四種救護(hù)陸龜糞便菌群組成分析

張笑穎 鄒潔建 肖嘉杰 陸宇燕 李丕鵬 古河祥 楊光大 侯方暉

(1.沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽，110034；2.廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心，廣州，510660)

存在了幾十億年的微生物已融合到各生物群落中，經(jīng)過長期的自然選擇與宿主形成親密的共生關(guān)系。動(dòng)物腸道是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，動(dòng)物機(jī)體生理?xiàng)l件(飲食類型、疾病等)和外界環(huán)境都會(huì)對(duì)腸道內(nèi)微生物產(chǎn)生影響[1]，以腸道微生物菌群的組成和相對(duì)豐度等指標(biāo)差異呈現(xiàn)出在不同物種和同種個(gè)體之間的差異[2]。Zhang等[3]通過對(duì)我國南方4種養(yǎng)殖蛇(舟山眼鏡蛇Najaatra、滑鼠蛇Ptyasmucosa、王錦蛇Elaphecarinata、尖吻蝮Deinagkistrodonacutus)的糞便微生物區(qū)系對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，腸道微生物菌群的組成和多樣性在種內(nèi)更為相似、種間差異極為明顯，表明同類但不同物種之間腸道微生物區(qū)系具有自身的獨(dú)特性，并在同類個(gè)體之間具有一定的相似性。相似的研究結(jié)果也在不同種鹿科(Cervidae)動(dòng)物的瘤胃菌群組成分析[4]中得到了很好的印證。

陸龜(Testudinidae)主要是草食性(生活在雨林中的陸龜是以植物為主的雜食性)，對(duì)纖維素的消化利用更依賴于相對(duì)穩(wěn)定的、具有特定功能的腸道群落[5]。目前爬行動(dòng)物腸道微生物的研究主要集中在蛇類(Serpentiformes)和蜥蜴類(Lacertifomes)，龜鱉類(Testudoformes)的研究相對(duì)較少[6]。本研究選取來自溫暖潮濕原始生境的緬甸陸龜(Indotestudoelongata)和豹龜(Stigmochelyspardalis)，以及來自干旱炎熱原始生境的蘇卡達(dá)陸龜(Centrochelyssulcata)和輻射陸龜(Astrochelysradiata)，通過分析4種陸龜?shù)募S便微生物菌群構(gòu)成，揭示腸道微生物結(jié)構(gòu)特征，旨在積累相關(guān)的生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

試驗(yàn)在廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心完成，選取在救護(hù)中心飼養(yǎng)半年以上的蘇卡達(dá)陸龜、豹龜、輻射陸龜和緬甸陸龜，觀察取樣期間常規(guī)投食。依據(jù)背甲長推算大致年齡(公式為樣本背甲長/成體背甲長，選取結(jié)果在0.5～0.8的個(gè)體)，選擇相近年齡段的個(gè)體(表1)，每種陸龜一組7只，依次標(biāo)記為S1～S7(蘇卡達(dá)陸龜)、B1～B7(豹龜)、F1～F7(輻射陸龜)、M1～M7(緬甸陸龜)。由于陸龜排便時(shí)間不確定，試驗(yàn)前一天下班前清理龜場(chǎng)糞便，試驗(yàn)當(dāng)天一早選擇較為新鮮的糞便取樣，以保證樣本的新鮮。取材時(shí)避免樣本被污染，僅取糞便中心部分，并將取出的樣本置于滅菌的離心管內(nèi)-20 ℃保存，待所有樣品采集完畢后送往上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序分析。由于蘇卡達(dá)陸龜樣本中2個(gè)樣本出現(xiàn)異常，剔除后最終得到26個(gè)樣本。

表1 4種救護(hù)陸龜樣本分組信息

1.2 微生物多樣性分析

使用Illumina公司NovaSeq PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)與質(zhì)量提取，采用NanoDrop紫外定量設(shè)備進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)。采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，用引物(正向引物5′-ACTCCTACG GGAGGCAGCA-3′；反向引物3′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)對(duì)樣本中細(xì)菌16S rRNA的可變區(qū)V3—V4基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25.00 μL：5.00 μL 5×反應(yīng)緩沖液，5.00 μL 5×GC緩沖液，2.00 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，1.00 μL 10 μmol·L-1正向引物，1.00 μL 10 μmol·L-1反向引物，2.00 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O以及0.25 μL Q5 DNA聚合酶。擴(kuò)增參數(shù)：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，25次循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。

采用QIIME 2(2019.4)完成序列質(zhì)控、去噪、聚類等步驟以及物種組成和多樣性分析。應(yīng)用Alpha多樣性方法，通過Chao Ⅰ、Observed species、Shannon和Simpson 4個(gè)指標(biāo)分析樣本物種多樣性和豐富度；使用Beta多樣性分析，通過基于unweighted UniFrac距離生成的非量度多維尺度分析(NMDS)評(píng)價(jià)樣本組間差異。利用Python LEfSe包等進(jìn)行LEfSe分析，尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種即標(biāo)志物種。采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理，由SPSS軟件通過單因素ANOVA分析，在經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)后分析組間是否存在顯著差異。菌群名稱和分類引用生物醫(yī)藥大辭典(https：//lpsn.dsmz.de/)。

1.3 16S rRNA功能預(yù)測(cè)分析

采用PICRUSt 2功能預(yù)測(cè)分析，根據(jù)最新的Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫信息，通過將現(xiàn)有的16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，了解檢測(cè)樣本中菌群功能的潛能。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物組成和結(jié)構(gòu)特征

通過QIIME 2軟件對(duì)4種陸龜共計(jì)26個(gè)糞便樣本進(jìn)行測(cè)序分析，采用DADA2方法對(duì)序列進(jìn)行去噪等步驟，獲得去重序列(amplicon sequence variants，ASVs)。

稀疏曲線顯示在測(cè)序深度為20 000時(shí)序列數(shù)量基本穩(wěn)定，表明測(cè)序深度可以真實(shí)反映樣本的基本情況(圖1)。所有樣品中，獲得平均長度為414.95 bp的1 615 523個(gè)有效序列。緬甸陸龜、蘇卡達(dá)陸龜、輻射陸龜和豹龜?shù)钠骄行蛄袛?shù)量分別為98 413、95 843、95 024和110 192；ASV數(shù)量從低到高分別是：蘇卡達(dá)陸龜(12 458個(gè))、豹龜(12 631個(gè))、輻射陸龜(12 973個(gè))、緬甸陸龜(13 770個(gè))。4種陸龜共享的ASV僅617個(gè)，蘇卡達(dá)陸龜和豹龜共享1 480個(gè)ASV、緬甸陸龜和蘇卡達(dá)陸龜共享1 556個(gè)ASV、輻射陸龜和蘇卡達(dá)陸龜共享1 574個(gè)ASV、緬甸陸龜和輻射陸龜共享2 222個(gè)ASV、緬甸陸龜和豹龜共享2 598個(gè)ASV、輻射陸龜和豹龜共享2 611個(gè)ASV(圖2)。

圖1 4種陸龜糞便微生物的稀疏曲線Fig.1 Analysis of sparsity curves of the four tortoise species 注：M.緬甸陸龜；S.蘇卡達(dá)陸龜；F.輻射陸龜；B.豹龜。下同 Note：M，Indotestudo elongate.S，Centrochelys sulcata.F，Astrochelys radiata.B，Stigmochelys pardalis.The same as below

圖2 4種陸龜糞便微生物的venn圖Fig.2 Venn diagram showing shared and specific ASVs among the fecal microorganisms of four tortoise species

全部樣本檢測(cè)到并注釋的微生物共包含18個(gè)門，相對(duì)豐度大于0.1%的菌門共有10個(gè)(圖3)，依相對(duì)豐度數(shù)值大小位列前4的是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和變形菌門(Proteobacteria)。4種陸龜樣本中，厚壁菌門的相對(duì)豐度最高，均在50%以上，其中輻射陸龜樣本相對(duì)豐度最高[緬甸陸龜(56.47%±7.64%)、蘇卡達(dá)陸龜(59.77%±8.24%)、輻射陸龜(70.04%±8.12%)、豹龜(59.01%±16.70%)]，緬甸陸龜與輻射陸龜組間存在顯著性差異(P=0.046)。擬桿菌門相對(duì)豐度(20.93%～35.64%)均位列第二，其中豹龜樣本最高[緬甸陸龜(32.02%±9.66%)、蘇卡達(dá)陸龜(27.33%±10.88%)、輻射陸龜(20.93%±7.34%)、豹龜(35.64%±16.51%)]，輻射陸龜與豹龜組間存在顯著性差異(P=0.041)?；ヰB(yǎng)菌門相對(duì)豐度(0.72%～6.10%)位列第三，其中蘇卡達(dá)陸龜樣本最高，豹龜樣本最低且小于1%[(緬甸陸龜(2.59%±1.60%)、蘇卡達(dá)陸龜(6.10%±4.53%)、輻射陸龜(3.10%±1.26%)、豹龜(0.72%±0.38%)]，輻射陸龜與豹龜組間存在顯著性差異(P=0.015)。變形菌門相對(duì)豐度(1.95%～4.58%)位列第四，緬甸陸龜相對(duì)豐度最高[緬甸陸龜(4.58%±3.22%)、蘇卡達(dá)陸龜(2.18%±0.75%)、輻射陸龜(3.65%±1.66%)、豹龜(1.95%±0.46%)]，4種龜組間均無顯著性差異。另外，厚壁菌門與擬桿菌門的比值(F/B)豹龜最低[緬甸陸龜(1.76±0.91)、蘇卡達(dá)陸龜(2.19±1.88)、輻射陸龜(3.35±2.11)、豹龜(1.66±4.43)]。

圖3 4種陸龜門水平大于0.1%菌門的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of four tortoise species greater than 0.1% phylum at phylum levels

屬水平分析(表2)顯示，檢測(cè)標(biāo)本中完成匹配的菌屬共有559個(gè)。從4種龜糞便樣本相對(duì)豐度之和看，排列在前50的菌屬(分析軟件僅提供前50的數(shù)據(jù))在整體中的占比沒有超過40%(輻射陸龜38.85%，緬甸陸龜32.68%、豹龜30.71%和蘇卡達(dá)陸龜19.29%)。相對(duì)豐度大于1%的菌屬，豹龜樣本共有8個(gè)菌屬，相對(duì)豐度最高的菌屬是普雷沃氏菌屬(Prevotella)；緬甸陸龜和輻射陸龜樣本均含有5個(gè)菌，相對(duì)豐度最高的菌屬均為氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)，后者雖大于前者3倍以上，但兩者間無顯著差異；蘇卡達(dá)陸龜樣本僅有4個(gè)菌屬，相對(duì)豐度值最高的是梭菌科-梭菌屬(Clostridiaceae-Clostridium)。此屬也是4種龜糞便樣本中唯一一個(gè)相對(duì)豐度均大于1%的菌屬。

表2 4種陸龜糞便菌群前10菌屬相對(duì)豐度

在相對(duì)豐度前10的菌屬中，僅有2個(gè)菌屬在相應(yīng)的龜種間呈顯著差異，其中八疊球菌屬(Sarcina)在蘇卡達(dá)陸龜和輻射陸龜之間呈顯著性差異，糞球菌屬(Coprococcus)在豹龜與緬甸陸龜、蘇卡達(dá)陸龜、輻射陸龜間均呈顯著性差異。

2.2 微生物多樣性與物種差異

4種陸龜微生物群落的Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)(圖4)顯示，Shannon，Simpson，ChaoⅠ及Observed species指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，其中蘇卡達(dá)陸龜在代表多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)最高(Shannon=8.85±0.70，Simpson=0.98±0.01)，但代表物種豐富度、對(duì)稀有物種更敏感的ChaoⅠ指數(shù)最低(3 687.25±661.22)。

圖4 4種陸龜糞便微生物Alpha多樣性Fig.4 Alpha diversity of microorganisms in fecal samples of four tortoise

非量度多維尺度分析(NMDS，圖5)表明，4種陸龜共26個(gè)樣本中有21個(gè)樣本是聚集在中央位置的，僅有緬甸陸龜?shù)?個(gè)樣本和蘇卡達(dá)陸龜?shù)?個(gè)樣本散在較遠(yuǎn)處，顯示了4種陸龜糞便樣本具有一定的共性。4種龜中豹龜和輻射陸龜樣本的聚集性較好，即個(gè)體間的差異較小。而蘇卡達(dá)陸龜和緬甸陸龜樣本聚集性明顯較前兩者差，蘇卡達(dá)陸龜尤其明顯。從圖形看，緬甸陸龜和豹龜，輻射陸龜和蘇卡達(dá)陸龜呈現(xiàn)了明顯的“重合”現(xiàn)象，尤其是緬甸陸龜和豹龜。

圖5 4種陸龜糞便微生物NMDS分析結(jié)果Fig.5 NMDS analysis of fecal flora of four tortoise species

LEfSe分析中，LDA閾值取3，結(jié)果顯示4種陸龜糞便樣本具有提供相互區(qū)分的標(biāo)志物種，它們是緬甸陸龜樣本中厚壁菌門中韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)、蘇卡達(dá)陸龜樣本中互養(yǎng)菌門中Synergistaceae菌科、輻射陸龜樣本中擬桿菌門的理研菌科(Rikenellaceae)和變形菌門的伯克氏菌目(Burkholderiales)，豹龜樣本中擬桿菌門的[Paraprevotellaceae]和S24_7菌科(圖6A)。

圖6 4種陸龜糞便微生物L(fēng)EfSe分析結(jié)果Fig.6 Results of fecal microbial LEfSe analysis of four tortoise species 注：節(jié)點(diǎn)大小表示該分類單元的平均相對(duì)豐度；空心節(jié)點(diǎn)代表組間差異不顯著的分類單元；不同顏色節(jié)點(diǎn)分別代表組間顯著差異的分類單元，且在對(duì)應(yīng)組樣本中豐度較高 Note：The node size indicates the average relative abundance of the taxonomic unit.Hollow nodes represent taxonomic units that do not differ significantly between groups.Different color nodes represent the classification units that are significantly different between groups and have higher abundance in the corresponding group samples，respectively

若將NMDS分析中兩兩相聚，即緬甸陸龜與豹龜和輻射陸龜與蘇卡達(dá)陸龜?shù)臉颖具M(jìn)行LEfSe分析，結(jié)果顯示：緬甸陸龜樣本標(biāo)志物種有3個(gè)菌門的4個(gè)屬，它們是放線菌門(Actinobacteria)中Paraeggerthella菌屬、互養(yǎng)菌門的vadinCA02菌屬和厚壁菌門中Sedimentibacter和Bulleidia菌屬。豹龜標(biāo)志物種有2個(gè)門中1科和1屬，它們是擬桿菌門的S24_7菌科和厚壁菌門中的芽孢桿菌屬(Bacillaceae_Bacillus)(圖6B)。蘇卡達(dá)陸龜和輻射陸龜間，蘇卡達(dá)陸龜標(biāo)志物種有3個(gè)門中的1個(gè)目3個(gè)科，它們是疣微菌門(Verrucomicrobia)中的RFP12菌科、擬桿菌門的p_2534_18B5菌科、變形菌門中的Campylobacterales菌目和Comamonadaceae菌科。輻射陸龜?shù)臉?biāo)志物種有4個(gè)門中的3個(gè)目、3個(gè)科以及9個(gè)屬，它們是OP11菌門的d153目；擬桿菌門的[Paraprevotellaceae]菌科、理研菌科、Paludibacter菌屬；變形菌門立克次氏體目(Rickettsiales)和Coxiellaceae科以及Heraspirillum、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、嗜膽菌屬(Bilophila) 3屬；厚壁菌門中的SHA_98目和八疊球菌屬、優(yōu)桿菌屬(Pseudoramibacter_Eubacterium)、Dorea、rc4_4、費(fèi)氏刺骨魚菌屬(Epulopiscium)5個(gè)屬(圖6C)。

2.3 功能預(yù)測(cè)分析

比對(duì)4種陸龜糞便微生物菌群的ASVs與KEGG數(shù)據(jù)庫核心生物代謝通路分析數(shù)據(jù)，注釋后得到KEGG代謝通路預(yù)測(cè)結(jié)果。所有樣品共涉及6類一級(jí)生物代謝通路和31個(gè)第二級(jí)代謝通路子功能。代謝通路中的二級(jí)代謝通路子功能菌群豐度值最為突出，豐度由高到低排序前4位依次為碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝以及萜類化合物和聚酮類化合物的代謝等。

4種陸龜糞便樣本的KEGG三級(jí)代謝通路中，緬甸陸龜與豹龜間有7個(gè)存在顯著性差異(表3)，蘇卡達(dá)陸龜與輻射陸龜之間有9個(gè)顯示存在著顯著性差異(表4)。另外，值得注意的是在4種陸龜樣本中均有一定菌群豐度的丁酸和丙酸代謝通路，在丁酸代謝通路中菌群豐度依次為蘇卡達(dá)陸龜(291.03)、輻射陸龜(284.75)、緬甸陸龜(276.03)、豹龜(257.68)，其中蘇卡達(dá)陸龜和豹龜間具顯著性差異(P=0.024)，緬甸陸龜和豹龜間具顯著性差異(P=0.042)。在丙酸代謝通路中菌群豐度依次為：蘇卡達(dá)陸龜(303.59)、緬甸陸龜(285.49)、豹龜(275.28)、輻射陸龜(262.92)，其中緬甸陸龜(P=0.032)和蘇卡達(dá)陸龜(P=0.019)分別與輻射陸龜存在組間差異性。提示了4種陸龜糞便菌群結(jié)構(gòu)與宿主代謝功能間存在共性，各自也有不同的特點(diǎn)，且菌群在為其宿主利用飼料及完成營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中起到非常重要的作用。

3 討論

3.1 爬行類腸道菌群的共性

腸道微生物在經(jīng)歷了與宿主長期的生存磨合和協(xié)同進(jìn)化后，在菌群結(jié)構(gòu)和功能上均表現(xiàn)出了輔助宿主適應(yīng)新環(huán)境的趨勢(shì)[7]。雖然有學(xué)者指出樣本取自腸道黏液和內(nèi)容物與樣本取自糞便的研究結(jié)果存在一定的差異，但更多的研究證實(shí)兩類不同取材方式獲得的樣本，其含有的菌群組成具有很大的相似性，即糞便樣本可以間接反映出腸道微生物菌群的特點(diǎn)[8]。通過對(duì)野生食魚蝮(Agkistrodonpiscivorus)腸道和泄殖腔[9]，野生虎斑頸槽蛇(Rhabdophistigrinus)腸道和泄殖腔[10]，人工養(yǎng)殖的滑鼠蛇、眼鏡蛇、王錦蛇、尖吻蝮、赤峰錦蛇(Elapheanomala)和棕黑錦蛇(E.schrenckii)糞便[3，11]等的研究發(fā)現(xiàn)蛇類腸道和糞便微生物菌門均以厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門作為優(yōu)勢(shì)菌群；對(duì)短吻鱷(Osteolaemustetraspis)胃腸道及糞便[12]和揚(yáng)子鱷(Alligatorsinensis)胃腸道及糞便[13]的研究指出2種鱷魚糞便微生物菌門均以變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門作為優(yōu)勢(shì)菌群；對(duì)淡水龜紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)和四眼斑水龜(Sacaliaquadriocellata)糞便[14]、綠海龜(Cheloniamydas)泄殖腔糞便[15]和佛州穴陸龜(Gopheruspolyphemus)糞便[5]的研究顯示龜類泄殖腔和糞便微生物菌門均以擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群。本研究中4種陸龜糞便微生物相對(duì)豐度前3的菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，與已報(bào)道的爬行動(dòng)物腸道和糞便微生物的優(yōu)勢(shì)菌門相似，顯示了爬行動(dòng)物胃腸道和糞便微生物菌群的共性。

3.2 食草動(dòng)物腸道菌群的共性

反芻動(dòng)物特化的瘤胃中生存著大量復(fù)雜的厭氧細(xì)菌等共生微生物菌群，當(dāng)食物進(jìn)入后就成了一個(gè)天然發(fā)酵場(chǎng)[16]，這些菌群可以將進(jìn)食的纖維素逐步分解，形成在腸道中較容易消化利用的較小分子團(tuán)。瘤胃菌群中門水平以厚壁菌門和擬桿菌門為主，2個(gè)菌群的比例一般為0.8～3.0[4，17-18]。反芻動(dòng)物主要依靠厚壁菌門成員利用碳水化合物，而擬桿菌門成員則是分解纖維素的主要菌群[19]，兩者比值(F/B)也在一定程度上代表宿主對(duì)能量的利用能力，即比值越高更易促進(jìn)宿主儲(chǔ)存能量，并且較高豐度的擬桿菌門更利于宿主分解植物多糖并從中獲能[4]。Yuan等[5]探究了后腸發(fā)酵的佛州穴陸龜糞便微生物菌群特征，結(jié)果表明此陸龜糞便中微生物菌群組成與多種后腸發(fā)酵哺乳動(dòng)物更為相似，推測(cè)可能基于飲食和消化形態(tài)(后腸發(fā)酵)的相似。本研究中的4種陸龜均屬于草食性后腸發(fā)酵動(dòng)物，樣本均顯示出厚壁菌門和擬桿菌門具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的相對(duì)豐度數(shù)值，并且4種陸龜?shù)腇/B比值(1.66～3.35)與反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)情況基本吻合，此結(jié)果提示了4種陸龜樣本菌群中在門水平上具有與其他草食性動(dòng)物相一致的特點(diǎn)。

反芻動(dòng)物瘤胃菌群在屬水平上，豐度占比較高的有普雷沃氏菌屬、琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、瘤胃球菌屬、糞球菌屬、梭菌屬和理研菌科等[4，17，20]。研究表明以上菌群是瘤胃中降解植物纖維素的主要微生物，可生產(chǎn)出大量的纖維素酶，有助于纖維素的轉(zhuǎn)化[21]。本研究中4種陸龜樣本中擬桿菌門的普雷沃氏菌屬，厚壁菌門的梭菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬的相對(duì)豐度有著明顯差別，但相對(duì)豐度均位列前10，提示了陸龜與反芻動(dòng)物之間均借助于相似的可分解纖維素的微生物，以達(dá)到利用植物性食物中含有的營養(yǎng)與能量。其中反芻動(dòng)物瘤胃中高豐度的琥珀酸菌屬等是爬行類后腸發(fā)酵動(dòng)物(草食性爬行動(dòng)物)所沒有發(fā)現(xiàn)的，陸龜和反芻動(dòng)物由于胃腸道的生理狀態(tài)不同，其糞便所含菌群也存在一定的區(qū)別，但體現(xiàn)了相似的食性與相似的菌群之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3.3 不同陸龜腸道菌群的特點(diǎn)

有學(xué)者認(rèn)為，個(gè)體遺傳特質(zhì)決定了其代謝特點(diǎn)，胃腸道生理狀態(tài)的差異勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致胃腸道微生物菌群的差異[22-23]。食物與其他因素相比，可以更直接地影響著胃腸道理化特征，因此在腸道菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡中起著決定性作用[24-25]。另有研究顯示，在饑餓或者改變食物后，腸道菌群可以在短時(shí)間內(nèi)(6 h～11 d)迅速重建新的動(dòng)態(tài)平衡[26-27]。趙佩華[28]分析來自5個(gè)大洲人群的糞便微生物，在uniFrac距離的箱線圖發(fā)現(xiàn)：腸道菌群成員組成在同一家庭中有血緣關(guān)系人之間的距離要小于沒有血緣關(guān)系(如父母)之間的距離，但腸道菌群的結(jié)構(gòu)卻沒有顯著差異。因?yàn)榧彝コ蓡T之間共享類似的生活方式、飲食習(xí)慣和生活環(huán)境，因此遺傳信息是唯一的差別。4種陸龜在救護(hù)中心相同環(huán)境下，投喂相同飼料的時(shí)間達(dá)半年以上，不同個(gè)體腸道微生物菌群已處于相對(duì)穩(wěn)定且相似的狀態(tài)(Alpha多樣性組間無顯著差異)。Beta多樣性反映組間微生物群落的差異，NMDS分析結(jié)果中顯示了“兩兩聚集”的現(xiàn)象，4種陸龜在門水平和屬水平上相對(duì)豐度排序中均有明顯的差異，LEfSe分析結(jié)果顯示4種陸龜都有各自的標(biāo)志菌，均提示4種陸龜存在著明顯的種間差異性，那么導(dǎo)致它們腸道菌群差異的根本因素在很大程度上取決于其自身的遺傳特質(zhì)，而詳細(xì)結(jié)論還有待于深入研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)較為特殊的菌屬，且相對(duì)豐度值不低，它們是氨基酸球菌屬和費(fèi)氏刺骨魚菌屬。氨基酸球菌屬是嚴(yán)格厭氧菌，有研究在人類糞便中檢測(cè)出此菌屬[29]，以氨基酸特別是谷氨酸作為其主要能源(http：//www.hopebiol.com/)；費(fèi)氏刺骨魚菌屬是1985年在棲息于紅海、澳大利亞等地淺水區(qū)刺尾魚腸道中被發(fā)現(xiàn)的一種長達(dá)0.7 mm的桿狀細(xì)菌[30]。這2個(gè)菌屬在已有的關(guān)于爬行動(dòng)物腸道微生物研究中并未見報(bào)道，它們出現(xiàn)在4種陸龜糞便樣本中的意義，有待深入研究。

4種陸龜均有很大一部分未知和未分類菌屬(超過60%)，其中蘇卡達(dá)陸龜相對(duì)豐度前50菌屬的相對(duì)豐度之和最低，Alpha多樣性顯示代表多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)在4種陸龜中最高，但代表物種豐富度、對(duì)稀有物種更敏感的ChaoⅠ指數(shù)最低，說明4種陸龜糞便微生物菌群還有很多的未知菌種，存在很大的探索空間。

致謝：感謝廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心徐錦興、毛學(xué)群、成鑒榮和梁穎琳在動(dòng)物飼養(yǎng)和取材中的幫助。