犬瘟熱病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

冉 皚，凌洪權(quán)，曾 政,駱 璐,吳勝昔，董春霞，李 云，陳 婭

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

0 引言

犬瘟熱(canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一種致命的、高度傳染性的多種動(dòng)物共患性疾病[1]。病毒通過氣溶膠或直接接觸受感染動(dòng)物分泌物進(jìn)行傳播。近些年來CDV宿主范圍的種類正在不斷擴(kuò)大，如犬科、原甲科、鳶尾科、熊科、鼬科、貓科、鬣狗科和鳳科等[2-3]。研究表明，幾乎所有的食肉目動(dòng)物對CDV易感。CDV大流行目前在家養(yǎng)的狐貍和水貂中都很普遍，給狐貍和水貂產(chǎn)業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。CDV的高致死率對大熊貓種群的安全也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。如能及早發(fā)現(xiàn)并防治,無疑會(huì)最大限度地減少犬瘟熱帶來的損失。

CDV是一種包膜負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科麻疹病毒屬。共編碼8個(gè)蛋白：核衣殼蛋白(N)、血凝素(H)、基質(zhì)膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、病毒聚合酶(L)、融合蛋白(F)以及2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白C和V[6]。CDV NP有很高的保守性，在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起主要作用，具有較強(qiáng)的免疫原性和中和病毒的能力[7-8]。目前現(xiàn)有的犬瘟熱的檢測方法有病毒分離、PCR技術(shù)、血清學(xué)診斷技術(shù)等[9]。其中血清學(xué)技術(shù)應(yīng)用更廣泛，血清學(xué)技術(shù)主要依賴于抗原、抗體的特異性反應(yīng)。單克隆抗體具有靈敏高、特異性強(qiáng)和制備方便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷與治療[10]。國內(nèi)檢測CDV的抗體產(chǎn)品質(zhì)量不一，雖然國外有比較成熟化的抗體產(chǎn)品，但其價(jià)格高昂。前期研究已制備了高純度、特異性強(qiáng)的CDV NP。本研究以CDV NP為抗原免疫BALB/c小鼠，采用PEG1500為化學(xué)誘導(dǎo)劑，進(jìn)行細(xì)胞融合，間接ELISA法篩選單克隆雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行腹水誘生，并對制備的抗體進(jìn)行生物特性鑒定。本研究制備的CDV NP單抗對犬瘟熱的診斷及防控具有重要應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 抗CDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.2.1動(dòng)物免疫

第1次免疫取0.1 mL純化的重組蛋白CDV NP抗原(1 mg/mL)與等體積弗氏完全佐劑，采用注射器雙推法進(jìn)行乳化，乳化完全后腹腔皮下多點(diǎn)免疫6周齡的BALB/c小鼠。在第1次免疫后3周、5周、7周，取等量弗氏不完全佐劑與CDV NP抗原乳化加強(qiáng)免疫小鼠。在第4次免疫7 d后，對免疫小鼠進(jìn)行眼眶采血并離心取血清，利用間接ELISA方法測產(chǎn)生CDV NP抗體的效價(jià)，待效價(jià)(P/N≥2.1，P和N分別為去除PBS背景值的陽性及陰性O(shè)D450值)達(dá)到1∶10 000則符合細(xì)胞融合要求，否則需再每隔2周進(jìn)行免疫。在細(xì)胞融合前3 d，取0.2 mL不加佐劑的抗原，腹腔加強(qiáng)免疫小鼠。

1.2.2抗原包被濃度及陰陽性血清稀釋度的篩選

以純化的CDV NP作為抗原，設(shè)置篩選濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL)，每孔100 μL包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，陰陽性血清(1∶1 000～1∶128 000)進(jìn)行梯度稀釋(PBS)，作為一抗每孔100 μL；其中設(shè)定PBS溶液為空白對照。HRP-羊抗小鼠IgG用PBS按1∶4 000進(jìn)行稀釋作為二抗溶液，按照間接ELISA的方法[11]篩選出陰性血清和陽性血清的稀釋度以及抗原最優(yōu)包被濃度。

1.2.3細(xì)胞融合

1) 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

細(xì)胞融合前一天，將未免疫KM小鼠斷頸處死，對其進(jìn)行消毒后用剪刀輕輕剪開腹部皮膚至腹膜露出，用注射器吸取10 mL HAT培養(yǎng)基注入小鼠腹腔，針頭留于腹中，用棉球輕輕按揉腹部約1 min，用針管抽出腹腔內(nèi)含有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基約6 mL，置于50 mL HAT培養(yǎng)基中，混勻后向96孔細(xì)胞板滴加飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2) 骨髓瘤 (SP2/0)細(xì)胞的制備

將復(fù)蘇的SP2/0細(xì)胞加入6孔細(xì)胞板中，加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)并進(jìn)行換液、傳代。挑選10瓶細(xì)胞密度高、狀態(tài)好的SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。

3) 脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合

利用不完全DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞瓶中的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行吹打，將其轉(zhuǎn)入50 mL無菌離心管中。將符合細(xì)胞融合要求的BALB/c小鼠摘除眼球取血并離心取血清。將處死后的小鼠進(jìn)行消毒，取出脾臟，置于裝有不完全培養(yǎng)基的無菌平板中，用彎曲的無菌針頭輕輕刮動(dòng)脾臟組織，使脾臟細(xì)胞分離。將脾臟細(xì)胞懸液與SP2/0細(xì)胞懸液混合，離心。去除上清，在90 s內(nèi)加入1 mL的PEG-1500(40 ℃)，在90 s內(nèi)加入30 mL的DMEM培養(yǎng)基(37 ℃)，37 ℃靜置10 min，離心去除上清。加入40 mL HAT培養(yǎng)基，使其懸浮均勻，滴加于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后用HT培養(yǎng)基換出細(xì)胞板中的HAT培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察融合細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.4陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選

根據(jù)1.2.2小節(jié)篩選出的最佳濃度進(jìn)行抗原包被，將融合得到的克隆細(xì)胞上清液作為檢測一抗，分別將陰性血清和陽性血清用PBS以 1∶128 000進(jìn)行稀釋作為陰性對照組和陽性對照組，并設(shè)置空白對照PBS溶液和SP2/0細(xì)胞上清液；將HRP-羊抗小鼠IgG用PBST按1∶4 000進(jìn)行稀釋作為二抗溶液，參考間接ELISA的方法篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞。

1.2.5陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆

采用有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞。將細(xì)胞用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HT培養(yǎng)基按照1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000進(jìn)行稀釋，分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，亞克隆7 d后觀察細(xì)胞并標(biāo)注好單克隆細(xì)胞孔，當(dāng)單克隆細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí)，吸取上清液作為一抗溶液，用間接ELISA檢測抗體情況；繼續(xù)將陽性單克隆孔進(jìn)行1次或2次亞克隆，直至篩選出穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株。

1.3 腹水型單克隆抗體的制備

將能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)與凍存。實(shí)驗(yàn)前5 d，向BALB/c小鼠腹腔注入300 μL弗氏不完全佐劑增強(qiáng)免疫原性，將細(xì)胞狀態(tài)較好的細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，將0.3 mL(1～3×106個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞懸液注射小鼠腹腔。7 d后，若觀察到小鼠腹部明顯腫脹可用較粗的無菌針頭刺穿小鼠腹部(先對腹部進(jìn)行消毒處理)抽出腹水于離心管中；離心后保留上清液，-20 ℃保存，備用。

1.4 單克隆抗體的純化及生物特性的鑒定

1.4.1單克隆抗體的純化及純度鑒定

參考文獻(xiàn)[7]的方法用protein A柱對腹水進(jìn)行親和層析純化處理。加入Tris(pH值=10)至純化后單克隆抗體中，調(diào)pH至中性，-20 ℃保存。用分離膠濃度為10%的SDS-PAGE蛋白電泳對單克隆抗體純度進(jìn)行初步鑒定。

1.4.2單克隆抗體濃度測定

參考BCA蛋白濃度測定試劑盒，依次取BCA蛋白0、1、2、4、6、8、10 μL，加入7個(gè)孔中，補(bǔ)加雙蒸水使終體積為10 μL，再吸取10 μL待測CDV NP單克隆抗加體到空白孔中，每個(gè)樣品重復(fù)做2～3個(gè)；向其加入工作液后37 ℃溫浴30 min，冷卻至室溫后測孔中OD562吸光度值以此繪制BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CDV NP單克隆抗體濃度。

1.4.3單克隆抗體亞類鑒定

參考SIGMA單抗亞類鑒定試劑盒要求步驟鑒定抗體的亞型。

1.4.4單克隆抗體效價(jià)的測定

分別吸取1 μL純化后的單克隆抗體與1 μL腹水原液加入至1 mL PBS的EP管混勻，進(jìn)行倍比稀釋(1∶8 000～1∶2 048 000)，陽性、陰性血清分別稀釋(1∶128 000)，作為陽性、陰性對照， PBS作為空白對照。采用間接ELISA方法測定3-3G、1-10B單克隆抗體的效價(jià)。

1.4.5單克隆抗體的Western blot鑒定

取20 μL鎳柱純化得到的CDV N重組蛋白與誘導(dǎo)后的pET28a(+)/BL21(DE3)基因工程菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按照Western blot的操作步驟對純化得到的CDV NP單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定。一抗為純化的單克隆抗體稀釋液(1∶10 000)，二抗為HRP-羊抗鼠IgG稀釋液(1∶4 000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原包被濃度及陰陽性血清稀釋度的篩選

對免疫后的小鼠以及未免疫健康小鼠進(jìn)行眼眶取血收集血清。用單方陣法篩選出CDV NP抗原包被濃度最優(yōu)條件，選取OD450≈1，P/N≥2.1(P和N分別為是S+和S-去除空白的OD450值)抗原包被濃度與最佳陰陽血清稀釋比例，結(jié)果見表1，在抗原濃度為1 μg/mL的條件下，血清稀釋度為1∶128 000時(shí)，S+的OD450值為1.057 5，約為1.0，因此陰陽血清稀釋度最佳條件為1∶128 000。

表1 不同抗原包被濃度以及陰陽血清稀釋度ELISA結(jié)果

2.2 細(xì)胞融合及篩選結(jié)果

細(xì)胞融合前與融合后的圖片如圖1所示。共有5塊96孔細(xì)胞板進(jìn)行融合篩選，有480孔有融合細(xì)胞生長，融合率為100%，陽性率為93.8%(表2)。選擇其中OD450值較高的30個(gè)陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，篩選得到了2株較穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3-3G、1-10B。

圖1 細(xì)胞融合前與融合后的圖片(10×10)

表2 陽性率統(tǒng)計(jì)

2.3 單克隆抗體的生物特性鑒定

2.3.1單克隆抗體的純化及純度鑒定

將從小鼠腹部收集到的單克隆抗體腹水原液用PBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋，利用protein A柱對腹水進(jìn)行親和層析純化，如圖2所示；分別對單克隆抗體稀釋腹水、純化時(shí)流穿液、280 nm紫外吸收峰進(jìn)行凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，在稀釋腹水原液中含有大量雜蛋白，流穿液在25 kd和50 kd處有明顯的條帶而無其他雜帶，這符合抗體條帶的預(yù)期結(jié)果。

圖2 單抗純化圖

圖3 單克隆抗體SDS-AGE純度鑒定

2.3.2單克隆抗體濃度的測定

按照BCA試劑盒測定單克隆抗體的濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，回歸方程式：y=3.033 5x-0.538 1，R2=0.994 6，線性關(guān)系良好。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得單克隆抗體濃度，結(jié)果如表3所示。

表3 單克隆抗體濃度的測定結(jié)果

圖4 BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3單克隆抗體亞型的鑒定

吸取3-3G、1-10B單克隆細(xì)胞株上清液，利用SIGMA單克隆抗體亞型分類試劑盒測定CDV NP 單克隆抗體所屬的亞型，結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明3-3G、1-10B均為IGg2型。

表4 單克隆抗體亞型OD450值鑒定結(jié)果

2.3.4單克隆抗體效價(jià)的測定

將3-3G、1-10B單克隆抗體與腹水原液進(jìn)行倍比稀釋，利用間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)測定，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明3-3G、1-10B單克隆抗體效價(jià)都達(dá)到1∶2 048 000。

表5 腹水及單克隆抗體效價(jià)的測定結(jié)果

2.3.5單克隆抗體的Western blot鑒定

取經(jīng)Ni柱純化后的重組蛋白CDV NP、空載體pET28a(+)/BL21(DE3)工程菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用Western blot對CDV NP單克隆抗體的特異性進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在60 kd處，CDV NP重組蛋白與CDV NP單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合并出現(xiàn)明顯的蛋白印跡條帶，空載體對照組無條帶，由此說明，上述制得的CDV NP單克隆抗體特異性良好。

圖5 CDV NP 單克隆抗體的Western blot鑒定

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功使用原核系統(tǒng)表達(dá)了犬瘟熱CDV NP蛋白，為進(jìn)一步研制犬瘟熱檢測技術(shù)疫苗奠定了基礎(chǔ)。本研究采用CDV NP對小鼠進(jìn)行長程免疫，經(jīng)過4次免疫達(dá)到細(xì)胞融合要求。選擇PEG1500將小鼠的脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，融合率達(dá)到100%，陽性率為93.8%。經(jīng)過多次間接 ELISA 篩選最終獲得了2株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，注射BABL/c小鼠腹腔制備腹水，將腹水通過protein A柱進(jìn)行親和層析純化，并進(jìn)行一系列的生物特性鑒定。SDS-PAGE凝膠電泳鑒定、BCA法濃度測定結(jié)果表明單克隆抗體在25 kd和50 kd有明顯條帶，且純度較好，濃度較高。亞型試劑鑒定盒結(jié)果表明2株單克隆雜交瘤細(xì)胞株均為IGg2型。Western blot結(jié)果表明在60 kd處有明顯特異性條帶，單克隆抗體效價(jià)均達(dá)到1∶2 048 000。本實(shí)驗(yàn)制備的高效價(jià)、特異性強(qiáng)的單克隆抗體將為犬瘟熱的診斷提供優(yōu)良試劑。