蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因多態(tài)性與其烏質性狀關聯性研究

岳 丹，和曉明，任洪輝，劉興能，朱俊紅，鄧衛(wèi)東*

(1.玉溪農業(yè)職業(yè)技術學院 動物科技學院，云南 玉溪 653106；2.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明650201)

SLC17A8基因編碼囊泡谷氨酸轉運蛋白(vesicular glutqmate transporter 3，VGLUT3)，該蛋白將神經遞質谷氨酸轉運到突觸小泡中，然后再釋放到突觸間隙[1]。Hoogduijn等[2]和Adameyko[3]研究顯示抑制谷氨酸受體會導致黑色素細胞結構發(fā)生轉變，并且黑色素細胞合成過程中的中央調控因子MITF(microphthalmia associated transription factor)表達量急劇下降，推斷SLC17A8可能與MITF具有相似的生物學功能。此外，在紫外線的照射下神經元可導致谷氨酸大量合成[4]，蘭坪烏骨綿羊主產區(qū)位于高原，常年接受強紫外線的照射，可誘導蘭坪烏骨綿羊大量合成谷氨酸[5]，SLC17A8在神經元內編碼VGLUT3，推測SLC17A8與黑色素的合成密切相關。熊和麗[6]通過對蘭坪烏骨綿羊全基因組測序并與世界多個品種綿羊全基因組重測序數據(10818G)進行聯合分析，結果發(fā)現蘭坪烏骨綿羊高密度遺傳變異圖譜顯示基因內的突變主要在于內含子變異，并且SLC17A8有15個SNP在蘭坪烏骨綿羊中具有高等位基因頻率，經haploview分析，其中12個SNP高度連鎖，在蘭坪烏骨綿羊具有不同于蘭坪普通綿羊的優(yōu)勢單倍型[6](圖1)。目前對于蘭坪烏骨綿羊種質的分子特征探究較少，大部分研究是從黑色素的合成路徑和酶調控位點入手探究蘭坪烏骨綿羊烏質性狀的形成機理[7-10]。本文利用PCR技術對蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因進行擴增，分析該基因的生物學特性，為后續(xù)SLC17A8在黑色素細胞的研究提供理論依據。

圖1 SLC17A8中15個SNP在蘭坪烏骨綿羊(A)及蘭坪普通綿羊(B)的單倍型[6]

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選取云南省蘭坪縣的蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊(各50只)血液作為研究樣品。使用一次性真空采血管在綿羊頸部靜脈采血，置于冰盒中暫存運輸，后置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

Soluene-350(PerkinElmer公司)；L-Dopa、酪氨酸酶(Sigma公司)；蛋白酶K(Merck公司)；RNase、ddH2O(北京天根生化科技有限公司)；瓊脂糖、金牌MIX、DL2000 DNA Marker(昆明碩擎生物技術有限公司)；ExRed核酸染料(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。

1.3 黑色素含量測定

采用光譜法分別測定[7]血液酪氨酸酶活力、脫黑色素含量、堿溶性黑色素含量、總黑色素含量、真黑色素與總黑色素的比值以及血漿比色。

1.4 基因組DNA的提取

采用血液基因組DNA純化試劑盒(Genmark公司)提取綿羊血液DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。提取的DNA于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設計

根據綿羊3號染色體(NC_040254)上SLC17A8基因全長序列，采用Premier premier 6.0軟件設計11對外顯子引物。SLC17A8基因11對引物序列信息見表1。

1.6 PCR擴增

PCR反應為25.0 μL反應體系，其中含金牌MIX(green)22 μL、DNA模板(20 ng/μL)1 μL、上游和下游下引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，退火溫度見表1，退火10 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，成像分析儀檢測結果后送至昆明碩擎生物技術有限公司測序。

表1 引物序列信息

1.7 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 黑色素含量測定結果

由表2可知，蘭坪烏骨綿羊血漿TYR活性顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。綿羊類群、性別以及年齡對血漿TYR活性具有顯著影響(P<0.05)，但是三者的兩兩互作效應對TYR沒有顯著影響；脫黑色素含量兩者差異不顯著(P>0.05)。類群、性別、年齡以及三者間的兩兩互作效應對血漿脫黑色素含量沒有顯著影響(P>0.05)；堿溶性黑色素含量蘭坪烏骨綿羊低于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。類群和年齡對血漿中堿溶性黑色素含量有顯著影響(P<0.05)，性別以及三種互作效應對其沒有顯著性影響(P>0.05)；總黑色素兩者差異不顯著；真黑色素與總黑色素的比例蘭坪烏骨綿羊顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。除類群外，其余指標對真黑色素/總黑色素均無顯著性影響；血漿比色蘭坪烏骨綿羊顯著高于蘭坪普通綿羊(P<0.05)。

表2 蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊黑色素含量的比較及相關影響因素的方差分析

2.2 SNP位點的篩選

2.2.1SLC17A8基因PCR擴增 如圖2所示，電泳片段與預期結果一致，測序后所得11對引物擴增產物片段大小分別是297、484、392、377、425、458、594、503、505、466、599 bp，將11段序列與引物源序列進行比對以及序列拼接，獲得外顯子總長度為1 770 bp的序列。

圖2 蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因外顯子擴增電泳圖

2.2.2 PCR產物測序結果 測序結果SLC17A8-EX3、SLC17A8-EX5、SLC17A8-EX6、SLC17A8-EX8、SLC17A8-EX9、SLC17A8-EX10的片段與綿羊(NC_040254)DNA序列比對相似性100%；SLC17A8-EX1與其相似性98.02%，此段序列共2個多態(tài)位點(C139T、G159A)；SLC17A8-EX2與其相似性98.80%，此段序列總共3個多態(tài)位點(G87A、A150C、C161A)；SLC17A8-EX4與其相似性98.26%，此段序列共2個多態(tài)位點(C149T、T158C)；SLC17A8-EX7與其相似性98.57%，該段序列共2個多態(tài)位點(C181T、T195C)；SLC17A8-EX11與其相似性99.22%，該段序列多態(tài)位點為T271C；SLC17A8-EX12與其相似性99.71%，該段序列多態(tài)位點為C173T。

整個片段共11個突變位點，其中EX1的第2個突變位點(G159A)和EX2的第1個位點(G87A)為錯義突變，其余突變位點均為同義突變。G159A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Glu；G87A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Arg。

2.2.3SLC17A8基因多態(tài)性 蘭坪烏骨綿羊與蘭坪普通綿羊11個多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率如表3所示。

表3 綿羊SLC17A8基因多態(tài)位點基因型及等位基因頻率

2.2.4SLC17A8基因多態(tài)性與烏質性狀的關聯性分析 烏骨綿羊的烏質性狀主要通過黑色素含量指標進行量化，將11個多態(tài)位點的基因型與黑色素指標進行關聯性分析，結果見表4。

表4 SLC17A8基因多態(tài)性與蘭坪烏骨綿羊烏質性狀的關聯分析

將SLC17A8基因多態(tài)位點與蘭坪烏骨綿羊烏質性狀關聯分析，結果顯示在蘭坪烏骨綿羊的不同位點(除EX2-C161A)不同基因型間綿羊酪氨酸酶活性具顯著差異，其中EX1-C139T位點上CC型綿羊真黑色素/總黑色素指標含量顯著高于CT型綿羊，EX1-G159A位點上GG型綿羊血漿比色顯著高于GA型綿羊。在相同基因型不同綿羊類群間，所有位點不同類群綿羊間真黑色素/總黑色素指標具有顯著差異(P<0.05)(除EX1-C139T位點上CT型綿羊)。其中EX1-C139T位點上CC型蘭坪烏骨綿羊酪氨酸酶活性和堿溶性黑色素含量顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX1-G159A位點上GA型蘭坪烏骨綿羊脫黑色素、堿溶性黑色素和酪氨酸酶活力以及GG型堿溶性黑色素和血漿比色顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX2-G87A位點上GG型堿溶性黑色素以及AA型脫黑色素、血漿比色和酪氨酸酶活性顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX2-A150C位點上AA型蘭坪烏骨綿羊脫黑色素和血漿比色以及酪氨酸酶活力顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX4-C149T位點和EX4-T158C位點上CC型和CT型血漿比色以及CC型酪氨酸酶活力顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX7-C181T位點上CC型蘭坪烏骨綿羊堿溶性黑色素含量顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX7-T195C位點上TT型和EX11-T271C位點上CC型蘭坪烏骨綿羊酪氨酸酶活力和血漿比色指標顯著高于普通綿羊(P<0.05)；EX12-C173T位點上CC型和CT型蘭坪烏骨綿羊血漿比色以及CT型堿溶性黑色素顯著高于普通綿羊(P<0.05)，其他指標差異均不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊血液黑色素含量分析

黑色素是蘭坪烏骨綿羊體內重要的功能成分，黑色素的光保護作用、富集微量元素、增強機體抵抗力等功能都將促進蘭坪烏骨綿羊藥用價值和食用價值的發(fā)掘[11]。高含量的真黑色素是烏骨綿羊烏質性狀形成的直接原因[12]，真黑色素的產生依賴于高水平的TYR活力，若TYR活力相對較低，則趨于脫黑色素的產生，故蘭坪烏骨綿羊機體具有相對較高的真黑色素含量，真黑色素與總黑色素比例也較高，綿羊血漿中真黑色素與總黑色素比例會直接影響血漿比色[13]。因此，分析綿羊TYR活力、真黑色素和總黑色素比例、血漿比色等指標也具有理論依據。真黑色素最后通過黑色素細胞產生再通過血液運輸到各組織器管，最后形成促使烏骨綿羊烏質性狀的產生。但目前關于動物烏質性狀的形成機理尚不明晰，其形成機理是培育更加優(yōu)良的蘭坪烏骨綿羊亟待解決的問題。

通過測定分析發(fā)現，除總黑色素和脫黑色素外蘭坪烏骨綿羊的TYR活力、真黑色素/總黑色素、血漿比色等生化指標值均顯著高于普通綿羊。烏骨綿羊血漿中TYR活力、真黑色素/總黑色素、血漿比色分別為377.010±21.910 IU/mL、0.320±0.010、0.089±0.007 OD/mL，顯著高于普通綿羊的321.522±10.702 U/mL、0.251±0.004、0.071±0.035 OD/mL。

3.2 位點突變對蛋白功能的影響

本試驗通過擴增SLC17A8基因的外顯子區(qū)，在其外顯子上共找到11個突變位點，其中EX1 G159A和EX2 G87A為錯義突變，其余突變位點均為同義突變。G159A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Glu；G87A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Arg。核苷酸序列的改變會在mRNA水平上擾亂了相應區(qū)域的外顯子剪接增強子基因序列，導致外顯子剪接增強子不能被調控因子所識別，使得相應的蛋白出現截短，從而導致疾病的發(fā)生，且基因突變對蛋白質的三維結構及功能結構域起著至關重要的作用[14]。吳宣富等[15]采用PCR-SSCP和DNA測序技術，檢測20例有家族史的有先兆和無先兆偏頭痛患者，結果G2094A基因突變可能通過轉錄、轉錄后翻譯以及翻譯后加工等多環(huán)節(jié)中的某步驟影響蛋白質的表達，從而導致偏頭痛的發(fā)生。Komar等[16]研究發(fā)現，MDRI基因的C3435T位點突變導致機體合成了不同結構和功能特性的蛋白質。秦丹卿等[17]對攜帶β-地中海貧血基因孕婦患者進行基因診斷，首次鑒定出一種突變類型CD29，該基因突變類型具有高度的地域異質性。這與蘭坪烏骨綿羊和其他綿羊種群所處的地域差異一致，雖目前尚未關于蘭坪烏骨綿羊烏質性狀的產生與地域異質性的關聯報道，但這對于進一步研究蘭坪烏骨綿羊烏質性狀的產生機理具有重要的指導意義。

3.3 SLC17A8基因多態(tài)性與蘭坪烏骨綿羊烏質性狀關聯分析

前人研究表明SLC17A8基因編碼的VGLUT3蛋白在嚙齒類動物和人類視網膜無軸突細胞[18]、小鼠的肝臟、腎臟均有表達[19-21]；VGLUT3位于毛細胞突觸囊泡膜上，對L-谷氨酸(底物)有著非常強的特異性，L-谷氨酸能特異將谷氨酸轉運至突觸后膜，產生動作電位，達到傳遞聽覺信號的作用[22]。Obholzer等[23]以斑馬魚為研究對象，利用敲除技術將SLC17A8基因外顯子2敲除，發(fā)現外顯子2的缺失導致mRNA編碼的VGLUT3蛋白數量減少，引起神經傳遞過程中突觸小泡數量不足，在一級神經元的前提下無法產生動作電位，最終導致聽覺信號傳導失敗。Fremeau等[24]對小鼠進行免疫組織熒光分析，結果顯示SLC17A8蛋白在中樞神經系統(tǒng)廣泛表達。SLC17A8基因突變主要通過引起Glu的釋放減少，進而引起相應的疾病。蘭坪烏骨綿羊由于生長于高原地區(qū)常年接受紫外線的照射而產生大量的Glu，但SLC17A8基因是否對蘭坪烏骨綿羊黑色素的形成機理產生影響還需要進一步深入研究。

將蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊SLC17A8基因的11個多態(tài)位點的基因型與血漿中黑色素含量指標進行關聯分析，結果顯示在蘭坪烏骨綿羊的不同基因型間EX1-G139A位點上CC型綿羊酪氨酸酶活性和真黑色素/總黑色素指標顯著高于CT型綿羊；EX1-G159A位點上GG型綿羊血漿比色顯著高于GA型綿羊，但酪氨酸酶活力顯著低于GA型綿羊；EX2-C87A位點上AA型綿羊酪氨酸酶活力顯著高于GG型和GA型綿羊，GG型綿羊堿溶性黑色素顯著高于GA型；EX2-C161A位點上AA型綿羊脫黑色素含量顯著高于AC型綿羊；EX4-C149T位點和EX4-T158C位點上三種基因型酪氨酸酶活力差異顯著，其中CT基因型最高；EX7-C181T位點和EX7-T195C位點上TT型綿羊酪氨酸酶活力顯著高于CC型和CT型綿羊。因此，CC、AA、CT和TT型為蘭坪烏骨綿羊的優(yōu)勢基因型。

綜上所述，SLC17A8基因的11個多態(tài)位點的突變可能影響機體內部糖蛋白的構象，因此可以推測SLC17A8基因的突變可能通過影響SLC17A8蛋白的構象而對SLC17A8蛋白功能造成影響，解除了SLC17A8對黑色素細胞的分化、分裂及轉移的抑制作用，導致黑色素細胞不僅僅是遷移至皮膚、毛發(fā)等部位，而是通過遷移到達機體各組織器官，進而使得黑色素在烏骨綿羊各組織中均有表達，導致烏骨綿羊呈現出烏質性狀，具體的影響機制還有待于進一步研究。

4 結 論

蘭坪烏骨綿羊TYR活力、血漿比色、真黑色素/總黑色素指標顯著高于普通綿羊，但堿溶性黑色素含量顯著低于普通綿羊(P<0.05)；蘭坪烏骨綿羊SLC17A8基因編碼區(qū)序列長1 770 bp，編碼589個氨基酸，共發(fā)現11個突變位點，其中外顯子1的G159A和外顯子2的G87A為錯義突變，其余突變位點均為同義突變。G159A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Glu，G87A位點編碼的氨基酸由Gly突變到Arg；蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊混合群體基因分布存在顯著差異(P<0.05)，CC、AA、CT和TT型為蘭坪烏骨綿羊的優(yōu)勢基因型。