-Weinberg平衡分析。采用SHEsis軟件計(jì)算各位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系，并用D′值表示各位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系，當(dāng)D′>0.8認(rèn)為位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖。病例組與對(duì)照組的基因型、等位基因型分布比較均采用行×列表卡方檢驗(yàn)。單體型頻率及連鎖不平衡分析采用EH軟件和2LD軟件(1.2 version，Rockefeller University，New York)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，rs2617160A>T和rs2255336T>C位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組和病例組中分布特征符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明本課題研究中所選研究對(duì)象具有代表性。

2.2 NKG2D基因中多態(tài)性位點(diǎn)在各組的分布特征

多態(tài)性位點(diǎn)rs2255336T>C等位基因及基因型在病例組和對(duì)照組分布頻率比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.592，0.767)，提示多態(tài)性位點(diǎn)rs2255336T>C等位基因和基因型可能與喀什地區(qū)宮頸癌發(fā)生無相關(guān)性。多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T等位基因在病例組和對(duì)照組中分布頻率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病例組中等位基因A分布頻率較高，提示該位點(diǎn)等位基因A可能是宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=1.30，95%CI 0.98～1.71，見表1)。病例組多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T在病例組中AA基因型的分布頻率較高，提示基因型AA可能是宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P=0.041，OR=0.57，95%CI 0.38～0.90，見表2)。

表1 NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2255336T>C及rs2617160A>T等位基因在對(duì)照組和病例組中的分布Table 1 Distribution of SNP loci rs2255336T>C and rs2617160A>T in NKG2D gene in control group and case group

表2 NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2255336T>C及rs2617160A>T基因型在對(duì)照組和病例組中的分布Table 2 Distribution of SNP loci rs2255336T>C and rs2617160A>T in NKG2D gene in control group and case group

2.3 NKG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡以及單倍型分析

病例組和對(duì)照組NKG2D基因中2個(gè)SPN位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系分析結(jié)果顯示，rs2255336T>C和rs2617160A>T之間存在強(qiáng)連鎖，D′值分別為0.994和0.991。根據(jù)不平衡分析結(jié)果構(gòu)建rs2255336C-rs2617160A的單倍型，分析分布頻率大于3%的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布特征，結(jié)果見表3。單倍型rs2255336 C-rs2617160 A在病例組和對(duì)照組中分布頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且經(jīng)Bonferroni校正后比較差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示單倍型CA可能與發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)因素有關(guān)。單倍型CT和TA在病例組和對(duì)照組中的分布頻率比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且經(jīng)Bonferroni校正后比較差異仍不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表3 NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2255336T>C及rs2617160A>T構(gòu)建的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布Table 3 Distribution of haplotypes constructed by SNPs rs2255336T>C and rs2617160A>T in NKG2D gene in case group and control group

2.4 rs2255336C-rs2617160A的單倍型與宮頸癌各臨床病理特征的相關(guān)性

rs2255336C-rs2617160A的單倍型與宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分化程度及臨床分期具有明顯的相關(guān)性(P<0.05，見表4)。

表4 rs2255336C-rs2617160A的單倍型與宮頸癌各臨床病理特征素的相關(guān)性Table 4 Correlation between haplotypes of rs2255336C-rs2617160A and clinicopathological features of cervical cancer

3 討論

目前南疆維吾爾族婦女呈現(xiàn)出較高的宮頸癌發(fā)病率，且發(fā)現(xiàn)時(shí)疾病已經(jīng)呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的態(tài)勢(shì)，對(duì)患者的生命安全和生活質(zhì)量有嚴(yán)重的威脅，因此早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌對(duì)患者的早期治療具有非常重要的作用[2]。宮頸癌發(fā)生的必要條件是高危型人乳頭瘤病毒感染，遺傳因素在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9,10]。NK細(xì)胞可以通過細(xì)胞凋亡及細(xì)胞毒性等機(jī)制識(shí)別出被病毒感染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并將這些細(xì)胞殺死，在固有免疫系統(tǒng)中具有重要作用[11,12]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示較低的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著免疫監(jiān)視作用，其可與細(xì)胞表面的NKG2D等受體及其特異性配體結(jié)合進(jìn)而激活或抑制信號(hào)[13,14]。NKG2D受體缺失的小鼠表現(xiàn)出缺陷的淋巴腫瘤的免疫監(jiān)視[15]。在宮頸癌細(xì)胞中，NKG2D表達(dá)水平的降低會(huì)使宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸，提示在宮頸癌發(fā)展過程中，NKG2D蛋白的表達(dá)發(fā)揮重要作用[16,17]。有研究顯示，NKG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T和rs2255336(T>C與云南漢族人群宮頸癌的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)[18,19]，因此本研究選取KG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T和rs2255336T>C，分析等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組人群的分布特征，研究KG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T和rs2255336T>C與喀什地區(qū)宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)。

本研究中首先對(duì)所選對(duì)象的代表性進(jìn)行了檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，rs2617160A>T和rs2255336T>C位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組和病例組中分布特征符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明本課題研究中所選研究對(duì)象具有代表性。

多態(tài)性位點(diǎn)rs2255336T>C等位基因及基因型在病例組和對(duì)照組中分布頻率組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.592和0.767)，提示多態(tài)性位點(diǎn)rs2255336T>C等位基因和基因型可能與喀什地區(qū)宮頸癌發(fā)生無相關(guān)性。多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T等位基因在病例組和對(duì)照組中分布頻率組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病例組中等位基因A分布頻率較高，提示該位點(diǎn)等位基因A可能是宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=1.30，95%CI 0.98～1.71)。病例組多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T在病例組中AA基因型的分布頻率較高，提示基因型AA可能是宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P=0.041，OR=0.57，95%CI 0.38～0.90)。以往研究顯示，NK細(xì)胞的活性與慢性乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，該位點(diǎn)可能會(huì)對(duì)NK細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響，進(jìn)而在慢性乙型肝炎中發(fā)揮作用[20,21]，據(jù)此推測(cè)，該位點(diǎn)也可能通過影響NK細(xì)胞活性進(jìn)而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。另有研究顯示，rs2255336T>C位點(diǎn)的等位基因與宮頸癌有關(guān)[22,23]，但是本研究結(jié)果顯示rs2255336T>C位點(diǎn)的等位基因和基因型均與喀什地區(qū)宮頸癌無相關(guān)性，可能是因?yàn)樗x研究對(duì)象不同造成的差異性。

本研究中病例組和對(duì)照組NKG2D基因中2個(gè)SPN位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系分析結(jié)果顯示，rs2255336T>C和rs2617160A>T之間存在強(qiáng)連鎖。根據(jù)不平衡分析結(jié)果構(gòu)建rs2617160A>T和rs2255336T>C的單倍型，分析分布頻率大于3%的單倍型在病例組和對(duì)照組中的分布特征。單倍型rs2255336 C-rs2617160 A在病例組和對(duì)照組中分布頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且經(jīng)Bonferroni校正后仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示單倍型CA可能與發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)因素有關(guān)。單倍型CT和TA在病例組和對(duì)照組中的分布頻率組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且經(jīng)Bonferroni校正后仍不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分化程度及臨床分期情況在AC、TC、AT單倍型組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，NKG2D基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2617160A>T等為基因A及基因型AA是云南漢族人群宮頸癌發(fā)生率的危險(xiǎn)因素，且單倍型CA與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[24,25]。

綜上，NKG2D基因中的SNP位點(diǎn)rs2617160A>T等位基因A及基因型AA可能是宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，單倍型CA可能與喀什地區(qū)宮頸癌易感性發(fā)生有關(guān)。通過本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的保護(hù)易感基因，針對(duì)重點(diǎn)人群行基因檢測(cè)，根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果決定隨訪時(shí)間，做到疾病早期發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌的早期或?qū)m頸癌前病變期行有效的治療，從而達(dá)到降低宮頸癌的發(fā)病率，提高宮頸癌的治愈率和患者的生活質(zhì)量的目的，為消滅宮頸癌提供更堅(jiān)定的理論基礎(chǔ)做準(zhǔn)備。本研究不足之處是并沒有對(duì)宮頸癌相關(guān)的危險(xiǎn)因素如性病、多次流產(chǎn)及HPV感染等資料進(jìn)行收集和分析，后續(xù)研究中將進(jìn)一步補(bǔ)充相關(guān)資料的收集和分析。