一種新型近紅外熒光探針用于Aβ40聚集體的檢測

徐蘊澤，堯雨斯，呂光磊，李春霞

（1.山東大學(xué)前沿交叉科學(xué)青島研究院，分子科學(xué)與工程研究院，山東 青島 266237；2.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

1 引 言

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，與癌癥、心腦血管疾病一起成為當(dāng)下危害人類健康的最主要的三大疾病[1]。阿爾茨海默癥主要發(fā)病于老年人群體，嚴重威脅著老年人的身心健康[2]。由于阿爾茨海默癥的發(fā)病機制尚不清楚，因此至今沒有有效的藥物能夠徹底地根除這一病癥，只能對該疾病的前期和中期的癥狀實現(xiàn)一定的抑制和緩解治療效果。β-淀粉樣蛋白（Aβ）作為阿爾茨海默癥病理性標志物之一，與AD的發(fā)病之間有著密切的關(guān)系。因此，對于Aβ蛋白的檢測對AD的診療具有重要的意義。目前用于Aβ檢測的手段主要有：正電子發(fā)射斷層掃描成像（PET）、磁共振成像（MRI）、光聲成像（PA）以及熒光成像（FI）等。相對于其他成像方法來說，熒光成像方法具有設(shè)備低廉、檢測方便、響應(yīng)快速、靈敏度高等特點[3-6]，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白檢測。

近幾年來，關(guān)于Aβ聚集體的檢測性熒光探針報道較多。最主要的分為苯并噻唑類熒光探針[7-9]、姜黃素類熒光探針[10-15]、BODIPY類熒光探針、花菁類熒光探針[16-19]、香豆素類熒光探針[20-21]以及喹啉二腈類熒光探針[22-24]等。這些探針均具有良好的熒光發(fā)射波長以及較強的蛋白結(jié)合能力，但是大部分用于檢測Aβ42聚集體，而用于檢測Aβ40聚集體的熒光探針報道則比較少。Aβ40在AD早期患者大腦中是含量最多的一種Aβ物種，而且在AD的發(fā)病過程中，Aβ40聚集體發(fā)揮著重要作用[25]。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)對Aβ40聚集體的特異性檢測就顯得非常重要。

本工作中基于甲氧基喹啉結(jié)構(gòu)設(shè)計的熒光探針C-1，能夠?qū)崿F(xiàn)對Aβ40聚集體的特異性檢測，該探針對Aβ40展現(xiàn)出良好的選擇性和結(jié)合能力（Kd=3.072 μmol/L）。除此之外，該探針與Aβ40聚集體響應(yīng)速度快，與目標蛋白結(jié)合后幾秒鐘就可發(fā)出強烈的熒光，并且能夠保持長時間的熒光穩(wěn)定性，具有在生物組織成像上的良好應(yīng)用前景。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

實驗過程中用到的各種原料藥品均為分析純，購買自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，純化用的有機溶劑均為分析純，購買自國藥集團藥業(yè)股份有限公司。液相核磁共振波譜儀AV-600 NMR，AV-400 NMR，Bruker；高分辨率質(zhì)譜儀MicroTOF10257，Bruker；熒光分光光度計Hitachi F-4600，日本日立高新技術(shù)公司；紫外-可見吸收光譜儀UH-5300，上海森信實驗儀器有限公司；冷凍干燥機SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技有限公司。

2.2 探針C-1的合成及表征

圖1為探針C-1的合成路線，具體合成方法及表征數(shù)據(jù)如下。

圖1 探針C-1的合成路線Fig.1 Synthetic route for the probe C-1

化合物KL-1的合成：稱取6-甲氧基-2-甲基喹啉（1.73 g,10 mmol）溶解到10 mL乙腈溶液中，再加入碘甲烷（2.13 g，15 mmol），加熱回流8 h，待冷卻到室溫，觀察到有白色固體析出，抽濾得到產(chǎn)物KL-1（白色固體，94.6%）。1H NMR（400 MHz，DMSO）δ=8.94（d,J=8.6 Hz,1H）,8.51（d,J=9.4 Hz,1H）,8.05（d,J=8.6 Hz,1H）,7.84（dt,J=5.1,2.8 Hz,2H）,4.42（s,3H）,4.00（s,3H）,3.02（s,3H）。

化合物NH-1的合成：稱取6-羥基-2-萘甲醛（0.86 g，5 mmol）和焦亞硫酸鈉（1.90 g，10 mmol）于100 mL的圓底燒瓶中，加入30 mL的蒸餾水作為溶劑，再加入二甲胺水溶液10 mL，140℃條件下加熱回流反應(yīng)72 h，待到反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，飽和食鹽水洗滌，用乙酸乙酯萃取粗產(chǎn)物，加入無水硫酸鈉除水，旋干后上樣進行柱純化，用乙酸乙酯/石油醚=1∶10做洗脫劑，得到純的產(chǎn)物NH-1（黃綠色，12.5%）。1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ=10.03（s,1H）,8.17（s,1H）,7.88～7.85（m,1H）,7.84（d,J=2.0 Hz,1H）,7.69（d,J=8.6 Hz,1H）,7.20（dd,J=9.1,2.6 Hz,1H）,6.91（d,J=2.5 Hz,1H）,3.15（s,6H）。

化合物C-1的合成：稱取化合物NH-1（39.8 mg，0.2 mmol）和化合物KL-1（63.0 mg，0.2 mmol）加 入到無水乙醇溶液中，再加入幾滴哌啶，回流反應(yīng)8h，待反應(yīng)冷卻后用甲醇/二氯甲烷=1∶50作洗脫劑，進行柱純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到產(chǎn)物C-1（紅色固 體，28.3%）。1H NMR（400 MHz,DMSO）δ=8.72（d,J=8.9 Hz,1H）,8.37（dd,J=18.6,9.2 Hz,2H）,8.17～8.04（m,2H）,7.95（d,J=8.4 Hz,1H）,7.69（dt,J=18.2,8.7 Hz,5H）,7.14（d,J=10.2 Hz,1H）,6.81（s,1H）,4.43（s,3H）,3.97（s,3H）,3.02（s,6H）。13C NMR（150 MHz,DMSO）δ=158.91,153.96,150.20,147.03,142.27,136.77,134.92,132.01,130.35,129.73,128.71,127.07,126.01,125.66,125.05,121.48,121.33,116.81,116.46,109.01,105.66,56.64,55.38。HRMS（ESI,m/z）:calcd for C25H25N2O+,369.196 1;f ound:369.196 7。

2.3 各種蛋白的制備

Aβ40單體的制備：稱取Aβ40單體蛋白1 mg，溶解于2 mL pH=7.4的磷酸緩沖溶液（PBS）中，搖晃均勻，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ42單體的制備：稱取Aβ42單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，搖晃均勻，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

VQIVYK短肽蛋白的制備：稱取VQIVYK短肽蛋白1 mg，溶解于2 mL的PBS溶液中，再加入1.44 mg的肝素鈉，磁力攪拌2～3 d，配制成為600μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ40聚集體的制備：稱取Aβ40單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Aβ42聚集體的制備：稱取Aβ42單體蛋白1 mg，溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱冷凍備用。

Amylin蛋白的制備：類似于Aβ蛋白的制備，取0.78 mg溶解于2 mL PBS溶液中，磁力攪拌2～3 d，配制成為100 μmol/L的溶液，放入冰箱備用。

2.4 活性物質(zhì)的制備

ROS/RNS溶 液 的 配 制：取20.24 μL的30%H2O2溶液定容至10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的H2O2溶液。取有效氯含量為5%的Na-ClO溶液10 μL定容于2 mL去離子 水 中，配制 成為5 mmol/L的HOCl溶液。取27.7 μL的叔 丁 基過氧化氫定容于10 mL的去離子水中，配制成為20 mmol/L的TBHP溶液。稱取59.59 mg的亞硝基鐵氰化鈉定容于10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的NO溶液。取54.24 mg的偶氮二異丁脒鹽酸鹽定容于10 mL去離子水中，配制成為20 mmol/L的ROO·溶液。用1 mmol/L的Fe2+溶液和200 μmol/L的H2O2溶液配 制 成 為200 μmol/L的·OH溶液。用1 mmol/L的Fe2+溶液和200 μmol/L的TBHP溶液配制成200 μmol/L的TBO·溶液。

陰陽離子溶液的配制：稱取4 mg的無水乙酸鈉定容于5 mL去離子水中，配制成為10 mmol/L的CO3COO-溶液。同理，稱取5.3 mg的無水碳酸鈉配制成CO32-溶液。稱取12.3 mg的硫酸鎂配制成SO42-溶液。稱取2.9 mg的氯化鈉配成Cl-溶液。稱取2.1 mg的氟化鈉配制成F-溶液。稱取8.3 mg的碘化鉀配制成I-溶液。稱取3.4 mg的亞硝酸鈉配制成NO2-溶液。稱取8.7 mg的低亞硫酸鈉配制成S2O42-溶液。稱取8.8 mg的乙酸鎳配制成Ni2+溶液。稱取10.2 mg的氯化鎂配制成Mg2+溶液。稱取12.1 mg的六水氯化鋁配制成Al3+溶液。稱取8.8mg的乙酸鈣配制成Ca2+溶液。稱取3.7 mg的氯化鉀配制成K+溶液。稱取13.9 mg的七水合硫酸亞鐵配制成Fe2+溶液。稱取8.6 mg的氯化銅配制成Cu2+溶液。稱取3.9 mg乙酸銨配制成NH4+溶液。稱取10.97 mg的乙酸鋅配制成Zn2+溶液。

氨基酸溶液的配制：分別稱取5.8 mg的L-脯氨酸、5.3 mg的L-絲氨酸、4.5 mg的丙氨酸、12.3 mg的 谷 氨酰 胺、5.9 mg的 纈 氨 酸、6.0 mg的蘇 氨酸、6.6 mg的異亮氨酸、9.1 mg的酪氨酸、7.5 mg的甲硫氨酸、10.2 mg的色氨酸、9.0 mg的苯丙氨酸、6.1 mg的半胱氨酸、7.4 mg的谷氨酸和7.3 mg的賴氨酸定容于5 mL的PBS溶液中，配制成對應(yīng)的10 mmol/L氨基酸溶液。

還原性物質(zhì)溶液的配制：分別取N-乙酰半胱氨酸8.2 mg、谷胱甘肽15.4 mg、葡萄糖9.9 mg以及37%～40%的甲醛水溶液3.7 μL定容至5 mL的PBS溶液中，配制成10 mmol/L的相應(yīng)溶液。

2.5 結(jié)合常數(shù)（Kd）的測定

采用固定的蛋白濃度，用不同濃度的探針對其進行熒光滴定的方法，得出相應(yīng)的熒光值，再通過非線性擬合計算得出探針對目標蛋白的結(jié)合常數(shù)Kd值，以此來進行評估探針與蛋白的結(jié)合能力。

2.6 檢出限（LOD）的測定

首先，對探針的PBS溶液進行空白測定，用熒光分光光度計連續(xù)測11次，得出方差σ，作為儀器的誤差校正，再根據(jù)蛋白對探針濃度滴定的線性方程斜率k，代入檢出限（LOD）計算公式D=3σ/k，計算得出檢出限。

3 結(jié)果與討論

3.1 選擇性和結(jié)合力

首先，測定了探針C-1的吸收、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜（圖S1），得出其光譜屬性，C-1的發(fā)射波長在640 nm處。之后對該探針的性能進行測定，首先測定了C-1對各種蛋白的選擇性。選用VQIVYK短肽（Val-Gln-Ile-Val-Tyr-Lys，又稱PHF6，Tau蛋白R3序列中一段關(guān)鍵蛋白）、Aβ40單體、Aβ40聚集體、Aβ42單體以及Aβ42聚集體進行測試。探針的濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），VQIVYK短肽濃度為50 μmol/L，其余各種蛋白的濃度均為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）。由圖2（a）可以明顯地看出，探針C-1與Aβ40聚集體結(jié)合后表現(xiàn)出的熒光強度最強，對其他各種蛋白的響應(yīng)很弱。我們測試了探針結(jié)合Aβ40前后的絕對熒光量子產(chǎn)率變化。未與Aβ40結(jié)合時，探針的量子產(chǎn)率為ΦC-1=0.6%；與Aβ40結(jié)合后，其量子效率得到了較大的提升，ΦC-1+Aβ=2.4%。以上結(jié)果說明探針C-1可以與Aβ40聚集體有良好的熒光響應(yīng)和選擇性。除此之外，我們還測試了探針C-1對人血清白蛋白以及Amylin蛋白的選擇性，由圖S2可以看出，人血清蛋白和Amylin蛋白同樣不會對探針C-1的選擇性造成影響。研究了探針C-1與Aβ40聚集體的結(jié)合能力。使用固定的蛋白濃度，采用探針對其進行熒光滴定的方法，得出相應(yīng)的熒光值，再通過非線性擬合得出探針對Aβ40聚集體的結(jié)合數(shù)值，以此來評估探針與蛋白的結(jié)合能力。由圖2（b）可見，結(jié)合常數(shù)Kd=3.072 μmol/L，R2=0.973 2，探針C-1與Aβ40聚集體有著較強的結(jié)合能力。進一步探究探針C-1與Aβ40聚集體濃度的關(guān)系，由圖2（c）可見，固定探針濃度為2 μmol/L，用Aβ40聚集體對探針進行濃度滴定。隨著Aβ40聚集體濃度由0～7 μmol/L逐漸增加，探針C-1的熒光強度也隨之逐漸增強，且強度增幅較大，使探針能夠?qū)δ繕说鞍椎亩ㄐ詸z測更加明顯。通過對熒光數(shù)值進行定量的數(shù)據(jù)處理，能夠得出探針C-1與Aβ40聚集體結(jié)合的線性關(guān)系，R2=0.96（圖2（d））。除此之外，探針C-1表現(xiàn)出較高的靈敏度，檢出限D(zhuǎn)=2.77 μmol/L。

圖2 探針C-1對Aβ40的響應(yīng)特性。（a）C-1對各種蛋白的選擇性；（b）C-1的結(jié)合常數(shù)；（c）Aβ40對C-1的濃度滴定；（d）C-1與Aβ40濃度的線性關(guān)系以及檢出限。Fig.2 Response characteristics of probe C-1 to Aβ40.（a）Selectivity of C-1 for proteins.（b）Binding constant of C-1.（c）Concentration titration of Aβ40 to C-1.（d）Linearity of C-1 and Aβ40 concentrations and detection limits.

3.2 抗干擾性

熒光探針的亮度和穩(wěn)定性是決定熒光成像技術(shù)的靈敏度和檢測限的重要因素[26]。因此，我們研究了探針C-1的抗干擾穩(wěn)定性測試，分別測試了探針C-1在多種氨基酸、RNS/ROS、各種陰陽離子以及還原性物質(zhì)存在下的抗干擾能力。首先測定探針C-1與Aβ40聚集體結(jié)合后在多種氨基酸存在下的抗干擾性，在2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的探針和5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的Aβ 40聚集體存在的條件下，分別加入5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）的L-脯氨酸（Pro）、L-絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺（Gln）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）。通過熒光分光光度計測定熒光強度變化，在多種氨基酸存在下，Aβ40聚集體與探針C-1結(jié)合后的熒光強度無明顯變化，各種氨基酸的存在不會對探針的檢測作用造成干擾（圖3（a））。

圖3 探針C-1的抗干擾性測試。（a）A～P：探針、Aβ40、Ala、Cys、Gln、Glu、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val；（b）A～I：探針、Aβ40、ROO·、HOCl、H2O2、TBO·、TBHP、NO、·OH；（c）A～I：探針、Aβ40、Al3+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+、Mg2+、NH4+、Ni2+；（d）A～J：探針、Aβ40、Cl-、CO32-、CO3COO-、F-、I-、NO2-、S2O42-、SO42-。Fig.3 Interference resistance of the probe C-1.（a）A-P：probe，Aβ40，Ala，Cys，Gln，Glu，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val.（b）A-I：probe，Aβ40，ROO·，HOCl，H2O2，TBO·，TBHP，NO，·OH.（c）A-I：probe，Aβ40，Al3+，Ca2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，K+，Mg2+，NH4+，Ni2+.（d）A-J：probe，Aβ40，Cl-，CO32-，CO3COO-，F(xiàn)-，I-，NO2-，S2O42-，SO42-.

選用ROO·、HOCl、H2O2、TBO·、TBHP、NO以及·OH等多種ROS/RNS來測定熒光探針C-1在該類活性物質(zhì)存在條件下的抗干擾性。探針濃度2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），Aβ40聚集體和各種活 性 物 質(zhì) 的 濃 度 均 為5 μmol/L（PBS溶 液，pH=7.4）,進行相關(guān)的實驗測試。由圖3（b）可見，探針C-1在多種活性氧和活性氮物質(zhì)存在下，其熒光強度仍然能夠維持一個穩(wěn)定的狀態(tài)，說明探針C-1的熒光成像不受該類物質(zhì)的干擾。

然后，我們測定了探針C-1在不同陰陽離子存在條件下的抗干擾能力。分別選用Al3+、Ca2+、Fe2+、Zn2+、K+、Mg2+、NH4+和Ni2+等陽離子（圖3（c））,以 及Cl-、CO32-、CO3COO-、F-、I-、NO2-、S2O42-和SO42-等陰離子（圖3（d））來測定探針C-1在生物環(huán)境溶液中的抗干擾能力。探針的濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），目標蛋白和各種離子的濃度均為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4）。實驗結(jié)果表明，探針C-1同樣表現(xiàn)出了良好的抗干擾性。

3.3 穩(wěn)定性

接下來，我們測定了探針在谷胱甘肽（GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、甲醛（HCHO）以及葡萄糖（Glucose）四種還原性物質(zhì)存在下的穩(wěn)定性。探針濃度為2 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），目標蛋白的濃度為5 μmol/L（PBS溶液，pH=7.4），還原性物質(zhì)的用量分別為目標蛋白的0，1，2.5，5，10個當(dāng)量。探針C-1在谷胱甘肽（圖4（a））、NAC（圖4（b））、甲醛（圖4（c））以及Glucose（圖4（d））的0～10個當(dāng)量存在條件下，依舊能夠與Aβ40聚集體結(jié)合且保持良好的熒光穩(wěn)定。探針C-1在生物體系溶液環(huán)境中，完全不受多種還原性物質(zhì)的干擾。

圖4 探針C-1與Aβ40在GSH（a）、NAC（b）、HCHO（c）和葡萄糖（d）存在情況下的穩(wěn)定性測試。Fig.4 Stability of the probe C-1 with Aβ40 in the presence of GSH（a），NAC（b），HCHO（c）and Glucose（d）.

我們還測定了探針C-1隨時間變化以及在不同pH值下的穩(wěn)定性。由圖S3（a）可以看出，探針C-1與Aβ40響應(yīng)極快，加入后幾秒鐘就可發(fā)出強熒光，且隨時間延長能夠保持較強的穩(wěn)定性，經(jīng)過30 min后仍然能保持熒光穩(wěn)定。配制pH值范圍為2～11的磷酸緩沖溶液。由圖S3（b）可以清晰地看出，無論是在酸性或者是堿性條件下，探針C-1自身以及與Aβ 40結(jié)合后，均能夠保持熒光穩(wěn)定性。最后，我們測定了該探針的生物相容性，通過MTT法[27]進行評估。選用Hela細胞在37℃條件下與探針共同孵育24 h，由圖S4可以看出，即使探針的濃度達到了40 μmol/L，細胞的存活率仍然能夠達到80%以上，證明了該探針的低毒性。

4 結(jié) 論

在本工作中，我們設(shè)計合成了近紅外熒光探針C-1，實現(xiàn)了對Aβ40聚集體良好的特異性檢測。探針C-1具有640 nm的熒光發(fā)射波長，且與Aβ40聚集體的結(jié)合能力強，響應(yīng)速度快，抗干擾能力強，穩(wěn)定性好，并且背景干擾小，在溶液測試中表現(xiàn)出較好的性能。除此之外，該探針的生物相容性良好。綜上所述，探針C-1具備的這些優(yōu)點可能會使其在生物成像上具有一定的應(yīng)用潛力。

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