不同分離方法對(duì)紅托竹蓀菌種的復(fù)壯效果

黃曉潤(rùn),黃萬(wàn)兵*,劉傾城,盧穎穎,朱國(guó)勝,桂 陽(yáng)

（1.貴州省農(nóng)作物品種資源研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省食用菌育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.貴州省食用菌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資源育種功能實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550006；4.貴州省食用菌工程技術(shù)研究中心資源育種實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550006）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata）目前主要分布于我國(guó)貴州、云南、四川等西南地區(qū)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是貴州省的特色珍稀食用菌，具較高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-4]。菌種退化是食用菌生產(chǎn)中存在的普遍問(wèn)題[5-6]，菌種退化勢(shì)必會(huì)影響菌種質(zhì)量與產(chǎn)量。菌種退化分為可逆和不可逆兩類(lèi)，其中，可逆的退化可通過(guò)復(fù)壯恢復(fù)優(yōu)良特性，通常采用的復(fù)壯方法有菌絲尖端分離法、子實(shí)體組織分離法和原生質(zhì)體再生法等[7-8]。紅托竹蓀在栽培過(guò)程中常出現(xiàn)菌絲退化、菌種老化，出菇延遲，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重下降。為避免紅托竹蓀優(yōu)良性狀的退化，以保存1年的紅托竹蓀菌株為主要試驗(yàn)材料，利用菌絲尖端分離法、竹蛋組織分離法和子實(shí)體組織分離法進(jìn)行復(fù)壯，以期篩選出紅托竹蓀復(fù)壯的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 保存1年的紅托竹蓀菌株，編號(hào)分別為2182、yzs020、1907，由貴州省農(nóng)作物品種資源研究所真菌研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 木屑培養(yǎng)基配方為葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨2.5 g、硫酸銨2.5 g、維生素B60.16 g、瓊脂8 g、木屑70 g（60目篩）、土豆100 g、玉米粉20 g、蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尖端分離法 采用菌絲尖端分離法，將紅托竹蓀2182、yzs020、1907 接種于木屑培養(yǎng)基平板，長(zhǎng)到2 cm 后挑取尖端部分1 cm的菌絲再次接種于木屑培養(yǎng)基平板；對(duì)照（CK）為保藏種直接接種于木屑培養(yǎng)基平板。

1.2.2 竹蛋組織分離法 將種植的紅托竹蓀竹蛋用75%酒精擦洗表面，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)紫外燈照射10 min 后進(jìn)行組織分離，接種于木屑培養(yǎng)基平板，挑取菌蓋、菌裙、菌柄、膠質(zhì)層、菌托膜5個(gè)部位的組織，接入木屑培養(yǎng)基平板培養(yǎng)觀察[9]。

1.2.3 子實(shí)體組織分離法 將種植的紅托竹蓀子實(shí)體用75%酒精擦洗表面，在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)紫外燈照射10 min 后進(jìn)行組織分離，接種于木屑培養(yǎng)基平板，挑取菌蓋、菌裙、菌柄、膠質(zhì)層、菌托膜5個(gè)部位的組織，接入木屑培養(yǎng)基平板培養(yǎng)觀察[9]。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

挑取約0.5 mm×0.5 mm 的組織塊，置于培養(yǎng)基上22℃培養(yǎng)。每組分離方法及CK均設(shè)5 個(gè)平板重復(fù)，每天定時(shí)觀測(cè)，記錄萌發(fā)時(shí)間、菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、萌發(fā)率及污染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅托竹蓀尖端分離菌絲體的生長(zhǎng)情況

由表1可知，CK 菌絲長(zhǎng)勢(shì)稀疏；尖端分離后2182、yzs020、1907 菌絲體的長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于CK，均為生長(zhǎng)濃密。生長(zhǎng)速度CK 最低，為0.96 mm/d；尖端分離后的菌株均高于CK，其中，yzs020 生長(zhǎng)最快，為1.19 mm/d。尖端分離后菌絲體萌發(fā)率、萌發(fā)時(shí)間、污染率一致，分別為100%、24 h、0%。

表1 紅托竹蓀尖端分離菌絲體的生長(zhǎng)情況

2.2 紅托竹蓀竹蛋組織分離菌株的生長(zhǎng)情況

由表2 可知，接種菌蓋組織除2182 菌株全部污染（污染率達(dá)100%）外，1907 菌株、yzs020菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)、生長(zhǎng)速度相同，均為菌絲生長(zhǎng)密、0.21 mm/d。1907 菌株污染率為60%，yzs020 菌株全萌發(fā)。菌株萌發(fā)時(shí)間yzs020為48 h，1907菌株為24 h。

表2 紅托竹蓀竹蛋組織分離菌株的生長(zhǎng)情況

菌裙組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)密，菌絲生長(zhǎng)速度分別為0.25 mm/d、0.29 mm/d、0.17 mm/d。2182 菌株、yzs020 菌株全萌發(fā)，1907 菌株萌發(fā)80%。2182 菌株、yzs020 菌株萌發(fā)時(shí)間均為24 h，1907菌株萌發(fā)時(shí)間較慢，為456 h。

菌柄組織2182菌株、yzs020菌株、1907菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)密，菌絲生長(zhǎng)速度分分別為0.29 mm/d、0.32 mm/d、0.22 mm/d。2182菌株、yzs020菌株全萌發(fā)，1907菌株萌發(fā)40%。萌發(fā)時(shí)間均為24 h。

膠質(zhì)層組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)稀疏，菌絲生長(zhǎng)速度分別為0.14 mm/d、0.22 mm/d、0.17 mm/d。2182菌株萌發(fā)80%，yzs020菌株全萌發(fā)，1907 菌株僅萌發(fā)20%。萌發(fā)較慢，2182 菌株、yzs020 菌株萌發(fā)時(shí)間分別為216 h、192 h，1907菌株為24 h。2182菌株污染率為20%。

菌托膜組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)濃密，菌絲生長(zhǎng)速度分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d、0.23 mm/d。3個(gè)菌株全萌發(fā)，萌發(fā)時(shí)間均為24 h。

2.3 紅托竹蓀子實(shí)體分離菌株的生長(zhǎng)情況

由表3 可知，菌蓋組織2182 菌株、yzs020菌株、1907菌株全部污染（污染率達(dá)100%）。

表3 紅托竹蓀子實(shí)體分離菌株的生長(zhǎng)情況

菌裙組織除1907 菌株未萌發(fā)外，2182 菌株、yzs020 菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)密，生長(zhǎng)速度分別為0.22 mm/d、0.20 mm/d，萌發(fā)率、萌發(fā)時(shí)間均分別為20%、24 h。2182菌株污染率為80%。

菌柄組織除1907菌株全部污染（污染率達(dá)100%）外，2182菌株、yzs020菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)密，生長(zhǎng)速度分別為0.24 mm/d、0.22 mm/d。2182菌株、yzs020菌株萌發(fā)率分別為40%、100%，萌發(fā)時(shí)間均為24 h。2182菌株污染率為60%。

膠質(zhì)層組織2182 菌株全部污染（污染率達(dá)100%）、yzs020 菌株未萌發(fā)。1907 菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)為生長(zhǎng)稀疏，生長(zhǎng)速度0.21 mm/d，萌發(fā)率為20%，萌發(fā)時(shí)間72 h，污染率為80%。

菌托膜組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)均為生長(zhǎng)濃密，菌絲生長(zhǎng)速度分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d、0.35 mm/d。萌發(fā)率yzs020 菌株為100%，2182 菌株、1907 菌株為80%。萌發(fā)時(shí)間均為24 h。2182 菌株、1907 菌株污染率均為20%。

3 結(jié)論與討論

食用菌菌種的衰老主要與自身遺傳變異和環(huán)境因素相關(guān)。自身遺傳主要包括變異和基因突變等；環(huán)境因素主要包括培養(yǎng)條件不適宜、菌種保藏環(huán)境不適合、菌種保藏不當(dāng)和菌株被病毒感染等[10-11]。針對(duì)紅托竹蓀及其他食用菌菌種老化、衰老最主要的預(yù)防措施，其基本原則就是“預(yù)防為主”，減少環(huán)境因素帶來(lái)的影響，保證菌種的質(zhì)量，因此不能考慮單一因素，需要從多方面進(jìn)行預(yù)防。對(duì)退化菌種，可采取定期查看剔除退化菌種、定期分離純化、創(chuàng)造適合的培養(yǎng)基質(zhì)及環(huán)境條件、控制菌種的傳代次數(shù)等措施入手[12]。

采用尖端分離技術(shù)分離時(shí)，3 株復(fù)壯菌株長(zhǎng)勢(shì)為生長(zhǎng)濃密；生長(zhǎng)速度為1.09～1.15 mm/d，復(fù)壯菌株生長(zhǎng)速度明顯高于保存1年的對(duì)照菌株（0.96 mm/d）；萌發(fā)率、萌發(fā)時(shí)間、污染率一致，分別為100%、24 h、0%。尖端分離的菌絲體進(jìn)行復(fù)壯效果最好，這可能與尖端分離后菌絲體內(nèi)潛伏或感染的雜菌顯著下降，菌絲體對(duì)培養(yǎng)料的分解力、適應(yīng)性增強(qiáng)有關(guān)[13-15]。但由于多次尖端分離之后，可能會(huì)造成菌絲體發(fā)生變異等情況，因此該種方法可用于短期內(nèi)的菌株復(fù)壯，食用菌的傳代次數(shù)一般不得超過(guò)5次[16]。

紅托竹蓀竹蛋組織分離復(fù)壯時(shí)，菌托膜部位分離的萌發(fā)率最高，3 個(gè)菌株全萌發(fā)，萌發(fā)時(shí)間較快，均為24 h；菌絲生長(zhǎng)速率較快，2182 菌 株、yzs020 菌株和1907 菌株 分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d 和0.23 mm/d，且沒(méi)有污染，但由于竹蛋未形成完整的子實(shí)體，無(wú)法知曉其農(nóng)藝性狀的優(yōu)勢(shì)，所以通過(guò)竹蛋的菌托膜復(fù)壯可能不是較佳的菌株。

紅托竹蓀子實(shí)體進(jìn)行組織分離復(fù)壯時(shí)，其菌蓋、菌裙、菌柄因暴露在外，導(dǎo)致其被污染的概率大大增加，通過(guò)菌落形態(tài)特征初步判斷常被霉菌、枯草芽孢桿菌等菌污染，菌托膜和膠質(zhì)層因有部分包裹在內(nèi)，所以污染的概率相對(duì)較小，菌托膜部位分離的萌發(fā)率相對(duì)較高，yzs020 菌株全萌發(fā)，2182 菌株和1907 菌株萌發(fā)率均為80%；污染率也較低，僅20%；萌發(fā)時(shí)間24 h；菌絲生長(zhǎng)速度較快，為0.34～0.35 mm/d。

在紅托竹蓀菌株復(fù)壯中，目前采用的方法主要有菌絲尖端分離法和組織分離法，研究只對(duì)復(fù)壯菌株菌絲的一些生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于紅托竹蓀的尖端分離最佳次數(shù)，尖端分離和組織分離復(fù)壯之后的農(nóng)藝性狀特征還有待進(jìn)一步深入研究。