基于微衛(wèi)星標(biāo)記的南白犀親子鑒定

王予辰 陳 瑩 王 宇* 金 煜*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.云南石林龍暉野生動物科研中心有限公司，石林，652200)

奇蹄目(Perissodactyla)犀科(Rhinocerotidae)共4屬5種，即黑犀(Dicerosbicornis)、白犀(Ceratotheriumsimum)、印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rh.sondaicus)和蘇門答臘犀(Dicerorhinussumatrensis)，都處于瀕危狀態(tài)，被列入CITES附錄Ⅰ，僅南白犀(Ceratotheriumsimumsimum)被列入附錄Ⅱ。白犀歷史上在整個南部非洲草原均有分布[1]。20世紀(jì)初，南非白犀種群遭到殖民者的大量屠殺，僅有約100頭存活在南非東海岸的一小塊區(qū)域[2]，后雖從滅絕邊緣恢復(fù)，但一直受盜獵、棲息地破碎喪失和犀牛制品非法國際貿(mào)易等因素影響處于受危狀態(tài)。

犀牛生殖需經(jīng)歷4～6周的發(fā)情期、16個月的妊娠期和1～6個月的哺乳期，總周期1.5～2.0年，是陸生哺乳動物最長的生殖周期之一[3]。白犀野外繁殖率相對較低，主要受限于繁殖生物學(xué)的特性以及環(huán)境波動等；人工繁育生產(chǎn)率有所提高，借助觀察各種產(chǎn)前變化、血清孕酮含量、不同產(chǎn)程和胎兒情況等幫助診斷難產(chǎn)和圍產(chǎn)期并發(fā)癥，可以減少生產(chǎn)過程中的死亡率，提高種群的出生率[4-5]。

南非殖民時期的遭遇使南白犀的遺傳變異性比其他種的犀牛都要低[6]，由于缺乏分散的機(jī)會，小而孤立的種群在近親間繁殖的風(fēng)險特別大，需要對種群交配系統(tǒng)具有廣泛和持續(xù)的了解，以確定近親繁殖可能造成的風(fēng)險，因此詳細(xì)準(zhǔn)確的譜系記錄對于南白犀的種群發(fā)展至關(guān)重要。種群的遷移易位以及多雄交配使得真實父權(quán)難以通過觀察得到[7]，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定可以很好地解決這一問題，為種群的所有個體提供準(zhǔn)確的譜系信息，實行最佳的管理和保護(hù)。

本研究以110頭人工半散放南白犀為研究對象，篩選出13個多態(tài)性好且可靠性高的微衛(wèi)星位點，利用相關(guān)軟件計算其遺傳多樣性和累積排除概率，分析這些位點用于南白犀親子鑒定的可行性，給出位點聯(lián)合使用方案。選用4組雙親本已知三聯(lián)體組合對研究結(jié)果進(jìn)行驗證，在此基礎(chǔ)上，對2只父系不清幼體的生物學(xué)父親進(jìn)行了確認(rèn)，以期確定選用的微衛(wèi)星位點組合在實際應(yīng)用中的有效性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

群體為人工半散放非洲南白犀，共110頭，樣本為靜脈血，于2020年12月23日在石林龍暉野生動物科研中心采集。

1.2 基因組DNA提取及檢測

用Axygen公司Blood Genomic DNA Miniprep Kit 250-prep試劑盒提取血液樣本基因組DNA，利用德國Implen NanoPhotometer-N50超微量分光光度計檢測DNA濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

查閱文獻(xiàn)獲得26對犀牛的微衛(wèi)星引物[8-12]；依據(jù)NCBI所載非洲南白犀全基因組序列，使用SSRHunter查找微衛(wèi)星重復(fù)序列，自行設(shè)計30對引物(BX1～BX30)。全部引物由北京擎科生物科技有限公司合成，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴(kuò)增出產(chǎn)物。擴(kuò)增體系(總體積20.0 μL)：10.0 μLTaqMaster Mix酶，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4 引物的熒光標(biāo)記和毛細(xì)管分型

在引物5′端用FAM熒光基團(tuán)修飾(北京擎科生物科技有限公司)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，運用GeneMapper 4.0軟件，以LIZ-500為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，進(jìn)行基因分型，獲得相應(yīng)位點的長度多態(tài)信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理及微衛(wèi)星位點組合篩選

使用POPGENE軟件計算各位點的等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量，并對各位點進(jìn)行MicroChecker檢驗和哈溫平衡(Hardy-Weinberg)檢測。利用Cervus 3.0軟件計算每個位點在2個親本基因型未知、1個親本基因型已知和2個親本基因型已知情況下的非父排除概率及累積非父排除概率，確定最適用于南白犀親子鑒定的微衛(wèi)星位點組合方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性及MicroChecker檢驗

56對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，有32對引物擴(kuò)增出目的條帶(表1)。通過毛細(xì)管電泳檢測后發(fā)現(xiàn)DB5、DB14、DB23、DB30、IR22、SR74、BX10、BX21和BX23位點的等位基因數(shù)只有1個，余下的23個位點經(jīng)過MicroChecker檢驗后發(fā)現(xiàn)有10個位點存在無效等位基因和等位基因缺失的情況，故實際僅有13個位點可用于后續(xù)的親子關(guān)系分配(表2)。

續(xù)表1

表2 MicroChecker篩選的可用于南白犀親子關(guān)系分配的位點

供試群體共檢測出37個等位基因，其中BX1的等位基因數(shù)目最多，為5個，DB1、AY138545、BX2、BX26和BX29等位基因數(shù)目最少，均為2個。各位點在群體中的觀察雜合度(Ho)為0.036～1.000，平均值為0.511；期望雜合度(He)為0.053～0.759，平均值為0.482。根據(jù)Botstein等[13]的PIC分類標(biāo)準(zhǔn)，共檢測到4個高度多態(tài)位點(PIC>0.500)，6個中度多態(tài)位點(0.250

表3 南白犀13個微衛(wèi)星位點多態(tài)性

2.2 非父排除概率和累積非父排除概率

2.2.1 非父排除概率

13個位點的非父排除概率計算結(jié)果：PE-1P值為0.001～0.351，PE-2P值為0.026～0.530，PE-PP值為0.050～0.712。BX1位點的多態(tài)信息含量最高，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最高；BX29位點多態(tài)信息含量最低，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最低，即PE-1P、PE-2P、PE-PP值隨PIC的降低而降低(表4)。

表4 南白犀13個位點的平均排除概率

2.2.2 累積非父排除率

將13個位點根據(jù)多態(tài)信息含量(PIC)由高到低排列，將其作為位點組合的依據(jù)，依次計算位點數(shù)目從1增加到13時的聯(lián)合排除概率。結(jié)果顯示：隨著聯(lián)用位點數(shù)的增加，聯(lián)合排除概率隨之增高；三聯(lián)體親子鑒定中，微衛(wèi)星位點數(shù)達(dá)到13時，聯(lián)合排除概率CPE-PP的值超過99%(表4)。

2.3 種群實測與效果評價

根據(jù)表4可知在CPE-PP的情況下，采用的13個微衛(wèi)星位點的累積非父排除率可達(dá)到99%以上，利用這些位點對4組共12頭具有譜系記錄的南白犀進(jìn)行親子鑒定分析，包括子代4頭、母本4頭和父本4頭，計算每個子代父親的LOD值來驗證所選取的微衛(wèi)星位點組合的準(zhǔn)確性。

在2個親本基因型已知的情況下，計算4個父本的LOD值，F(xiàn)-01、F-02和F-04的LOD值均達(dá)到95%的嚴(yán)格置信度(表5)。Cervus分配的最似父本與譜系記錄一致，所選用的13個微衛(wèi)星位點組合適于在2個親本基因型已知的情況下確定親生父本。

表5 南白犀13個微衛(wèi)星位點組合的LOD值

表6 南白犀親子鑒定結(jié)果

在只有母本基因型清楚的情況下，利用該微衛(wèi)星位點組合對2個父本不清的子代進(jìn)行親子鑒定，C-01的3個候選父親中，F(xiàn)-04和F-06存在的錯配位點過多，未計算出LOD值；F-05的LOD值達(dá)到95%的嚴(yán)格置信度，鑒定為C-01的親生父親。C-02的2個候選父親中，F(xiàn)-07也因錯配位點過多未計算出LOD值，親生父親經(jīng)鑒定為F-03。

3 討論

3.1 分型的可靠性

現(xiàn)有的關(guān)于犀牛的微衛(wèi)星標(biāo)記大部分都是二堿基重復(fù)序列，在DNA復(fù)制過程中極容易出現(xiàn)引物或模板滑脫，滑動鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯配，形成影子帶。在毛細(xì)管分型圖譜中，影子帶通常比等位基因少一個或多一個重復(fù)單元，形成的影子峰緊挨著主峰，特別是對雜合子個體而言極易造成分型錯誤。為了減少按DNA分子質(zhì)量測定值計算等位基因DNA片段長短所產(chǎn)生的誤差[14]，選用四堿基重復(fù)序列可得到更準(zhǔn)確的基因分型結(jié)果。通過NCBI查找南白犀的全基因組序列，設(shè)計了多對四堿基微衛(wèi)星引物，結(jié)果顯示影子帶出現(xiàn)頻率極低，便于判讀基因分型結(jié)果。

采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析親子關(guān)系時，無效等位基因的存在會直接影響親本分析結(jié)果，Dakin等[15]研究發(fā)現(xiàn)多個位點存在無效等位基因，且頻率較高時，會造成親本分析結(jié)果的混亂和錯誤，故本研究所有位點利用MicroChecker剔除存在無效等位基因的位點，保證后續(xù)分析結(jié)果的可靠性。

3.2 位點的多態(tài)信息含量

每個位點的等位基因數(shù)量不僅是衡量遺傳變異的指標(biāo)，也是實現(xiàn)高親本分配率的重要因素，DB52和DB1位點是專門為黑犀設(shè)計的，本研究中檢測出的等位基因數(shù)量同Brown等[9]的研究相比數(shù)量較少，與Nielsen等[8]的相同，因此在跨物種研究中使用這2個位點時無法提供相同水平的多態(tài)信息含量。AY138541、AY138542、AY138544和AY138545位點是專門為南白犀設(shè)計的，但由于群體不同，導(dǎo)致等位基因數(shù)量同F(xiàn)lorescu等[16]的相比較少，因此專門新設(shè)計了7個微衛(wèi)星位點，可提供較多的等位基因數(shù)量和多態(tài)信息含量。

根據(jù)本研究確定的遺傳參數(shù)，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性水平并不像歷史瓶頸所預(yù)期的那樣低，本研究中描述群體雜合度的參數(shù)平均值，如Ho、He比其他南白犀基因研究中發(fā)現(xiàn)的參數(shù)平均值略高。微衛(wèi)星標(biāo)記在其他南白犀研究中估計的平均Ho為0.435～0.478[6，17-19]，而本研究的平均Ho為0.511，這可能是由于混合先前分離的小種群產(chǎn)生的效應(yīng)，如在納米比亞的一個南白犀種群中，F(xiàn)0和F1動物的雜合度高于F2，因為F0是從不同地方遷移的[6]。

進(jìn)行親子鑒定時，應(yīng)選用符合Hardy-Weinberg平衡的微衛(wèi)星位點，但是只有當(dāng)一個大的孟德爾群體內(nèi)的個體間進(jìn)行隨機(jī)交配，不存在選擇、突變和遷移等情況時[20]，該群體的微衛(wèi)星位點才處于平衡?，F(xiàn)有南白犀的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)目有限，且選用的試驗群體為半散放人工養(yǎng)殖群體，群體內(nèi)奠基者效益較嚴(yán)重，為了充分利用遺傳信息，故將偏離Hardy-Weinberg平衡的位點也全部應(yīng)用進(jìn)來。

3.3 親子鑒定的有效性和可靠性

由于白犀的遺傳多樣性較低，對于南白犀的父權(quán)認(rèn)定大都采用三聯(lián)體，但是有些在親子分配方面并不能達(dá)到100%嚴(yán)格置信。Coutts[17]試圖在2個南白犀種群中確定父權(quán)，2個種群都有10頭小牛和12個候選父親，分析表明，每個種群僅有1頭小牛能達(dá)到95%嚴(yán)格置信；Kim[21]也利用微衛(wèi)星標(biāo)記對黑犀種群進(jìn)行親子關(guān)系研究，6頭小牛有2只達(dá)到了95%的嚴(yán)格置信，與Coutts[17]相比其候選父親數(shù)量很少，為2～5個。Garnier等[22]能夠明確地為一個小野生黑犀種群(n=33)的19個后代指定親緣關(guān)系，選用的10個微衛(wèi)星位點排除概率為0.593～0.999，雙親基因型已知時的聯(lián)合排除概率達(dá)到了0.999。本研究選用的13個微衛(wèi)星位點排除概率在0.050～0.712，雙親基因型已知時的聯(lián)合排除概率達(dá)到了0.998，選用的4頭小牛最似父親分配均達(dá)到嚴(yán)格置信，位點排除概率相對較低的主要原因可能是黑犀種群的遺傳多樣性比白犀種群高[1]，故選用排除率高的位點組合進(jìn)行親子關(guān)系分析時可靠性會顯著提高。

復(fù)合擴(kuò)增雖然可以有效提高等位基因分型效率，尤其是從毛發(fā)等非損傷性材料中提取DNA用于試驗，但是本研究選用的13個微衛(wèi)星位點等位基因長度相似，這導(dǎo)致在同一個體系中無法使用一種熒光基團(tuán)擴(kuò)增多個位點，在同一體系中熒光基團(tuán)數(shù)量過多可能出現(xiàn)相互抑制的情況，故均采用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾。犀牛人工繁育和野外最易獲得的是糞便，因此本方法適用性仍然比較廣泛，只是分析成本相對較高。