百蕊草有效成分提取工藝優(yōu)化及生物活性檢測

張 湄，張麗杰，譚維群，彭 嵐，王 穎

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院, 重慶 400054)

0 引言

百蕊草屬檀香科植物，為半寄生多年生植物[1]，研究發(fā)現(xiàn)百蕊草中主要包含黃酮類、有機酸、生物堿、鞣質、酚類、多糖、甾醇、揮發(fā)油、礦物質、甘露醇等多種生物活性成分[2-4]，具有抑菌、抗氧化、消炎、抗病毒、增強免疫力等生物活性[5-9]，而其中具備藥理作用的主要成分為黃酮類化合物[10]，使百蕊草具有“調氣”、“清熱解毒”、“抗菌消炎”、“通順氣脈”的藥理作用[11]，具有植物抗生素的美稱。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料

百蕊草干全草，購于安康四季保健養(yǎng)生堂。

1.1.2試劑

蘆丁對照品、D101大孔吸附樹脂(北京索來寶科技有限公司)、LPS、亞硝酸鈉、硝酸鋁、DPPH(上海麥克林生化科技有限公司)、氫氧化鈉(重慶川東化工有限公司)、胰蛋白酶、雙抗、DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技股份有限公司)、胎牛血清(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)、MTT(北京酷來搏科技有限公司)、ABTS(生工生物工程股份有限公司)、氯仿、NaCl(成都市科隆化學品有限公司)、蛋白胨、酵母粉(北京奧博星生物技術有限公司)、瓊脂(重慶市北碚化學試劑廠)。

1.1.3儀器與設備

超聲波清洗機(SB-5200 DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司)、紫外可見分光光度計(752N，上海儀電分析儀器有限公司)、酶標儀(Multiskan GO，美國Thermo Scientific公司)、恒溫搖床(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)、生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1百蕊草提取物的制備

取1 g百蕊草全草，加入70%乙醇溶液，超聲提取，收集上清液為百蕊草提取物。

1.2.2標準曲線的繪制

1) 標準溶液的配置

用70%乙醇溶液將5 mg蘆丁對照品超聲溶解定容至25 mL。

2) 最大吸收波長的測定

參照文獻[24]的方法并加以修正，取1 mL蘆丁標液于比色管中，依次加入0.3 mL 5% NaNO2，靜置反應6 min，0.3 mL 10% Al(NO)3溶液，靜置反應6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，用70%乙醇定容至10 mL，靜置反應15 min，全波長掃描，得到其最大吸收波長為507 nm。

3) 標準曲線的制作

標準曲線的制作參照文獻[25]，參照上述方法，在507 nm下檢測溶液吸光度，以蘆丁濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。提取液中黃酮含量α(mg/g)參照下式計算：

式中：C為濃度；N為稀釋倍數(shù)；V為體積。

1.2.3提取工藝優(yōu)化

1) 乙醇濃度對提取當量的影響

設定乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比為1∶10 g/mL、溫度為50 ℃的條件下超聲30 min，測定百蕊草提取液中的黃酮含量。

2) 超聲時間對提取當量的影響

在乙醇濃度為60%、溫度為50 ℃、料液比為1∶10 g/mL條件下，設定超聲時間分別為20、30、40、50、60 min，測定百蕊草提取液中的黃酮含量。

3) 料液比對提取當量的影響

設定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL，乙醇濃度為60%、溫度為50 ℃條件下超聲40 min，測定百蕊草提取液中的黃酮含量。

4) 溫度對提取當量的影響

設定溫度為40、50、60、70、80 ℃，乙醇濃度為60%、料液比為1∶30 g/mL條件下超聲40 min，測定百蕊草提取液中的黃酮含量。

1.2.4響應面優(yōu)化提取工藝

由于單因素實驗中存在條件之間的交互影響，不能通過單因素優(yōu)化實驗確定最佳提取條件，利用Box-Behnken進行實驗，以料液比、溫度、提取時間、乙醇濃度為自變量，黃酮含量為響應值進行實驗設計，采用Design-Expert 12進行響應面分析，建立回歸方程，確定百蕊草黃酮的最佳提取工藝，實驗因素與水平如表1所示。

表1 實驗因素與水平

1.2.5實驗驗證

按照預測模型中的最佳提取條件重復實驗，計算黃酮的提取含量。

1.2.6萃取

將提取液合并后減壓濃縮，轉移至分液漏斗，按同等比例加入氯仿，靜置分層，取水相上柱純化富集。

1.2.7層析純化

1) 樹脂預處理

將D101大孔吸附樹脂在95%乙醇中浸泡24 h，使樹脂充分溶脹，以除去樹脂內部殘留的二乙烯苯、甲苯等未完全反應的引發(fā)劑和填加劑，用蒸餾水沖洗，除去懸浮顆粒和絮狀物，抽濾清洗至無醇味且上清澄清，浸泡在蒸餾水中備用[26]。

2) 純化富集

濕法上柱，將提取物以1.5 BV/h流速進行上樣，蒸餾水洗滌，收集70%乙醇洗脫部位。

1.2.8體外抗氧化活性測定

配置400 μg/mL的提取液母液，自由基清除活性檢測參照文獻并稍作調整[27]。

1) DPPH自由基清除活性

將50 μL 0.2 mmol/L DPPH與50 μL不同濃度的提取液混合，避光靜置30 min，測得ODi，以等體積50 μL乙醇代替DPPH溶液，測得ODj；以等體積乙醇代替提取液，測得OD0，VC和蘆丁作為陽性對照。避光靜置30 min后在517 nm處測吸光度。清除率ε(%)計算公式如下：

式中：ODi為樣品組；ODj為空白對照組；OD0為模型對照組。

2) ABTS自由基清除活性

將7 mmol/L ABTS和2.5 mmol/L K2S2O8等體積混合避光靜置12 h后得到ABTS儲備液，稀釋調整其吸光度OD734 nm為0.7±0.02，將100 μL ABTS儲備液與50 μL提取液混合，測得ODi，以等體積100 μL無水乙醇代替ABTS溶液，測得ODj；以與樣品等體積50 μL乙醇代替提取液，測得OD0；VC、蘆丁代替提取液作為陽性對照組。避光靜置8 min，在734 nm下測吸光度。清除率ε計算公式如下：

式中：ODi為樣品組；ODj為空白對照組；OD0為模型對照組。

1.2.9細胞毒性檢測

將L929小鼠成纖維細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后接種于96孔板，設置空白組、陰性對照組、實驗組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，加入20 μL MTT溶液，避光孵育4 h后加入150 μL DMSO，避光震蕩，490 nm波長下檢測吸光度，根據(jù)下式計算細胞增殖率：

1.2.10藥敏實驗

1) 抑菌圈

在固體培養(yǎng)基上涂布100 μL稀釋后的菌懸液，放置牛津杯(直徑6 mm)，加入100 μL藥液37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈的直徑。

2) MIC及抑制率

配制質量濃度為50 mg/mL百蕊草提取物作為母液，梯度稀釋得到不同濃度的藥液，第一孔僅加入200 μL液體培養(yǎng)基，第二孔加入100 μL培養(yǎng)基和100 μL菌液作為陰性對照，第3～10孔中分別加入終濃度為25、20、15、12.5、10、6.125、3.06、1.03 mg/mL的藥液，加入100 μL 1×105CFU/mL的菌液作為實驗組，以LB培養(yǎng)基和不同濃度的提取液混合液作為空白對照，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，孔中的溶液透明澄清所對應的藥液濃度即為MIC，并在600 nm下檢測吸光度，根據(jù)下式計算細菌抑制率δ(%)：

1.2.11抗炎性

1) 提取液對RAW264.7生長的影響

將RAW264.7細胞培養(yǎng)至密度為瓶底80%后，調整細胞密度為2×106個/mL，細胞貼壁后換入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，24 h后加入20 μL MTT，孵育4 h后，棄去MTT，加入150 μL DMSO，避光震蕩，在490 nm波長下檢測吸光度。

2) 提取液對LPS誘導RAW264.7分泌NO的影響

將RAW264.7以2×106個/mL的細胞密度加入96孔板，4 h后分組處理，以終濃度為1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基作為陽性對照，不同濃度的含藥培養(yǎng)基及LPS為實驗組，24 h后，細胞上清液中的NO通過Griess法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 12進行響應面分析，SPSS 26進行顯著性分析，Origin 2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示，進行線性回歸得到回歸方程：y=12.531 06x+0.000 6，R2=0.998。結果表明，標準液在0.01～0.1 mg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1乙醇濃度對提取當量的影響

圖2 乙醇濃度對黃酮提取當量的影響曲線

2.2.2超聲時間對提取當量的影響

由圖3可知，提取當量會隨著超聲時間的延長逐漸增大，提取當量在超聲40 min時達到最大，40 min后，可能由于長時間的超聲，百蕊草中的有效成分在空化作用下分解[29]，提取當量隨之下降。

圖3 超聲時間對黃酮提取當量的影響曲線

2.2.3料液比對提取當量的影響

由圖4可知，隨著溶劑的增多，增加互溶機會，提取當量逐漸增大，有利于有效成分的溶出[30]，當料液比為1∶30 g/mL時，提取當量達到最大，隨著料液比的增大，對提取當量的影響不大，且為了節(jié)省溶劑，節(jié)約提取成本，選擇提取料液比為1∶30 g/mL。

圖4 料液比對黃酮提取當量的影響曲線

2.2.4提取溫度對提取當量的影響

由圖5可知，提取當量會隨著溫度的上升而逐漸增大，當溫度為70 ℃時，提取當量達到最大，超過一定的溫度，破壞黃酮的結構，致其分解[31]，從而導致提取當量下降，因此選擇提取溫度為70 ℃。

圖5 溫度對黃酮提取當量的影響曲線

2.3 響應面優(yōu)化提取工藝

2.3.1響應面實驗設計

采用Box-Behnken中心組合進行四因素三水平實驗，條件及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken 實驗數(shù)據(jù)

續(xù)表(表2)

2.3.2回歸方程擬合及方差分析

回歸方程擬合及方差分析結果如表3所示。

表3 回歸方程擬合及方差分析結果

方差分析中可以看出乙醇濃度C、料液比D對黃酮提取量的影響顯著(P<0.01)，溫度A的P值小于0.05，影響順序從大到小依次為：D>C>A。二次項A2、C2、D2對百蕊草黃酮的提取具有極顯著性影響。

2.3.3響應面分析

采用 BOX-Behnken設計實驗，進行四因素三水平的響應面分析實驗。數(shù)據(jù)采用Design Expert 12軟件進行多元回歸擬合分析，得到以百蕊草黃酮提取當量Y為目標函數(shù)的多元二次回歸方程：

Y=26.76-0.606 2A+0.133 3B+

0.723 2C+2.04D-0.179 6AB-

0.284 3AC-0.349 1AD+0.169 6BC+

0.529 7BD+0.337 2CD-1.45A2-

0.458 0B2-1.14C2-1.31D2

圖6—11所示為因素交互作用對百蕊草總黃酮提取當量的影響，3D響應面和等高圖可以直觀反映出因素的交互作用對響應值的影響程度。從圖10中可以得出時間和料液比的交互作用對黃酮提取量的影響顯著，且料液比對響應值的影響大于提取時間。由圖7、8、11分析可知，該圖響應面坡度稍陡，可以得出溫度和乙醇濃度、溫度和料液比、料液比和乙醇濃度的交互影響對黃酮提取量的影響稍顯著。通過等高線的疏密可以從圖7中判斷在交互影響中乙醇濃度對響應值的影響大于溫度；從圖8、11中判斷出料液的影響大于溫度和乙醇濃度； 由圖6、9分析可知，溫度和時間以及時間和乙醇濃度的交互作用對黃酮提取量的影響不顯著，且溫度、乙醇濃度對響應值的影響大于時間。

圖6 Y=F(A,B)響應面和等高圖

圖7 Y=F(A,C)響應面和等高圖

圖8 Y=F(A,D)響應面和等高圖

圖9 Y=F(B,C)響應面和等高圖

圖10 Y=F(B,D)響應面和等高圖

圖11 Y=F(C,D)響應面和等高圖

2.3.4回歸模型驗證

經(jīng)軟件進行分析得到預測最優(yōu)提取條件,如表4所示。

表4 預測最優(yōu)提取條件

后續(xù)對此條件進行驗證，將提取條件修改為：溫度A為65 ℃，提取時間為50 min，乙醇濃度為65%，料液比為1∶40 g/mL，得到百蕊草的總黃酮提取當量為28.227±0.52 mg/g，結果與模型預測的黃酮提取當量為28.317 mg/g相近，驗證了理論模型的適用性和可靠性，能為百蕊草總黃酮的提取開發(fā)提供指導。

2.4 抗氧化性檢測

2.4.1清除DPPH自由基活性測定

DPPH是一種較為穩(wěn)定的自由基，常以自由基形態(tài)和含N=N+正離子態(tài)存在，在517 nm波長下有最大紫外吸收，應用于評價化合物對自由基的清除能力[32]。百蕊草粗提取液、純化后的提取物、蘆丁和抗壞血酸對DPPH自由基的清除活性如圖12所示，可以看出，VC溶液的DPPH自由基清除能力高于蘆丁標準液和提取液，在50～400 μg/mL的濃度范圍內，VC的清除能力一直處于較高水平，清除率能達到97.6±0.17%，蘆丁在50～200 μg/mL范圍內，DPPH自由基清除能力逐漸增大，在200～400 μg/mL濃度范圍內，清除能力逐漸趨于平緩，400 μg/mL時清除率達到93±0.24%，而提取液對DPPH自由基清除能力呈濃度依賴性，且純化后的清除力有所提高，當濃度為400 μg/mL時，粗提取液的清除率達到76±1.69%，純化后的提取物的清除率達到93.5±0.31%，說明提取物經(jīng)萃取、富集純化后黃酮類化合物的含量增多，黃酮類化合物結構上的酚羥基和羧羥基上的H+能將DPPH上的孤電子結合，抗壞血酸通過遞電子、遞質子使其生成DPPH2和還原N=N+使其還原成為三硝基苯胺[33]，使得DPPH溶液褪色，褪色程度說明抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力，以此來評判化合物的抗氧化能力。

圖12 DPPH自由基清除活性曲線

2.4.2清除ABTS自由基活性測定

ABTS是以氮原子為中心的自由基[34]，ABTS被K2S2O8氧化后生成綠色的陽離子ABTS溶液，在734 nm波長下有最大紫外吸收，與黃酮類化合物結構上酚羥基提供的孤對電子或氫原子配對后，自由基減少，導致溶液褪色[35]。百蕊草粗提取液、純化后的提取物、蘆丁和VC對ABTS自由基的清除作用如圖13所示，從圖中可以看出，VC和蘆丁標準液在50～100 μg/mL濃度范圍內對ABTS的清除活性為較高水平，而提取物對ABTS自由基清除能力呈濃度依賴性，當濃度為400 μg/mL時，提取液的清除率達到最大(98.3±0.34%)，純化后的提取物對ABTS自由基清除率相較于達到最大(98.95±0.33%)，在低濃度時的抗氧化能力比粗提物強，蘆丁和提取物均屬于黃酮類化合物，產(chǎn)生的自由基會與化合物上的質子結合，組合成穩(wěn)定的結構阻斷氧化過程，VC可通過與氧的相互作用消耗封閉系統(tǒng)中的氧[36]，在低濃度的情況下也具有極強的抗氧化能力。

圖13 ABTS自由基清除率曲線

2.5 細胞毒性

在組織修復中，成纖維細胞起著重要的作用，采用L929細胞評估百蕊草提取物對細胞增殖的影響，以期評估百蕊草提取物的安全性[37]。如圖14(a)所示，在0.1～1 mg/mL濃度范圍內，百蕊草提取物沒有細胞毒性；圖14(b)中細胞與含純化后的提取物共培養(yǎng)3天后增殖率有所下降，說明提取物經(jīng)過萃取純化后，黃酮含量增多，增殖率均大于50%，總體沒有細胞毒性。

圖14 百蕊草粗提物及純化后的提取物對L929細胞增殖活性的影響

2.6 抑菌性檢測

提取物對2種細菌的抑制情況如表5所示，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在10 mg/mL濃度下渾濁現(xiàn)象不明顯，12.5 mg/mL濃度及以上未出現(xiàn)渾濁，因此最低抑菌濃度為10～12.5 mg/mL；提取物對金黃色葡萄球菌的抑制率低于大腸桿菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在提取液的作用下出現(xiàn)的抑菌圈分別為12 mm、10 mm；天然黃酮能通過影響細菌能量代謝、干擾細菌細胞壁中肽聚糖的合成、破壞細胞膜的完整性、改變細胞膜的通透性、抑制細菌菌體的核酸代謝等方式影響細菌的能量、代謝過程，從而起到抑制細菌生長作用[38]，綜上所述，說明大腸桿菌對百蕊草提取物的敏感度大于金黃色葡萄球菌，這與抑菌圈結果測定相符。

表5 百蕊草提取物對2種常見病原菌的抑制情況

2.7 抗炎性

RAW264.7經(jīng)LPS刺激后會分泌大量炎癥因子，NO是其中的一種，但是NO極其不穩(wěn)定，易被氧化成亞硝酸鹽，通過Griess法，在酸性環(huán)境中檢測亞硝酸鹽的濃度，從而檢測出NO的分泌量[39]。從圖15(a)中可以看出，將巨噬細胞與1、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL提取液共培養(yǎng)24 h后，提取物對RAW264.7細胞的生長無明顯抑制作用，表現(xiàn)出一定的促增殖活性。從圖15(b)中可以看出，RAW264.7經(jīng)過LPS刺激后，NO的分泌量與陰性對照具有顯著性差異，說明LPS誘導成功，在0～1 mg/mL濃度范圍內能夠明顯抑制LPS刺激巨噬細胞分泌NO，降低炎癥反應，抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，表明百蕊草提取物具有良好的抗炎性。

圖15 提取物對RAW264.7生長及NO分泌量的影響

3 討論

提取物中包含多種植物代謝產(chǎn)物，而百蕊草中含有的黃酮、多糖、生物堿、有機酸、甾醇等多種具有生物活性的化學成分為百蕊草的次生代謝產(chǎn)物。從百蕊草中分離鑒定出的木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚、紫云英苷、蕓香苷、蒙花苷、大薊苷、高車前苷、芹菜素-5-O-葡萄糖-鼠李糖苷等化合物是以山奈酚為母核衍生的黃酮及其與糖類結合形成的黃酮苷類化合物，也是使百蕊草具有抗炎、抗氧化、抑菌等藥理活性的主要活性物質[3,23]。實驗結果表明，提取物經(jīng)過氯仿萃取、樹脂純化后，有效成分得到了富集，生物活性也有所增強?？寡趸钚耘c黃酮類化合物母核上的酚羥基數(shù)目、多糖結構中的半縮醛羥基提供的氫原子及新生成自由基的穩(wěn)定性相關，不同種類的化合物結構上的羥基位置不同，其活潑程度不同，所以抗氧化性能不同[40]，多種化合物的共同作用，能夠顯著提高提取物的抗氧化活性。

目前針對抗生素產(chǎn)生的耐藥性已經(jīng)成為在抗感染領域中函待解決的問題，從天然植物中開發(fā)利用具有抑菌性的天然活性物質成為解決這個問題的另一種渠道，百蕊草中的黃酮及生物堿能夠破壞細胞膜的完整性，改變細胞膜的結構和通透性，通過抑制DNA旋轉酶的合成影響核酸復制、降低產(chǎn)生毒力因子的能力、阻礙細菌對蛋白質和糖分等營養(yǎng)物質的利用，影響正常代謝，從而抑制細菌的生長[41]，因此提取物對臨床常見的2種致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長體現(xiàn)出不同程度的抑制作用，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌在提取物濃度為50 mg/mL時產(chǎn)生的抑菌圈分別為12 mm和10 mm，這說明不同菌種對藥液的敏感性不同，對革蘭氏陰性細菌的抑制作用比革蘭氏陽性細菌更強[42]，提取物通過多種機制發(fā)揮抑菌作用，能夠避免因抗生素細菌產(chǎn)生耐藥性，且天然化合物與抗生素表現(xiàn)出一定的抑菌協(xié)同作用，降低MIC值，產(chǎn)生更好的療效。

通過實驗發(fā)現(xiàn)百蕊草提取物對巨噬細胞具有促增殖作用，能夠抑制脂多糖誘導RAW264.7分泌NO，提取物濃度越高，NO分泌量越低，呈劑量依賴性。姜明言等[43]和Li等[44]發(fā)現(xiàn)黃酮類物質具有抗炎性，其機理為細胞外配體LPS通過刺激巨噬細胞表面的受體TLR4，激活巨噬細胞中NF-κB、MAPK和AP-1等調控炎癥的信號通路，進一步激活下游激酶，促進iNOS、COX-2及NO等炎癥因子的分泌和表達。百蕊草提取物中的山奈酚及其衍生物可以作為一種細胞因子調節(jié)劑[45]，能夠抑制LPS誘導RAW264.7細胞內NF-κB、MAPK信號通路的激活，對iNOS、COX-2蛋白的表達表現(xiàn)出極大的抑制作用，從而減少NO等炎癥因子的表達，且隨著提取物濃度的增大，對炎癥活性的抑制作用也有所增強。通過細胞安全性實驗發(fā)現(xiàn)1 mg/mL濃度范圍內的提取物對L929細胞無明顯細胞毒性，在安全范圍內。全面探究了百蕊草提取物的生物活性，具有良好具有抑菌性、抗炎性和抗氧化性，細胞毒性評價有利于更好地控制用藥劑量和進行藥效評估，確保藥物外用的安全性，為把百蕊草應用范圍擴大到外科傷口中進行了重要摸索。