Dectin-2受體介導(dǎo)宿主抵抗煙曲霉菌感染的研究

吳夢(mèng)雪， 于 垚， 郭 文， 王蓉蓉， 賈鑫明

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

Dectin-2(由Clec4n編碼)最初鑒定為朗格漢斯細(xì)胞特異性C型凝集素受體，隨后研究發(fā)現(xiàn)在樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中也表達(dá)[6-7]。Dectin-2受體能夠識(shí)別白念珠菌細(xì)胞壁表面的α-甘露聚糖成分，激活脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)-核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路并促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-12p40、IL-6等炎癥因子來(lái)啟動(dòng)宿主天然免疫反應(yīng)[8]。肺曲霉菌感染患者中肺泡巨噬細(xì)胞Dectin-2受體高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該受體通過(guò)Syk依賴(lài)的NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，并介導(dǎo)人肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)煙曲霉菌膨脹態(tài)分生孢子的殺傷作用[9-10]。但在小鼠肺部感染模型中Dectin-2是否介導(dǎo)宿主抗煙曲霉菌感染是未知的，因此本文通過(guò)構(gòu)建小鼠肺煙曲霉菌感染模型和煙曲霉菌刺激BMDMs的體外炎癥模型，探究Dectin-2受體在肺曲霉菌感染過(guò)程中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

本研究使用的煙曲霉菌株AF293為實(shí)驗(yàn)室保存菌種，PDA培養(yǎng)基購(gòu)自明舟生物，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自澳洲Gibco公司，鏈霉素-青霉素雙抗(PS)和無(wú)菌PBS購(gòu)自南京維森特生物技術(shù)有限公司，TNF-α、IL-12p40和IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，10%SDS-PAGE蛋白膠預(yù)混液和轉(zhuǎn)膜液購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，20×TBS、吐溫-20、脫脂奶粉購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自上海默克生命科學(xué)有限公司，p-IκBα、p-Syk、Syk和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，HRP標(biāo)記的鼠抗羊IgG抗體和兔抗羊IgG抗體購(gòu)自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司，37 ℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司，垂直板凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，組織研磨儀購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型C57雌性小鼠購(gòu)于上海斯萊克公司，Clec4n-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)室保存品系，本研究所用小鼠均飼養(yǎng)在同濟(jì)大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 方法

1.3.1 煙曲霉菌的培養(yǎng)及膨脹態(tài)分生孢子的制備 將煙曲霉菌孢子接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，將煙曲霉菌分生孢子沖洗刮下，并經(jīng)70 μm濾器過(guò)濾除去菌絲片段，濾液即為煙曲霉菌靜息態(tài)分生孢子(resting conidia, RC)。將RC置于1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h，即可得到膨脹態(tài)分生孢子(swollen conidia, SC)。

1.3.2 小鼠肺煙曲霉菌感染模型的建立 小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，將其垂直放置并拉出舌頭，用移液槍吸取30 μL包含4×107個(gè)煙曲霉菌分生孢子的懸液，緊貼舌根將孢子懸液緩緩滴入小鼠口腔中。小鼠感染2 d后處死，并摘取肺臟進(jìn)行研磨。將研磨液進(jìn)行梯度稀釋后，吸取100 μL涂布于PDA培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)。剩下的勻漿液離心(離心半徑8 cm，12 000 r/min，10 min)后取上清液，保存于-20 ℃，用于后續(xù)細(xì)胞因子的檢測(cè)。

1.3.3 體外SC刺激 BMDMsWT和Clec4n-/-小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解后，加入DMEM培養(yǎng)基(10%FBS+1%雙抗+40 ng/mL M-CSF)，置于15 cm 平皿中在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，補(bǔ)液10 mL 上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后吸去培養(yǎng)基上清液，經(jīng)Tris-EDTA-Nacl(TEN)緩沖液消化后，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸BMDMs并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將BMDMs以3×106/mL的細(xì)胞密度植在12孔板內(nèi)，并分為對(duì)照組、刺激20 min和40 min組。以6×105/mL的細(xì)胞密度將BMDMs植在48孔板內(nèi)，分為對(duì)照組和刺激16 h組，每組3個(gè)復(fù)孔；按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=5向12孔板和48孔板的刺激組中加入經(jīng)紫外線(xiàn)滅活的煙曲霉菌SC，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

1.3.4 Western印跡法 WT和Clec4n-/-小鼠BMDMs按照1.3.3分組處理后，刺激20 min和40 min 后棄去培養(yǎng)基上清液，加入預(yù)冷的含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，收集細(xì)胞上清液，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃煮10 min進(jìn)行變性。每組取10 μL進(jìn)行SDA-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入p-IκBα(1∶500)，p-Syk(1∶1 000)，Syk(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次后再加入1∶10 000稀釋的HRP-羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次后經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑孵育，凝膠成像系統(tǒng)下成像。

1.3.5 ELISA 按照1.3.3分組處理，刺激16 h后收集48孔板中BMDMs上清液。將細(xì)胞上清液和1.3.2中肺臟勻漿液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的使用方法進(jìn)行TNF-α、IL-12p40和IL-6的檢測(cè)。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出TNF-α、IL-12p40和IL-6的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Dectin-2介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的活化

在WT BMDMs中，煙曲霉菌刺激20 min和40 min 后，Syk和IκBα磷酸化水平逐漸增強(qiáng)，NF-κB信號(hào)通路被激活，而Clec4n-/-BMDMs中Syk和IκBα的磷酸化水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1A、B。表明Dectin-2受體介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的Syk依賴(lài)性NF-κB信號(hào)通路的活化。

圖1 Dectin-2缺失對(duì)BMDMs NF-κB通路的影響Fig.1 The effect of Dectin-2 deficiency on NF-κB pathway in BMDMsA: Western印跡法；B、C: p-Syk、p-IκBα定量分析；*P<0.05，****P<0.000 1

2.2 Dectin-2介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子分泌

BMDMs在未刺激時(shí)分泌低水平的細(xì)胞因子，煙曲霉菌刺激16 h后，WT BMDMs產(chǎn)生高水平的IL-6、TNF-α和IL-12p40，和WT BMDMs相比，Clec4n-/-BMDMs產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平顯著降低(P分別為0.004 2、0.001 9和P<0.000 1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。表明Dectin-2受體參與介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的BMDMs炎癥因子分泌。

圖2 Dectin-2缺失對(duì)BMDMs細(xì)胞因子分泌的影響Fig.2 The effects of Dectin-2 deficiency on cytokine secretion in BMDMsA: IL-6；B: TNF-α；C: IL-12p40；**P<0.01，****P<0.000 1

2.3 Dectin-2缺失增加小鼠對(duì)煙曲霉菌的易感性

煙曲霉菌感染2 d后，Clec4n-/-小鼠肺臟荷菌量顯著高于WT小鼠(P=0.003 2)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。結(jié)果說(shuō)明Dectin-2受體缺失增加了小鼠對(duì)煙曲霉菌的易感性。

圖3 Dectin-2缺失對(duì)小鼠肺臟荷菌量的影響Fig.3 The effect of Dectin-2 deficiency on fungal burdens of lungs in mice**P<0.01

2.4 Dectin-2缺失降低小鼠肺臟促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生

WT和Clec4n-/-小鼠在未感染狀態(tài)下肺臟勻漿液中IL-6和IL-12p40水平較低，感染煙曲霉菌后，Clec4n-/-小鼠肺臟勻漿液中IL-6(P=0.008 8)和IL-12p40(P=0.001 7)的水平顯著低于WT小鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4A、B。結(jié)果表明Dectin-2缺失降低了小鼠肺臟中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

圖4 Dectin-2缺失對(duì)小鼠肺臟細(xì)胞因子的影響Fig.4 The effect of Dectin-2 deficiency on cytokine production of lungs in miceA: IL-6；B: IL-12p40；**P<0.01

3 討 論

Dectin-2是CLRs中的 Ⅱ 型跨膜受體，主要分布于髓系細(xì)胞表面[11]。研究表明Dectin-2能夠識(shí)別白念珠菌、馬拉色菌等多種真菌α-甘露聚糖和α-1，2-甘露糖殘基[12-13]。煙曲霉菌細(xì)胞壁中存在兩種甘露聚糖結(jié)構(gòu)，分生孢子和菌絲體中都存在半乳甘露聚糖，而半乳糖胺半乳聚糖僅存在于菌絲體細(xì)胞壁中[14-15]，因此Dectin-2可能識(shí)別煙曲霉菌。本研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2缺失降低了煙曲霉菌膨脹態(tài)分生孢子誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α和IL-12p40的分泌，并降低NF-κB信號(hào)通路的活化。Dectin-2通過(guò)偶聯(lián)FcRγ啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，活化Syk后進(jìn)一步誘導(dǎo)胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9, CARD9)、B細(xì)胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma 10, BCL10)和黏膜相關(guān)淋巴組織蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1)形成三元復(fù)合物，從而激活NF-κB促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[16]，另外Dectin-2還以CARD9非依賴(lài)方式激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)信號(hào)途徑介導(dǎo)抗真菌免疫[17]。以往結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dectin-2通過(guò)Syk-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinasePI3K)-CARD9信號(hào)通路介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞吞噬新型隱球菌[18]。Dectin-2還能識(shí)別莢膜組織胞漿菌觸發(fā)Syk-C-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路以激活NLRP3炎性體和IL-1β釋放[19]。因此，本課題組后續(xù)將會(huì)探究煙曲霉菌刺激后Dectin-2缺失對(duì)ERK、JNK等信號(hào)通路影響。

Dectin-2缺失使小鼠感染白念珠菌后生存率顯著下降，但不影響宿主對(duì)隱球菌感染的防御能力[8,20]。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠真菌性角膜感染模型中，Dectin-2缺失不影響宿主對(duì)煙曲霉菌的清除能力[21]。不同的是，在本研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2缺失使小鼠對(duì)煙曲霉菌肺部感染易感性顯著增高，肺臟中促炎因子IL-6和IL-12p40顯著降低。和本次研究結(jié)果一致的是，在侵襲性曲霉菌病患者中發(fā)現(xiàn)了Dectin-2的純合缺失突變，導(dǎo)致該患者外周血單個(gè)核細(xì)胞受煙曲霉菌刺激后，IL-6和TNF-α的分泌發(fā)生缺陷[22]。靶向遞送包被Dectin-2蛋白胞外段的抗真菌脂質(zhì)體，對(duì)侵襲性肺曲霉菌病有很好的治療作用[23]。另外，研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2介導(dǎo)人漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)識(shí)別煙曲霉菌，Dectin-2抗體阻斷能夠降低煙曲霉菌刺激的pDC中TNF-α和IFN-α的產(chǎn)生及抗真菌活性[24]。以上結(jié)論更加佐證了Dectin-2在肺煙曲霉菌感染中具有重要作用。但Dectin-2在曲霉菌性角膜炎和肺部感染模型中發(fā)揮作用并不相同，這提示著Dectin-2在不同感染模型中作用機(jī)制可能存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2參與介導(dǎo)煙曲霉菌誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌，但是Dectin-2受體缺失的BMDMs并沒(méi)有完全喪失分泌促炎細(xì)胞因子的能力，提示Dectin-2不是唯一參與識(shí)別煙曲霉菌的受體。除了研究最為廣泛的Dectin-1受體，其他CLRs也被報(bào)道參與到煙曲霉菌感染免疫中。DC-SIGN受體介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞和煙曲霉菌分生孢子的結(jié)合和內(nèi)吞，但DC-SIGN敲低并不影響煙曲霉菌胚芽管刺激后未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞TNF-α和IL-12的表達(dá)[25-26]。這些發(fā)現(xiàn)可能反映了固有免疫細(xì)胞對(duì)不同形態(tài)煙曲霉菌的響應(yīng)機(jī)制存在差異。MBL受體可以和煙曲霉菌分生孢子結(jié)合，并且用重組人MBL治療可提高小鼠侵襲性肺曲霉菌病模型中的存活率，增強(qiáng)了促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生[27-28]。在大鼠煙曲霉菌角膜炎模型中，Mincle受體在感染早期表達(dá)上調(diào)，并抑制了煙曲霉菌角膜炎中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡[29-30]。另外，在白念珠菌感染中Dectin-3缺失BMDMs中IL-6、TNF-α等促炎因子分泌減少，NF-κB激活水平降低，Dectin-2和Dectin-3 受體還能夠形成二聚體協(xié)同發(fā)揮抗白念珠菌感染作用[31]，但關(guān)于Dectin-3在煙曲霉菌感染中的研究還未有所報(bào)道。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在BMDMs中，C型凝集素受體Dectin-2激活煙曲霉菌誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路并介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在肺煙曲霉菌感染疾病中發(fā)揮重要作用。