血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p在慢性心力衰竭大鼠中的表達及意義

李秀芩，陳少鵬，邵偉華，王素星，李 芳，姚麗霞

(河北省人民醫(yī)院老年心血管內(nèi)科，石家莊 050051;*通訊作者,E-mail:83312832@qq.com)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心肌肥厚等心臟疾病變誘發(fā)心室收縮、舒張功能損傷的一種綜合征，具較高致殘率和死亡率，患者預(yù)后較差，心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷時表現(xiàn)為射血功能障礙、血液灌注不足，早期診斷和治療可減緩CHF發(fā)展進程[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可與mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，降解mRNA，抑制蛋白翻譯，并可調(diào)節(jié)細胞生長和凋亡等生物學(xué)行為，參與多種生理病理過程，已有研究表明miRNA與CHF嚴重程度相關(guān)[2,3]。因而深入探究miRNA與CHF發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性具有重要意義。微小RNA-423-5p(miR-423-5p)在CHF患者血清中表達水平升高，且與CHF患者預(yù)后有關(guān)[4]。CHF患者中微小RNA-499-5p(miR-499-5p)呈高表達，且與氨基末端腦利鈉肽前體(NTpro-BNP)濃度呈正相關(guān)，可作為峰值攝氧量(VO2)的預(yù)測因子，可能作為判斷CHF進展標(biāo)志物[5]。CHF患者血漿中微小RNA-210-3p(miR-210-3p)表達上調(diào)，且與NTpro-BNP顯著相關(guān)，并可能作為評估患者預(yù)后的標(biāo)志物[6]。但血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與CHF標(biāo)志物相關(guān)性尚未完全闡明。因此，本研究采用腹腔注射阿霉素建立CHF模型，探討血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p在CHF大鼠中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

30只SPF級大鼠(體質(zhì)量120～180 g)購自廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(閩)2018-0002。飼養(yǎng)溫度25～27 ℃，濕度40%～70%，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建模型與實驗分組 30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為NC組(n=15)和CHF組(n=15)。NC組：常規(guī)飼養(yǎng)，不進行處理。采用腹腔注射阿霉素建立CHF模型[7]：滅菌水溶解阿霉素制備濃度為0.25 mg/ml溶液，1次腹腔注射2.5 mg/kg，1次/周，連續(xù)注射6次，累積劑量為15 mg/kg。采用Vevo3100型心臟彩超儀(佰泰科技有限公司)檢測左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)，LVEF和LVFS降低20%～30%視為造模成功[8]。

1.2.2 采用超聲心動圖儀檢測大鼠心功能指標(biāo) 建模6周后禁食12 h，采用HIVISION超聲心動圖儀(日本東芝)檢測左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分數(shù)(LVEF)，探頭頻率為2.5 MHz。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p的表達水平 分別抽取NC組和CHF組建模1，2，6，12，24 h及建模6周后大鼠腹主動脈血液樣本3 ml，3 500 r/min離心10 min提取血清，采用qRT-PCR法檢測血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表達水平。miRcute miRNA提取分離試劑盒用于提取血清總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄過程按照cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑說明書操作。miR-423-5p正向引物5′-TGAGGGGCAGAGAGCGA-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-499-5p正向引物5′-CGTGTCGACCAAGTCTGGGGTGAAAGAGAAG-3′，反向引物5′-TGTGTCGACGGTCATGAGCTTGTTGAGGTTC-3′；miR-210-3p正向引物5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′，反向引物5′-TATCTGTGCGTGTGACAGCGGCT-3′；內(nèi)參U6的正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。采用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測并以2-ΔΔCt法表示miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p相對表達量。

1.2.4 采用免疫熒光法和ELISA法檢測大鼠血清NTpro-BNP和cTnI水平 分別抽取NC組和CHF組大鼠6周后腹主動脈血液樣本3 ml，3 500 r/min離心10 min提取血清，采用免疫熒光法檢測NTpro-BNP水平，采用ELISA法檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠心功能指標(biāo)比較

與NC組比較，CHF組心功能指標(biāo)LVEDV和LVESV升高，LVEF降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組大鼠心功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of cardiac function indicators between the two groups

2.2 兩組大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表達水平比較

建模6周后，與NC組比較，CHF組血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表達水平升高(P<0.05，見表2)。

2.3 兩組大鼠血清NTpro-BNP、cTnI表達水平比較

建模6周后，與NC組比較，CHF組血清NTpro-BNP和cTnI水平顯著升高(P<0.05，見表3)。

2.4 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與心功能指標(biāo)相關(guān)性分析

采用Pearson法分析CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與心功能指標(biāo)相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與LVEDV、LVESV、LVEF無明顯相關(guān)性(P>0.05，見表4)。

表2 兩組大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p表達水平比較Table 2 Comparison of serum miR-423-5p, miR-499-5p and miR-210-3p expression levels between two groups

表3 兩組大鼠血清NTpro-BNP、cTnI表達水平比較Table 3 Comparison of serum NTpro-BNP and cTnI levels between the two groups

表4 CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與心功能指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation of serum miR-423-5p, miR-499-5p and miR-210-3p with cardiac function indexes in CHF rats

2.5 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與NTpro-BNP相關(guān)性分析

采用Pearson法分析血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與NTpro-BNP相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均與NTpro-BNP呈正相關(guān)(r分別為0.668，0.622，0.532，均P<0.05，見圖1)。

圖1 CHF大鼠miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與NTpro-BNP的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation of miR-423-5p, miR-499-5p, miR-210-3p with NTpro-BNP in CHF rats

2.6 miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與cTnI相關(guān)性分析

采用Pearson法分析CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與cTnI相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均與cTnI呈正相關(guān)(r分別0.663，0.598，0.533，均P<0.05，見圖2)。

圖2 CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與cTnI相關(guān)性分析Figure 2 Correlation of serum miR-423-5p, miR-499-5p, miR-210-3p with cTnI in CHF rats

3 討論

miRNA表達異常與CHF發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多項研究表明miRNA可調(diào)節(jié)靶基因表達，進而參與CHF發(fā)生過程[9,10]。

CHF主要表現(xiàn)為心功能異常，心功能指標(biāo)主要為LVEDV、LVESV和LVEF，本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠心功能指標(biāo)LVEDV和LVESV升高，LVEF降低，提示CHF模型建立成功。miR-423-5p在CHF患者血清中表達上調(diào)，且與心功能密切相關(guān)，可作為評估CHF嚴重程度的標(biāo)志物[11]。本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠血清miR-423-5p表達水平升高，與上述研究結(jié)果相似。提示miR-423-5p在CHF發(fā)展進程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-423-5p表達量與CHF癥狀嚴重程度呈正相關(guān)，并可用于評判臨床療效[12]。miR-499-5p可靶向p21進而參與阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞損傷過程[13]。本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠血清中miR-499-5p表達水平升高，提示miR-499-5p可能作為早期診斷CHF的標(biāo)志物。miR-499可作為早期診斷急性心肌梗死的標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果表明miR-499-5p負向調(diào)控p21表達，并調(diào)節(jié)心肌細胞增殖和凋亡等，參與CHF發(fā)展過程。膿毒癥大鼠血清miR-210-3p表達水平增高，可與NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物4(NDUFA4)結(jié)合，促進心肌細胞凋亡，損害線粒體功能[15]。miR-210-3p過表達可抑制靶基因ATG7表達，促進炎癥因子表達、細胞細胞增殖，抑制細胞凋亡，進而促進急性肺損傷[16]。氧-葡萄糖剝奪(OGD)誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細胞(EPC)中miR-210-3p表達上調(diào)，促進EPC增殖、遷移，其作用機制與靶向調(diào)控RGMA有關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠血清miR-210-3p表達水平升高，其作用機制可能與靶向調(diào)控NDUFA4、ATG7、RGMA有關(guān)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與LVEDV、LVESV呈正相關(guān)，且與LVEF呈負相關(guān)，但均無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與樣本量小有關(guān)。

miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p與NTpro-BNP和cTnI相關(guān)性尚未明確。NTpro-BNP和cTnI作為CHF心肌損傷標(biāo)志物，其水平與CHF癥狀、心肌損傷嚴重程度有關(guān)[18,19]。已有研究表明miRNA表達異常與NTpro-BNP有關(guān)，NTpro-BNP屬于心源性神經(jīng)激素，對CHF診斷具有特異性[20,21]。miRNA表達量與cTnI有關(guān)，cTnI水平升高表明CHF患者心肌損傷較為嚴重[22,23]。本研究嘗試性分析顯示miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p均與NTpro-BNP、cTnI呈正相關(guān)，提示隨著miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p水平升高，CHF大鼠心肌損傷和心衰程度愈加嚴重，下調(diào)miR-423-5p、miR-499-5p和miR-210-3p水平，可能改善CHF心衰癥，可能作為監(jiān)測CHF病情進展的標(biāo)志物。

綜上所述，CHF大鼠血清miR-423-5p、miR-499-5p、miR-210-3p表達水平升高，均與NTpro-BNP和cTnI呈正相關(guān)，可能成為評估CHF嚴重程度的潛在生物標(biāo)志物。但其可能作用機制尚未明確，仍需更多基礎(chǔ)研究、臨床試驗進行驗證。