豬圓環(huán)病毒2 型和弓形蟲雙重PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

朱桓奕，羅亮，張璇，李照偉，浦同燦，王慧，曾紅，楊曉偉，劉霞，趙光偉

（1.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550008；3.貴陽市花溪區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合征、增生性壞死性間質(zhì)性肺炎、仔豬先天性震顫以及妊娠母豬生殖功能紊亂等多種病癥[1]，在我國不同規(guī)模的豬場均有感染[2-3]。剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii），簡稱弓形蟲，其終末宿主是貓，多種哺乳動物、鳥類、爬行動物以及人類是其中間宿主，可造成流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、胎兒先天畸形等[4]。鑒于PCV2 和弓形蟲導(dǎo)致的臨床癥狀往往不典型或不顯著，在豬場中時有混合感染的報道[5-6]，本試驗擬通過構(gòu)建雙重PCR 檢測方法，實現(xiàn)對PCV2 和弓形蟲的同步檢測，以期為實驗室病原的快速檢測以及養(yǎng)殖場的流行病學(xué)調(diào)查和綜合防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 感染PCV2、偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、弓形蟲（Toxoplasma gondii）RH 株速殖子的陽性病料，均由西南大學(xué)動物疾病診斷中心實驗室保存。

1.1.2 臨床樣本 采集四川省和重慶市22 個豬養(yǎng)殖場的血清、脾臟樣本，共63 份。

1.1.3 主要試劑 Easy Pure Viral DNA/RNA Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；rTaqDNA 聚合酶預(yù)混液、DL 2 000 DNA Marker，購自TaKaRa公司；HiScript ⅡSuperMix for qPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.4 引物 根據(jù)GenBank 中PCV2（登錄號OL438912.1）Cap基因保守序列和弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株（RH 株）529序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計2對特異性引物（表1），送至華大基因重慶分公司合成。

表1 特異性引物序列

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 按照Easy Pure Viral DNA/RNA Kit 操作說明書分別提取PCV2、PPV、PRV 陽性病料、弓形蟲RH 株速殖子和臨床樣本的DNA，PRRSV、CSFV 等陽性病料的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用紫外分光光度計測量核酸濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單一PCR 反應(yīng)退火溫度優(yōu)化 設(shè)置梯度退火溫度程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、梯度退火溫度（49、50、51、52、53、54、55 ℃）30 s、72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確定最佳退火溫度。

1.2.3 單一PCR 反應(yīng)引物濃度篩選 PCV2 和弓形蟲的原始引物濃度均為10.00 μmol/L，分別以ddH2O 進(jìn)行2 倍連續(xù)稀釋，共7 個稀釋度。以最佳退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，篩選最佳引物濃度。

1.2.4 單一PCR 反應(yīng)靈敏度試驗 經(jīng)測量，PCV2 的原始核酸質(zhì)量濃度為625.30 μg/mL，弓形蟲的原始核酸質(zhì)量濃度為467.00 μg/mL。分別以ddH2O 對2 種核酸模板進(jìn)行2 倍連續(xù)稀釋，共7 個稀釋度。以最佳退火溫度和最佳引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增，檢測單一方法的靈敏度。

1.2.5 雙重PCR 反應(yīng)體系建立 在單一PCR 反應(yīng)的基礎(chǔ)上，對雙重PCR 方法梯度退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、梯度退火溫度（52、53、54、55、56、57、58 ℃）30 s、72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。選擇擴(kuò)增效率最高的溫度作為最佳退火溫度。

1.2.6 雙重PCR 反應(yīng)靈敏性試驗 將PCV2 和弓形蟲核酸混合，用ddH2O 連續(xù)進(jìn)行2 倍稀釋，共5個梯度，檢測雙重PCR 方法的靈敏性。

1.2.7 雙重PCR 反應(yīng)特異性試驗 用優(yōu)化后的雙重PCR 體系及程序，分別以PCV2、弓形蟲、PPV、PRV、CSFV 和PRRSV 核酸為模板，進(jìn)行特異性試驗，檢驗雙重PCR 方法的特異性。

1.2.8 臨床樣本檢測 分別利用雙重PCR 方法和單一PCR 方法對來自四川省和重慶市22 個豬場的63 份臨床樣本進(jìn)行檢測，計算兩種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR 方法

2.1.1 退火溫度優(yōu)化 結(jié)果顯示，PCV2 在退火溫度49～55 ℃范圍內(nèi)均可被有效擴(kuò)增，在51～54 ℃時擴(kuò)增效率最佳（圖1-A）；弓形蟲退火溫度在49～53 ℃范圍內(nèi)均可被有效擴(kuò)增，在51～53 ℃范圍內(nèi)擴(kuò)增效率最佳（圖1-B）。

2.1.2 引物濃度篩選 結(jié)果顯示，PCV2 有效擴(kuò)增的引物濃度范圍為0.63～10.00 μmol/L，在2.50 μmol/L時擴(kuò)增效果最佳（圖2-A）；弓形蟲有效擴(kuò)增的引物濃度范圍為0.16～10.00 μmol/L，在0.31 μmol/L時擴(kuò)增效果最高且雜帶干擾較少（圖2-B）。

圖1 單一PCR 反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果

圖2 單一PCR 反應(yīng)引物濃度優(yōu)化結(jié)果

2.1.3 靈敏性試驗 結(jié)果顯示，PCV2 的最低檢測限為9.77 μg/mL（圖3-A），弓形蟲的最低檢測限為29.19 μg/mL（圖3-B）。

圖3 單一PCR 反應(yīng)靈敏性試驗結(jié)果

2.2 雙重PCR 方法

2.2.1 退火溫度優(yōu)化 結(jié)果（圖4）顯示，退火溫度在52～58 ℃范圍內(nèi)均能對PCV2 和弓形蟲進(jìn)行有效擴(kuò)增。結(jié)合單一PCR 擴(kuò)增時二者在不同退火溫度時的擴(kuò)增效率，將53 ℃作為雙重PCR 方法的最佳退火溫度。

2.2.2 靈敏性試驗 結(jié)果（圖5）顯示，雙重PCR 方法對PCV2 的最低檢測限為78.16 μg/mL，對弓形蟲的最低檢測限為29.19 μg/mL。

圖5 雙重PCR 方法靈敏性試驗結(jié)果

2.2.3 特異性試驗 分別以PCV2、弓形蟲、PRV、PPV、PRRSV、CSFV 核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖6）顯示，只有PCV2 和弓形蟲擴(kuò)增出大小為413 和529 bp 的目的條帶，其他病原均無條帶擴(kuò)增，說明該方法特異性良好。

圖6 雙重PCR 方法特異性試驗結(jié)果

2.3 臨床樣本檢測

利用建立的雙重PCR 方法和單一PCR 方法分別對來自四川省和重慶市的63 份臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，雙重PCR 方法共檢測出8 份PCV2陽性樣本，陽性率為12.7%，弓形蟲均為陰性；與單重PCR 方法完全一致，兩者的符合率為100%。

3 討論

多重PCR 反應(yīng)是在同一PCR 反應(yīng)體系里加入2 對及以上引物，可同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR 反應(yīng)。多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)被同時檢出，不僅大大節(jié)約了檢測所需時間，同時也節(jié)省了試劑，使檢測成本顯著下降，具備高效、經(jīng)濟(jì)簡便和準(zhǔn)確等優(yōu)點[7-8]，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床上多種病原的檢測。近幾年有關(guān)豬弓形蟲與PCV2 混合感染的報道不斷增加，因此本研究聚焦兩種生豬養(yǎng)殖中較為常見的病原建立雙重PCR 檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。引物的設(shè)計對多重PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增效率和特異性至關(guān)重要。在設(shè)計引物時，使PCV2 和弓形蟲二者的片段大小相差100 bp 以上，便于電泳時識別；同時將2 對引物的Tm 值設(shè)計的較為相近，也便于雙重PCR 方法的建立。

靈敏性試驗結(jié)果顯示，單一PCR 方法中PCV2 和弓形蟲的最低檢出限分別為9.77和29.19μg/mL，雙重PCR方法中分別為78.16和29.19μg/mL，雙重方法對PCV2的檢測靈敏度稍低，但在后續(xù)臨床樣本的檢測中，兩種方法的符合率為100%。主要原因是從臨床樣本中提取的核酸濃度往往較高，足以滿足擴(kuò)增需求，說明本試驗建立的雙重PCR 方法靈敏性能夠滿足臨床要求。特異性試驗結(jié)果顯示，雙重PCR 方法對PRV、PPV、PRRSV、CSFV 等病原均不會產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，說明特異性較好。臨床樣本檢測結(jié)果顯示，PCV2 在川渝地區(qū)部分豬場的感染率較高（陽性率12.7%），這與江地科等[9]報道的2016—2017 年四川省PCV2 的感染率相差不大（16.04%），而本次試驗未檢測到弓形蟲，可能是弓形蟲在上述區(qū)域的感染并不嚴(yán)重。

綜上所述，本研究建立了一種快速、特異、靈敏檢測PCV2 與弓形蟲的雙重PCR 檢測方法，為實驗室病原的快速確診以及養(yǎng)殖場的流行病學(xué)調(diào)查和綜合防控提供了技術(shù)支撐。