鴨星狀病毒3 型RT-RAA 快速檢測(cè)方法的建立

鄧春冉，張富友，尚佳靜，羅娟，于曉慧，蔣文明，劉華雷，王一新，劉冠慧，徐麗娜，李陽

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271018）

禽星狀病毒（avian astrovirus，AAstV）屬于星狀病毒科，包含多種亞型，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原之一。AAstV 是一種無囊膜的單股正鏈RNA 病毒，直徑25～35 nm，基因組全長(zhǎng)6.1～7.9 kb，包括5'端非編碼區(qū)、3 個(gè)開放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、3'端非編碼區(qū)和1 個(gè)多聚腺苷酸尾巴[1]。鴨星狀病毒（DAstV）是最早被發(fā)現(xiàn)的AAstV，早在1965 年研究人員就從患病毒性肝炎的鴨群中發(fā)現(xiàn)了DAstV。目前，已知的DAstV 基因型有4 種（DAstV-1～4）[2-4]，其中DAstV-3 是近年來在我國(guó)鴨群中感染率較高的星狀病毒，流行的范圍也越來越廣，可以引發(fā)鴨病毒性肝炎、產(chǎn)蛋下降等，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5]。

目前，對(duì)于DAstV-3 的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)RT-PCR、熒光RT-PCR 和血清學(xué)檢測(cè)等方法，但這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備要求較高，并不適用于DAstV-3 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技 術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA 聚合酶，在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的新技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR 檢測(cè)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于乙型腦炎病毒[6]、新型冠狀病毒[7]、雞滑液囊支原體[8]等病原體的快速檢測(cè)，在很大程度上為疫病防控提供了便利。本研究建立了一種DAstV-3 的RT-RAA 快速檢測(cè)方法，以期為該病原感染臨床快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RT-RAA 核酸擴(kuò)增試劑盒（熒光法），購自杭州眾測(cè)生物科技有限公司；一步法RT-PCR 試劑盒（HiScript High Fidelity One step RT-PCR Kit），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司；轉(zhuǎn)錄試劑盒（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7），購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；純化試劑盒（RNeasy Mini Kit），購自德國(guó)QIAGEN 有限公司；膠回收試劑盒，購自賽默飛世爾科技公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit 和Trans5α Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）股份有限公司；LB培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要儀器 RAA-B6100 恒溫振蕩混勻儀、RAA-F1620 恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，購自江蘇奇天基因生物科技有限公司；miniAmp PCR 儀、Nano Drop 核酸定量?jī)x，購自賽默飛世爾科技公司；渦旋振蕩器，購自上海沃元科技有限公司。

1.1.3 病毒及臨床樣本 DAstV、H9 亞型禽流感病毒（H9-AIV）、鵝星狀病毒（GoAstV）、新城疫病毒（NDV）、禽呼腸孤病毒（ARV）等，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離鑒定并保存。鴨拭子和組織樣品，采集自廣東、廣西、福建、湖南等地，共計(jì)166 份。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)DAstV-3 參考毒株CPH 株（GenBank：KJ020899）基因序列，利用Oligo 軟件設(shè)計(jì)探針和引物，序列詳見表1。所有引物及探針均由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2 cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品制備 以提取的DAstV-3 RNA 為模板，使用AAstV 通用引物（XZ-F/R）擴(kuò)增DAstV-3的RdRp基因，回收目的片段后連接到T 載體上，通過熱激將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中；篩選陽性單克隆菌落并進(jìn)行培養(yǎng)，使用SpeI 內(nèi)切酶對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行單酶切；使用膠回收試劑盒對(duì)酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行純化，選擇合適濃度的純化產(chǎn)物作為模板，使用T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再使用RNeasy Mini Kit 純化試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化，以除去體系中的雜蛋白和各種離子；使用Nano Drop 核酸定量?jī)x測(cè)量cRNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度，通過公式計(jì)算拷貝數(shù)，并將cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋至100copies/μL，-80 ℃保存。

表1 引物探針序列

1.2.3 RT-RAA 方法建立及優(yōu)化

1.2.3.1 引物篩選 以1.2.2 制備的cRNA 為模板，將表1 中的8 種上游引物和6 種下游引物分別進(jìn)行組合（共48 對(duì)），挑選起峰時(shí)間早、擴(kuò)增曲線斜率高的引物組合作為最佳引物對(duì)。按照熒光RT-RAA 擴(kuò)增試劑盒說明書配制反應(yīng)體系（表2），在含有凍干粉的反應(yīng)管中加入47.5 μL 上述混合液，在管蓋上加2.5 μL B-Buffer（280 mmol/L 乙酸鎂），小心蓋好蓋子，置于恒溫振蕩混勻儀中振蕩混勻，再轉(zhuǎn)移到恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀中，39 ℃反應(yīng)20 min。

表2 RT-RAA 反應(yīng)體系

1.2.3.2 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系優(yōu)化 對(duì)RT-RAA的反應(yīng)溫度、引物探針用量等參數(shù)設(shè)置梯度，分別設(shè)置反應(yīng)溫度為37、39、41 ℃，引物用量為2.0、1.6、1.2、0.8 μL，探針用量為0.6、0.4、0.2 μL。對(duì)比不同條件下的熒光擴(kuò)增曲線斜率，確定最佳反應(yīng)條件，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.3.3 特異性試驗(yàn) 使用優(yōu)化的RT-RAA 方法，分別對(duì)DAstV-3、H9-AIV、GoAstV、NDV、ARV等常見禽病毒進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.3.4 靈敏性試驗(yàn) 以拷貝數(shù)濃度為106～100copies/μL 的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用建立的RT-RAA 方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定模板的最低檢出量，從而確定該方法的靈敏性。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 以106～100copies/μL 拷貝數(shù)濃度的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板，RNase-free water為陰性對(duì)照，利用優(yōu)化的熒光RT-RAA 方法進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置8 個(gè)重復(fù)，并統(tǒng)計(jì)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法同時(shí)對(duì)采集的166 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的臨床適用性。

2 結(jié)果

2.1 RT-RAA 反應(yīng)體系建立

2.1.1 引物篩選 選擇起峰時(shí)間早、擴(kuò)增曲線斜率高的引物為最佳組合。從48 對(duì)引物中挑選7 對(duì)引物組合作圖。結(jié)果（圖1）顯示：F8/R1 組合擴(kuò)增效果最好，因此選用此組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 部分引物篩選結(jié)果

2.1.2 反應(yīng)體系優(yōu)化 分別選擇不同反應(yīng)溫度（37、39、41 ℃）、不同引物用量（2.0、1.6、1.2、0.8 μL）和不同探針用量（0.6、0.4、0.2 μL）進(jìn)行RT-RAA 試驗(yàn)，對(duì)比不同條件下的熒光擴(kuò)增曲線斜率。結(jié)果顯示：3 種探針用量對(duì)RT-RAA擴(kuò)增結(jié)果影響不大（圖2）；引物用量為2.0 μL和1.6 μL 時(shí)，RT-RAA 的擴(kuò)增結(jié)果更好（圖3）；3 種反應(yīng)溫度對(duì)RT-RAA 擴(kuò)增結(jié)果影響不大（圖4～6）。綜合考慮試劑盒說明書要求和試驗(yàn)成本，最終確定引物用量為2.0 μL，探針用量為0.4 μL，反應(yīng)溫度為39 ℃。

圖2 不同探針用量下RT-RAA 反應(yīng)結(jié)果

圖3 不同引物用量下RT-RAA 反應(yīng)結(jié)果

圖4 37 ℃條件下RT-RAA 反應(yīng)結(jié)果

圖5 39 ℃條件下RT-RAA 反應(yīng)結(jié)果

圖6 41 ℃條件下RT-RAA 反應(yīng)結(jié)果

2.1.3 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化的RT-RAA 方法分別對(duì)DAstV-3、GoAstV、H9-AIV、NDV、ARV 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示：只有DAstV-3 出現(xiàn)特異性熒光擴(kuò)增曲線，其他病毒均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。

圖7 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 靈敏性試驗(yàn) 以10 倍倍比稀釋的cRNA為模板，利用優(yōu)化的RT-RAA 反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖8）顯示：建立的RT-RAA 方法最低檢測(cè)限為101copies/μL。

圖8 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 使用建立的RT-RAA 方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：以106～103copies/μL 的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板，8 次檢測(cè)均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；以102copies/μL 的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí)，8 次檢測(cè)中有6 次出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；以101copies/μL 的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí)，8 次檢測(cè)中有3 次出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；以100copies/μL 的cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí)，8 次檢測(cè)均為陰性。

2.2 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法分別對(duì)166 份臨床樣品進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示：RT-RAA 方法檢測(cè)到40 份陽性樣品，RT-PCR 檢測(cè)到22 份陽性樣品，其中兩種方法均檢測(cè)為陽性的樣品有22 份。為驗(yàn)證RT-RAA 方法的準(zhǔn)確性，對(duì)RT-RAA 結(jié)果陽性但RT-PCR 結(jié)果陰性的樣品進(jìn)行測(cè)序鑒定，證實(shí)均為DAstV-3。結(jié)果表明，RT-RAA 方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有更高的陽性檢出率。

表3 RT-RAA 和RT-PCR 方法臨床樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)單位：份

3 討論

AAstV 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要病原，既可通過水平和垂直傳播，也可跨物種傳播，除可感染雞、火雞、鴨等禽類外，也可感染哺乳動(dòng)物[10]，導(dǎo)致AAstV 感染的診斷與防控難度日益增大。作為一種潛在的人獸共患病毒，AAstV 對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[11]。DAstV-3 在我國(guó)最早于2014年被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，其傳播速度快，分布范圍廣，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的DAstV-3 檢測(cè)方法主要有病毒分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測(cè)、電子顯微鏡（EM）觀察等[13]，但鑒于DAstV-3 的分離培養(yǎng)較為困難，常規(guī)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且操作復(fù)雜，電子顯微鏡對(duì)儀器設(shè)備要求較高等原因，以上方法均無法滿足DAstV-3 的快速和大規(guī)模檢測(cè)需求。因此，開發(fā)一種快速、特異、靈敏、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

RAA 技術(shù)是近年來快速發(fā)展的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用大腸桿菌酶將模板核酸鏈解螺旋后，在重組酶、聚合酶作用下對(duì)模板核酸進(jìn)行重組和特異性擴(kuò)增。恒溫條件下，RAA 技術(shù)在20～30 min 內(nèi)即可完成核酸快速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、成本低、耗時(shí)短及結(jié)果判讀簡(jiǎn)單直觀等優(yōu)勢(shì)，已在多種動(dòng)物病原檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，具有廣闊的發(fā)展前景。DAstV-3 作為新發(fā)病原，目前尚未見RT-RAA 檢測(cè)方法的報(bào)道。在此背景下，本研究建立了一種基于熒光探針的DAstV-3 RT-RAA 快速檢測(cè)方法。

DAstV-3的RdRp基因編碼病毒核糖核酸聚合酶，該基因序列在不同DAstV-3 毒株中較為保守。本試驗(yàn)首先分析了GenBank 中登錄的DAstV-3RdRp序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物及探針，驗(yàn)證確定最佳引物后，對(duì)該方法的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其靈敏度、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的熒光RT-RAA檢測(cè)方法僅需20 min 即可完成樣品的快速檢測(cè)，與常見的禽病毒無交叉反應(yīng)，其最低檢測(cè)限可達(dá)101copies/μL。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的臨床應(yīng)用效果，采用該方法檢測(cè)166 份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)熒光RT-RAA 方法的陽性檢出率高于常規(guī)RT-PCR 方法。同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果也提示，DAstV-3 在我國(guó)鴨群中感染率可能較高，需要持續(xù)關(guān)注該病毒的流行及其帶來的危害。

綜上，本研究建立了一種DAstV-3 RT-RAA 快速檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，為開展DAstV-3 的快速檢測(cè)及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了可靠的技術(shù)支撐，具有良好的應(yīng)用前景。