新疆和靜縣巴音布魯克羊新孢子蟲感染狀況橫斷面研究

艾日登才次克，馬偉，薛文，丁劍，范冰潔，賈舒安，劉平，劉亞濤

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

在我國(guó)，巴音布魯克羊主要飼養(yǎng)在新疆和靜縣、和碩縣、焉耆縣和輪臺(tái)縣，是巴音郭楞蒙古自治州的一個(gè)主要地方養(yǎng)殖品種，具有性早熟、耐粗飼、抗寒抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)高海拔地區(qū)等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民主要飼養(yǎng)的肉脂兼用地方品種[1]。

新孢子蟲病（neosporosis）是犬新孢子蟲（N.caninum）寄生于犬、牛、馬、羊等多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病，在全世界范圍內(nèi)流行，對(duì)母畜危害尤為嚴(yán)重，主要造成母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，以及新生仔畜的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。新孢子蟲病可通過垂直和水平傳播方式傳播[2]。

從20 世紀(jì)80 年代末發(fā)現(xiàn)新孢子蟲病以來(lái)，有關(guān)報(bào)道主要集中于牛，涉及美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、南非、日本等30 多個(gè)國(guó)家，流行率一般為10%～40%，最高可達(dá)82%。我國(guó)對(duì)牛新孢子蟲病的研究較多，但對(duì)羊的調(diào)查較少[3-4]。馬少麗等[5]首次對(duì)青海省絨山羊新孢子蟲病進(jìn)行了報(bào)道，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲感染率為6.44%。李宗文等[6]、陸艷等[7]對(duì)青海省改良絨山羊新孢子蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率為3.0%～12.8%。李曉卉等[8]對(duì)青海省烏蘭縣改良絨山羊群中混群生產(chǎn)的綿羊進(jìn)行了新孢子蟲檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲感染率為8.25%。楊娜等[9]應(yīng)用新孢子蟲凝集試驗(yàn)（NAT），對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)散養(yǎng)放牧的263 份綿羊和242 份山羊血樣進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綿羊新孢子蟲抗體陽(yáng)性率為14.8%，山羊?yàn)?3.6%。哈希巴特等[10]利用重組蛋白間接ELISA 方法，對(duì)新疆地區(qū)的267 份絨山羊血清進(jìn)行新孢子蟲抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率為 16.1%，陽(yáng)性率高于青海省和內(nèi)蒙古地區(qū)。

上述調(diào)查多數(shù)是在2010 年以前開展的，近期的調(diào)查數(shù)據(jù)較少。為了解新疆地區(qū)最新的羊新孢子蟲病群流行率及群間傳播相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，2021 年9 月—2022 年5 月對(duì)和靜縣巴音布魯克羊開展了新孢子蟲感染橫斷面研究，以期為該病防控提出建議。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群及研究個(gè)體

以和靜縣12 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的7 102 個(gè)羊養(yǎng)殖場(chǎng)戶為目標(biāo)群體，包括農(nóng)區(qū)和牧區(qū)，均為散養(yǎng)戶；以這些養(yǎng)殖場(chǎng)戶飼養(yǎng)的巴音布魯克羊?yàn)檠芯總€(gè)體。

1.2 抽樣策略

1.2.1 抽樣框 將7 102個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)戶定為抽樣框，采用分階段抽樣方法，先確定抽樣場(chǎng)戶，再在場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行個(gè)體抽樣。

1.2.2 場(chǎng)戶選擇 按照預(yù)估流行率方式計(jì)算理論抽樣場(chǎng)數(shù)（N），取95%置信度（CI）、50%群預(yù)期流行率（P）、12%可接受誤差（d），通過估計(jì)動(dòng)物疾病流行率的抽樣量計(jì)算器[16]，計(jì)算得到的抽樣場(chǎng)戶數(shù)為67 個(gè)；根據(jù)12 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)場(chǎng)戶數(shù)量按比例分配，在每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)內(nèi)簡(jiǎn)單隨機(jī)挑選抽樣場(chǎng)戶。抽樣場(chǎng)戶鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布見表1。

表1 和靜縣巴音布魯克羊存欄量和場(chǎng)群抽樣計(jì)劃

1.2.3 場(chǎng)內(nèi)個(gè)體選擇 按照發(fā)現(xiàn)疫病方式計(jì)算場(chǎng)內(nèi)個(gè)體采樣數(shù)（n），取95%置信度（CI）、95%試驗(yàn)敏感性（Se）、15%預(yù)期流行率（p）[10]，場(chǎng)內(nèi)動(dòng)物數(shù)定為200 只，計(jì)算得到每場(chǎng)需采集樣本20 份；場(chǎng)戶內(nèi)樣品通過簡(jiǎn)單隨機(jī)方法抽取，共采集樣品1 340 份。

1.3 檢測(cè)方法

參照《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 3499—2013），采用新孢子蟲間接ELISA 抗體檢測(cè)盒（ID.vet）檢測(cè)。根據(jù)試劑盒生產(chǎn)公司提供的數(shù)據(jù)，該試劑盒的敏感性（Se）為95%，特異性（Sp）為100%。

1.4 病例定義

經(jīng)新孢子蟲間接ELISA 抗體試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的羊只為陽(yáng)性個(gè)體，檢出m例及以上陽(yáng)性個(gè)體的養(yǎng)殖場(chǎng)戶為陽(yáng)性場(chǎng)戶。m為判定陽(yáng)性場(chǎng)的 cut-off值，由個(gè)體流行率（p）結(jié)合試驗(yàn)敏感性（Se）、特異性（Sp）和每場(chǎng)抽樣數(shù)量（n）確定。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)因素問卷設(shè)計(jì)

前期對(duì)幾家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行預(yù)調(diào)查，根據(jù)實(shí)際情況和調(diào)查結(jié)果，最終確定調(diào)查問卷內(nèi)容。內(nèi)容包括養(yǎng)殖場(chǎng)點(diǎn)基本情況和可能存在的風(fēng)險(xiǎn)因素兩部分，共15 個(gè)問題。采樣時(shí)，同步進(jìn)行問卷調(diào)查，主要由村級(jí)防疫員發(fā)放，待問卷填寫完成后和樣品一起收回。

1.6 數(shù)據(jù)分析

按公式計(jì)算場(chǎng)群表觀流行率（HAP）和場(chǎng)群真實(shí)流行率（HTP）：HAP=場(chǎng)群陽(yáng)性數(shù)/總檢測(cè)場(chǎng)群數(shù)；HTP=（HAP+HSp-1）/（HSe+HSp-1）。式中，HSe 為群敏感性，HSp 為群特異性。

根據(jù)試驗(yàn)敏感性（Se）、特異性（Sp）、場(chǎng)內(nèi)抽樣數(shù)量（n）、場(chǎng)內(nèi)預(yù)期流行率（p），計(jì)算HSe 和HSp[12]：HSe=1-[1-p×Se -（1-p）（1-Sp）]n；HSp=Spn；95%CI 通過Beta 分布模擬計(jì)算。計(jì)算出不同cut-off值下的HSe 和HSp 見表2。cut-off值為 1 時(shí)HSe 和HSp 均最高，因此確定經(jīng)新孢子蟲間接ELISA 抗體試劑盒檢測(cè)出1 例及以上新孢子蟲陽(yáng)性個(gè)體的養(yǎng)殖場(chǎng)戶為陽(yáng)性場(chǎng)（m=1），此時(shí)檢出陽(yáng)性場(chǎng)的HSe 為91.1%，HSp 為100%。

表2 不同 cut-off值下的HSe 和HSp 單位：%

1.7 風(fēng)險(xiǎn)因素問卷統(tǒng)計(jì)分析

以是否為新孢子蟲病陽(yáng)性場(chǎng)為結(jié)局變量，用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，篩選出P＜0.20 的因素，并采用Logistic 回歸進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群流行率

抗體檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：共檢測(cè)了67 個(gè)場(chǎng)戶1 340 份羊血清樣品，檢出22 個(gè)陽(yáng)性場(chǎng)戶、110份陽(yáng)性樣品，個(gè)體表觀流行率為8.21%（95%CI：6.79%～9.81%），群表觀流行率（HAP）為32.84%（95%CI：21.85%～45.40%），群真實(shí)流行率（HTP）為36.05%（95%CI：24.93%～49.93%）。乃門莫墩鎮(zhèn)、和靜鎮(zhèn)場(chǎng)群陽(yáng)性率較高，其次為巴潤(rùn)哈爾莫墩鎮(zhèn)，以上鄉(xiāng)鎮(zhèn)均位于農(nóng)區(qū)；而克爾古提鄉(xiāng)、巴音郭愣鄉(xiāng)、巴侖臺(tái)鎮(zhèn)、鞏乃斯鎮(zhèn)沒有檢測(cè)到陽(yáng)性場(chǎng)，這些鄉(xiāng)鎮(zhèn)均位于牧區(qū)。農(nóng)區(qū)群陽(yáng)性率為59.09%（13/22），牧區(qū)為20.00%（9/45），農(nóng)區(qū)場(chǎng)群陽(yáng)性率明顯高于牧區(qū)（P＜0.05）。

2.2 風(fēng)險(xiǎn)因素分析

2.2.1 單因素分析 根據(jù)問卷調(diào)查結(jié)果，用IBM SPSS Statistics 25 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素分析卡方檢驗(yàn)，對(duì)8 個(gè)自變量（假定風(fēng)險(xiǎn)因素）與結(jié)局（是否為新孢子蟲陽(yáng)性場(chǎng)）之間的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果（表4）顯示：“飼養(yǎng)方式”“建廠時(shí)間”“混群前是否隔離觀察”“圈舍是否消毒”和“養(yǎng)殖環(huán)境”具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.20）。

2.2.2 多因素分析 為了進(jìn)一步尋找可能造成新孢子蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)因素，剔除混雜因素，使用Logistic 回歸進(jìn)行多因素分析。Logistic 回歸分析

結(jié)果（表5）顯示，“飼養(yǎng)方式”“建廠時(shí)間”和“圈舍是否消毒”具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)Hosmer&Lemeshow 檢驗(yàn)，P=0.972（＞0.05），表明Logistic 回歸模型的擬合度較好。繪制ROC曲線（圖1），曲線下面積為81.3%（95%CI：70.2%～92.4%），表明該模型預(yù)測(cè)性能尚可。

表3 不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)殖場(chǎng)戶檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 新孢子蟲病單因素風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果

表5 多因素Logistic 回歸分析結(jié)果

圖1 Logistic 回歸模型ROC 曲線

3 討論

3.1 流行率

本研究發(fā)現(xiàn)，和靜縣巴音布魯克羊新孢子蟲病群表觀流行率為32.84%（95%CI：21.85%～45.40%），群真實(shí)流行率為36.05%（95%CI：24.93%～49.93%）。過往文獻(xiàn)研究個(gè)體流行率的較多，而研究場(chǎng)群流行率的較少。本次檢測(cè)的個(gè)體陽(yáng)性率為8.21%（95%CI：6.79%～9.81%），低于哈希巴特等[10]檢測(cè)的新疆地區(qū)絨山羊新孢子蟲陽(yáng)性率16.1%，也低于楊娜等[9]檢測(cè)的內(nèi)蒙古地區(qū)散養(yǎng)半牧半舍綿羊新孢子蟲陽(yáng)性率14.8%，而與李曉卉等[8]檢測(cè)的青海省綿羊陽(yáng)性率8.25%近似。本次檢測(cè)的巴音布魯克羊個(gè)體陽(yáng)性率雖然低于新疆絨山羊，但在12 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中的8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢測(cè)出陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)，場(chǎng)群流行率也較高，表明新孢子蟲病流行范圍較廣，在場(chǎng)群中流行普遍。

3.2 風(fēng)險(xiǎn)因素

經(jīng)卡方檢驗(yàn)和二元Logistic 回歸分析得到“飼養(yǎng)方式為舍飼”“建廠時(shí)間在6 年以上”和“圈舍沒有消毒”等3 個(gè)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示這些為養(yǎng)殖場(chǎng)感染新孢子蟲的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。初步分析，新孢子蟲可通過胎盤垂直傳播，也可通過攝入被新孢子蟲卵囊或包囊組織污染的食物或水而水平傳播。舍飼環(huán)境相對(duì)密封，如果對(duì)圈舍不消毒，羊群就更容易感染新孢子蟲；而半舍半牧的飼養(yǎng)方式，飼養(yǎng)季節(jié)不同，飼養(yǎng)環(huán)境就不一樣，夏天圈舍長(zhǎng)時(shí)間空舍，太陽(yáng)照射較為充分，可以殺滅新孢子蟲，從而降低新孢子蟲感染率。新孢子蟲可垂直傳播，因此建廠時(shí)間越長(zhǎng)，新孢子蟲感染的可能性就越高。因此，規(guī)范的消毒制度可以降低新孢子蟲感染風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 局限性

本次研究采用橫斷面研究方法，僅代表一個(gè)時(shí)間段內(nèi)的結(jié)果，建立起的關(guān)聯(lián)性不一定有因果聯(lián)系，需進(jìn)一步研究；在調(diào)查問卷問題設(shè)定方面，因流產(chǎn)的因素眾多，且新孢子蟲病對(duì)羊群危害和風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)研究較少，設(shè)置不夠全面，有一定的局限性。

4 結(jié)論

研究表明：新孢子蟲在和靜縣巴音布魯克羊群中流行普遍，流行范圍較廣；長(zhǎng)時(shí)間舍內(nèi)飼養(yǎng)、建廠時(shí)間久、衛(wèi)生消毒管理差是導(dǎo)致該地區(qū)新孢子蟲流行的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，需提高養(yǎng)殖場(chǎng)戶飼養(yǎng)管理水平，定期對(duì)圈舍進(jìn)行消毒并保證一定的空圈時(shí)間，以降低新孢子蟲感染風(fēng)險(xiǎn)。