豬輪狀病毒診斷方法研究進(jìn)展

袁 生，王聰穎，郭錦玥，黃淑堅，溫 峰

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225)

豬輪狀病毒(porcine rotavirus, PoRV)是導(dǎo)致仔豬流行性腹瀉的主要病原之一，可以引起仔豬腹瀉、厭食和嘔吐等癥狀，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康和發(fā)展。隨著檢測技術(shù)的快速發(fā)展，PoRV的檢測技術(shù)不斷更新?lián)Q代，主要有病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等鑒別診斷方法，為PoRV的防控提供了有效的應(yīng)對措施。

PoRV常與一些腸道病毒混合感染使病情加速惡化，造成難以挽回的嚴(yán)重?fù)p失。更經(jīng)濟(jì)高效且靈敏的PoRV鑒別診斷技術(shù)對保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。近年來，隨著分子生物學(xué)診斷方法的迅速發(fā)展，諸如常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)、熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)、二代測序、RNA原位雜交檢測(ISH-RNA)和Luminex xTAG等分子診斷技術(shù)的應(yīng)用推動了PoRV診斷方法的快速發(fā)展。本文綜述了PoRV診斷方法的研究進(jìn)展，為PoRV的診斷提供新思路。

1 病原學(xué)特征

1.1 病原組成

PoRV是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的成員[1]。PoRV無囊膜包被，形狀類似車輪，在電鏡下觀察病毒粒子直徑大小約為70 nm，其基因組由11個獨(dú)立片段的雙股正鏈RNA組成，共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中第11節(jié)段編碼NSP5和NSP6兩種非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。該病毒粒子從內(nèi)到外可分為核衣殼、內(nèi)衣殼和外衣殼。核衣殼由VP1、VP2和VP3組成。VP6蛋白是構(gòu)成輪狀病毒內(nèi)衣殼蛋白的主要成分。VP4和VP7蛋白共同構(gòu)成輪狀病毒的外層衣殼結(jié)構(gòu)蛋白[3]。

1.2 蛋白功能

結(jié)構(gòu)蛋白VP1具有核糖核酸聚合酶的特性，與PoRV的復(fù)制密切相關(guān)[4]。此外，結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5對PoRV的復(fù)制具有重要意義[5]。在先天性免疫應(yīng)答中，結(jié)構(gòu)蛋白VP3可以阻止細(xì)胞寡聚腺苷酸合酶途徑的激活，非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1在干擾宿主的自然免疫應(yīng)答中扮演著重要角色，因此NSP1和VP3對先天免疫拮抗的結(jié)構(gòu)和機(jī)理基礎(chǔ)提供了重要見解[6]。衣殼的外層由VP7和VP4組成，可誘導(dǎo)病毒中和抗體，并且對PoRV的外形及外殼蛋白的穩(wěn)定和病毒的成熟非常重要。VP4由胰蛋白酶切割產(chǎn)生VP8(28 kDa)和VP5(60 kDa)片段，它們能促進(jìn)PoRV與宿主細(xì)胞結(jié)合的能力[7]。結(jié)構(gòu)蛋白VP6是介導(dǎo)粘膜免疫的特異性抗原，具有很強(qiáng)的免疫原性[8]。與此同時，非結(jié)構(gòu)蛋白在PoRV生命鏈中也發(fā)揮著重要作用。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2參與PoRV的形成，以及基因組復(fù)制和病毒組裝[9]。在重組病毒過程中產(chǎn)生的NSP3能誘導(dǎo)細(xì)胞poly(A)結(jié)合蛋白的核聚集[10]。盡管PoRV是無囊膜病毒，但病毒附著到細(xì)胞膜后，會采用已經(jīng)裂解的VP4蛋白的融合機(jī)制，通過質(zhì)膜穿孔進(jìn)入細(xì)胞，這是除了受體介導(dǎo)途徑之外的另一種病毒進(jìn)入途徑[3]。NSP6是由基因11的異相開放閱讀框(open reading frames, ORFs)編碼的核酸結(jié)合蛋白，雖然其ORFs存在于大多數(shù)PoRV中，但NSP6非病毒復(fù)制所必需[2]。

2 流行現(xiàn)狀

2.1 臨床癥狀

豬輪狀病毒病是由PoRV引起的豬急性腸道傳染病[11]。其基本特征為嘔吐、腹瀉和脫水。在臨床中，仔豬在感染該病后初期采食量減少、精神不振、行為懶散和伴發(fā)嘔吐癥狀，并且其腹瀉最為嚴(yán)重，糞便呈水樣或糊狀，顏色為黃色或黑紅色[12]。成年豬表現(xiàn)精神不濟(jì)、食欲減退和腹瀉，母豬則可出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎癥狀。

2.2 病理剖檢

剖檢后發(fā)現(xiàn)患病豬的病理性變化主要集中于消化道，特別是小腸。其胃內(nèi)充滿沒有消化的乳凝塊和乳汁，且胃壁松弛[13]。腸道內(nèi)有黑色或黃色水樣內(nèi)容物，腸壁變薄變透明，腸系膜的淋巴結(jié)異常腫大，腸絨毛縮短，可以看見發(fā)生增生的隱窩細(xì)胞和浸潤的淋巴細(xì)胞[14]。

2.3 流行歷史

豬A型輪狀病毒、豬B型輪狀病毒和豬C型輪狀病毒與仔豬的腹瀉密切相關(guān)。近年來，在日本、巴西和美國的豬腹瀉樣本中分離到了豬H型輪狀病毒，且證實(shí)這一新型輪狀病毒也是造成仔豬腹瀉的病原之一[15]。PoRV引起的仔豬腹瀉一般發(fā)生于早春、深秋和寒冬，且各個年齡階段的豬均表現(xiàn)易感。其中，2～6周齡仔豬發(fā)病多，死亡率在50%以下[16]。自2010年底以來，中國多地大規(guī)模爆發(fā)了由PoRV引起的仔豬嚴(yán)重腹瀉。Xue等[17]從山東10個出現(xiàn)腹瀉的農(nóng)場采集到1～3月齡的乳豬和斷奶豬共226份樣本，其中有65份(28.76%)檢測到PoRV。隨后，Zhang等[18]在華南5個省份的168個養(yǎng)豬場收集了總共2 987個樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PoRV常與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬Delta冠狀病毒(porcine delta coronavirus, PDCoV)和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)等腸道病毒混合感染。

3 檢測技術(shù)

3.1 病原學(xué)檢測方法

3.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒 根據(jù)病毒的細(xì)胞噬性，選擇相應(yīng)的原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離及培養(yǎng)。Bohl等[19]在試驗中發(fā)現(xiàn)，將臨床PoRV陽性樣品經(jīng)胰蛋白酶處理后，接種于恒河猴胎腎細(xì)胞(MA104)，成功地分離出輪狀病毒(rotavirus, RV)，解決了細(xì)胞分離培養(yǎng)RV的問題。隨后，馬士博等[20]對PoRV HeBei-12株的生長特性進(jìn)行研究，繪制了生長曲線并確定了病毒在MA-104細(xì)胞上的最佳繁殖時間。雖然已經(jīng)成功分離培養(yǎng)出PoRV，但是細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒周期較長，并且操作難度大、成本高，不利于對臨床樣品進(jìn)行大規(guī)模檢測。

3.1.2 電鏡觀察 基本原理是利用電鏡直接觀測樣本中是否存在病毒顆粒。其中，實(shí)驗室常用直接電鏡檢測法和免疫電鏡檢測法。王振玲等[21]用直接電鏡檢測法觀察到病毒顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)，并鑒定出PoRV。當(dāng)PoRV與PEDV和TGEV等其他病毒混和感染時，可以使用免疫電鏡檢測法，通過特異性抗體捕捉病毒，觀察聚集的病毒抗原復(fù)合物來進(jìn)行鑒定，還可以采取多價抗體，滿足同時檢測其他與腹瀉相關(guān)病毒的要求[22]。Benfield等[23]比較了病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)、免疫電鏡檢測法和熒光抗體技術(shù)檢測PoRV的敏感性，發(fā)現(xiàn)免疫電鏡檢測法敏感性強(qiáng)于熒光抗體技術(shù)和病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)。

3.2 免疫學(xué)檢測方法

3.2.1 乳膠凝集 乳膠凝集試驗是采用乳膠粒子作為載體的間接凝集試驗。該方法操作簡單、成本低且檢測快，但需要具備充足的經(jīng)驗來判斷結(jié)果。Sanekata等[24]改進(jìn)了一種能快速確診PoRV的簡便凝集試驗方法。Sobanski等[25]使用超聲懸浮處理病毒顆粒后進(jìn)行乳膠凝集試驗，發(fā)現(xiàn)檢測PoRV抗原的靈敏度比改進(jìn)前提高了32倍。這些改進(jìn)舉措大大推動了乳膠凝集檢測方法的應(yīng)用。

3.2.2 免疫膠體金 主要是利用膠體金免疫顯示技術(shù)，包被診斷標(biāo)記物對靶定的抗原或抗體進(jìn)行檢測。崔曉辰等[26]利用豬A型輪狀病毒OSU毒株(G5型)VP6蛋白的特異性單克隆抗體制作豬A型輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條，可以檢出5.4 μg/mL純化的PoRV OSU毒株抗原和1.0×103.4TCID50/mL病毒。這種方法與其他免疫學(xué)檢測方法相比，檢測效率高、特異性強(qiáng)、敏感性好，且可視化檢測結(jié)果。

3.2.3 ELISA 利用生物素-親和素系統(tǒng)，對檢測物靶定的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行顯色，并通過顯色程度對檢測物進(jìn)行定性甚至是定量。Memon等[27]通過使用VP6靶向的兔多克隆抗體，開發(fā)了一種快速、高度特異性和靈敏的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附測定(AC-ELISA)方法，且AC-ELISA的檢出限與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)基本一致。王婧怡等[28]利用ELISA檢測方法對感染PEDV、PoRV和TGEV的發(fā)病種豬血清樣品進(jìn)行了血清學(xué)檢測，證實(shí)PoRV感染率最高。

3.3 分子生物學(xué)檢測方法

3.3.1 RT-PCR 在RT-PCR中，將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，針對病毒基因組的保守區(qū)域設(shè)計引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因。趙鳳菊等[29]建立豬A型輪狀病毒NSP4基因RT-PCR檢測方法，該方法最低檢測濃度為13.17 pg/μL，應(yīng)用該方法對臨床樣品進(jìn)行了檢測，樣品陽性率為90%，與GenBank中其他豬A型輪狀病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。在此RT-PCR基礎(chǔ)上，逐漸延伸出多重RT-PCR診斷技術(shù)，可同時檢測多種豬源病毒。Ding等[30]建立PEDVN基因、TGEVN基因、豬A型輪狀病毒VP7基因、豬庫布病毒(Porcine Kobuvirus, PKoV)多聚蛋白基因、豬札幌病毒(porcine sapporo virus, PoSaV)多聚蛋白基因和PDCoVN基因的多重RT-PCR檢測方法，該方法的檢測限為100～101 ng cDNA。結(jié)果表明多重RT-PCR適用于PoRV，這種方法靈敏度好且效率高，可應(yīng)用于多種病原感染的臨床鑒別診斷。

3.3.2 RT-qPCR RT-qPCR可根據(jù)試驗?zāi)康倪x擇嵌入染色劑，是對特異性核酸序列進(jìn)行檢測的高敏感度技術(shù)。許夢怡等[31]根據(jù)TGEVM基因、PEDVM基因和PoRVVP2基因序列，成功建立了這3種病毒的TaqMan探針多重RT-qPCR方法。該方法對PoRV檢測靈敏度為4.96拷貝/μL，PoRV組內(nèi)重復(fù)試驗的C.V.最大值和組間重復(fù)性試驗的C.V.最大值均不超過5%，表明該方法重復(fù)性好。用此方法對這3種病毒樣本進(jìn)行檢測,均沒有交叉反應(yīng),表明此方法特異性好，但是探針等材料價格昂貴，所以試驗成本較高。隨后，李軍等[32]對TGEVS基因、PEDVS基因和PoRVNSP基因建立了多重RT-qPCR方法，PoRV的最低檢測量為25拷貝/μL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)小于5%，該方法與商品化的試劑盒檢測結(jié)果符合率達(dá)100%。RT-qPCR與RT-PCR相比，靈敏度高、特異性強(qiáng)且效率高。Jia等[33]基于雙引物寡核苷酸(DPO)的RT-qPCR方法，針對TGEVN基因、PEDVN基因、PDCoVN基因和PoRVVP7基因，在臨床樣本中準(zhǔn)確鑒別PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)引物相比，DPO引物擁有更寬的退火溫度范圍，且具有更高的引物特異性，但是DPO引物的3'-或5'-端有超過3個核苷酸與DNA模板不匹配，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率將大幅降低。該方法對PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV臨床標(biāo)本的檢測限分別為8.63×102拷貝/μL、1.92×102拷貝/μL、1.74×102拷貝/μL和1.76×102拷貝/μL。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，該方法的檢測精度更高，為PoRV的鑒別診斷提供一種有效的手段。除此之外，Liu等[34]成功建立出PEDV、TGEV、豬A型輪狀病毒、豬C型輪狀病毒和豬圓環(huán)病毒2(porcine circovirus 2，PCV2)多重RT-qPCR。在這項研究中通過擴(kuò)增序列大小不同，檢測和區(qū)分不同的病毒，實(shí)現(xiàn)了PoRV的快速高效率的鑒別診斷。隨后，曲雅新等[35]成功建立PoRVVP6基因、PoSaVRdRp基因和豬星狀病毒(porcine astrovirus，PAstV)ORF1基因的三重PCR檢測方法。Wen等[36]建立了基于EvaGreen熒光染料和熔解曲線分析的多重RT-qPCR方法，在一個封閉的單管中同時檢測TGEV、豬A型輪狀病毒、豬C型輪狀病毒、PEDV和PCV2，根據(jù)5種病毒對應(yīng)5個不同的Tm值，在多種病原中成功鑒別診斷出PoRV。該方法對這5種病毒的檢測靈敏度較高，檢出限為5～50 拷貝/μL，且重復(fù)性好，Tm和循環(huán)閾值的變異系數(shù)分別小于0.32%和2.86%，對90份現(xiàn)場樣品進(jìn)行單、多重RT-qPCR檢測，符合率為91.1%。所以EvaGreen多重RT-qPCR是一種快速，靈敏且低成本的診斷工具，可以適用于PoRV的常規(guī)檢測。

3.3.3 RT-LAMP RT-LAMP是在等溫條件下完成體外核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一種新型分子檢測技術(shù)，唯一需要的設(shè)備是恒溫加熱塊或水浴。此外，當(dāng)在熒光染料存在時，可以用肉眼直接觀察反應(yīng)結(jié)果，且染料還可以使用熒光檢測器來跟蹤反應(yīng)過程。胡興義等[37]依據(jù)GenBank的PoRVVP7基因保守區(qū)序列，設(shè)計了6條特異性引物，通過對外引物與內(nèi)引物濃度比、Bst DNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度和反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，成功建立和應(yīng)用PoRV RT-LAMP檢測方法。隨著RT-LAMP技術(shù)的成熟發(fā)展和廣泛應(yīng)用，Wang等[38]通過RT-LAMP成功區(qū)分PoRVN基因和其他導(dǎo)致仔豬腹瀉的病毒。該方法檢測迅速、靈敏度比傳統(tǒng)PCR高100倍，對PoRV的臨床診斷提供了一種新型的方法。

3.3.4 二代測序技術(shù) 該方法通過直接對種間和種內(nèi)水平的病毒株進(jìn)行測序，可以深入地描述快速變異病毒群體之間的遺傳多樣性，并且在一代測序技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了變革。Vidal等[39]通過二代測序技術(shù)調(diào)查了在豬場中爆發(fā)的16例豬腹瀉相關(guān)病例，其中檢測出豬A型輪狀病毒，且其VP7和VP4基因發(fā)生了突變。緊隨其后，Cortey等[40]通過二代測序技術(shù)檢測了47個農(nóng)場中腹瀉新生仔豬糞便，探討了西班牙腹瀉新生仔豬糞便中RNA病毒的多樣性，只使用提取的總RNA，而不需要任何擴(kuò)增步驟，其中所獲得的結(jié)果代表樣本中大多數(shù)存在的RNA病毒，并且發(fā)現(xiàn)了豬B型輪狀病毒和豬C型輪狀病毒幾種新的VP7和VP4基因。雖然該方法成本高昂，但是它利用了高通量測序平臺，對物種的基因組進(jìn)行分析，能更快更好的監(jiān)測新物種的出現(xiàn)及其流行,并且該技術(shù)已成功應(yīng)用于豬糞便病毒基因組的多樣性鑒定。

3.3.5 ISH-RNA ISH-RNA是一種用于檢測福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織切片中特定核酸序列的方法。與PCR相似，ISH基于RNA序列，但具有識別組織損傷中核酸的能力。傳統(tǒng)ISH技術(shù)特異性好，但是短核苷酸序列的標(biāo)記效率較低且敏感性有限。Resende等[41]開發(fā)了一種新穎的ISH-RNA，用來檢測PoRVVP6基因，通過同時檢測1個或2個探針，研發(fā)出一種用于檢測豬A型輪狀病毒、豬B型輪狀病毒和豬C型輪狀病毒的雙鏈分析的ISH-RNA技術(shù)。雖然該方法僅能檢測103個PoRVRNA拷貝/mL，但是通過特異性雜交信號的放大克服了經(jīng)典ISH技術(shù)的局限性。新的ISH-RNA檢測可用于PoRV的常規(guī)調(diào)查，以防控PoRV廣泛流行，但仍處于初步探索階段。

3.3.6 Luminex xTAG 該方法采用Luminex 特有的通用標(biāo)簽，通過標(biāo)簽序列與反標(biāo)簽序列的專一性互補(bǔ)配對，進(jìn)行核酸試驗優(yōu)化。Shi等[42]建立了一種檢測PEDVM基因、PDCoVM基因、TGEVN基因和PoRVVP6基因等11種病毒性腹瀉病原的Luminex xTAG多重檢測方法。現(xiàn)有的多重PCR方法只針對2個或3個靶向基因，不能適應(yīng)高通量檢測。然而，Luminex xTAG檢測技術(shù)革新了在單一反應(yīng)中同時檢測和定量多個核酸的方法，這種方法甚至可以少量使用。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，比常規(guī)多重PCR方法更敏感且更特異，已逐漸用于病原鑒定。

4 展 望

PoRV是目前引起仔豬腹瀉較為普遍存在的病原之一，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。近幾年，隨著PoRV鑒別診斷方法地推陳出新，病原學(xué)診斷方法存在方法單一和操作難度系數(shù)大，免疫學(xué)診斷方法成本高和效率低等問題，正逐漸被分子生物學(xué)診斷方法所替代。RT-PCR檢測方法已經(jīng)由單一RT-PCR向多重RT-PCR方向發(fā)展，并且多重RT-PCR和單一RT-PCR的檢測結(jié)果基本一致；RT-qPCR檢測方法已經(jīng)克服傳統(tǒng)PCR缺點(diǎn)，操作簡便、特異性強(qiáng)且靈敏度高，但是由于探針等材料昂貴，所以檢測成本高；RT-LAMP檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性；二代測序技術(shù)具有高通量，但是測序時間長且成本高；ISH-RNA沒有DNA原位雜交檢測(ISH-DNA)效果好，因為RNA理化性質(zhì)不穩(wěn)定，空氣中存在廣譜性的RNA酶，在試驗操作中RNA易被降解，所以ISH-RNA應(yīng)用不廣泛；Luminex xTAG特異性好且敏感度高，比常規(guī)PCR檢測效果好，已經(jīng)逐漸被廣泛應(yīng)用。目前由PoRV引起仔豬腹瀉已經(jīng)成為養(yǎng)豬業(yè)亟需解決的問題，但市面上仍缺少特效藥及成熟的疫苗進(jìn)行治療與防控。開發(fā)更快捷更靈敏的檢測技術(shù)，對掌握該病流行規(guī)律至關(guān)重要。