金黃色葡萄球菌致兒童皮膚軟組織感染90 例病原菌耐藥性和分子分型

石迎迎， 潘 芬， 杜青青， 王 春， 蔣 婕， 于方圓， 余紹兵， 孫 燕， 秦惠宏， 張 泓

作者單位：上海交通大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科，上海 200040。

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染常見的病原菌之一，其感染可導致多種類型的疾病，包括皮膚和皮膚結構感染、敗血癥、心內膜炎及肺炎等[1]。金葡菌引起兒童感染的發(fā)病率逐年升高，自1996—2006 年，美國每十萬名兒童中，每年約有69.9 人次因皮膚和皮膚結構感染入院，其中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染占9.6%，且其住院率顯著上升[2]。全國細菌耐藥監(jiān)測網（CARSS）報道金葡菌位列膿液標本分離菌的首位。近年來，我國兒童患者金葡菌的總體檢出率呈逐年上升趨勢，因此，加強兒童人群金葡菌分子流行學研究顯得尤為重要。本組資料以上海市兒童醫(yī)院2020 年90 例金葡菌（經膿液樣本中分離）皮膚軟組織感染患兒為研究對象，對病例臨床特征資料進行收集整理，并對菌株耐藥性、毒力基因、分子分型進行檢測，以分析皮膚軟組織感染患兒金葡菌的臨床特征、耐藥情況、毒力基因攜帶率以及克隆分布及變化趨勢，并比較MRSA 組和甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）組分離株間的分子特征差異。

1 材料與方法

1.1 菌株來源、鑒定及藥敏

收集2020 年我院90 例皮膚軟組織感染患兒臨床信息，以及從患兒膿液標本中初次分離到的金葡菌，共90 株。使用自動化MALDI-TOF 質譜儀（Bruker，德國）鑒定菌株到種，采用肉湯微量稀釋法進行藥物敏感性試驗，替加環(huán)素藥敏結果判讀參考美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）標準，其余結果判斷采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2020 年標準[3]。以金葡菌ATCC 25923 和ATCC 29213 為質控菌株。

1.2 DNA 提取及MRSA 的檢測和確認

采用離心柱型細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技公司）提取細菌DNA，嚴格按試劑盒說明書進行操作；經藥敏結果初步篩選，再通過PCR 方法擴增mecA基因[4]， PCR 擴增陽性的菌株確認為MRSA，陰性菌株確認為MSSA。本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 毒力基因檢測

采用PCR 方法檢測菌株的15 種毒力基因[5-8]，包括6 種腸毒素基因（sea、seb、sec、sed、seg及sei）、4 種黏附毒素基因（icaA、sdrD、sdrE及clfA）、2 種溶血素基因（hla及hlb）、殺白細胞毒素基因pvl、中毒性休克綜合征毒素基因tst、表皮剝脫毒素基因eta。

1.4 金葡菌的分子分型

1.4.1 多位點序列分型（MLST） 根據參考文獻合成7 個管家基因（arcC、aroE、glKF、gmk、pta、tpi、yqiL）的引物序列[9]， 分別對菌株DNA進行PCR 擴增后，將所得產物送上海生工公司測序，測序結果提交至MLST 網站（https://pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus）得到序列型（ST）。使用PHYLOViZ 2.0 軟件對ST 型進行聚類分析定義克隆復合群（CC）。

1.4.2 葡萄球菌A 蛋白序列分析 對金葡菌spa基因多態(tài)X 區(qū)進行PCR 擴增[10]并測序，序列提交至金葡菌A 蛋白序列（SPA）分型數(shù)據庫（https://spa.ridom.de/）比對確定SPA 分型。

1.4.3 葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）分型 采用多重PCR 方法對MRSA 分離株的SCCmec進行Ⅰ～Ⅴ的分類[11-13]，擴增產物送測序并通過BLAST 網站比對序列加以確認。引物序列見表1。

表1 金黃色葡萄球菌SCCmec 分型基因引物序列Table 1 Sequences of the primers for SCCmec genotyping of Staphylococcus aureus

1.5 統(tǒng)計方法

本研究采用軟件IBM SPSS 21.0 進行統(tǒng)計學分析。對計數(shù)資料根據適用條件使用卡方（χ2）檢驗。對于計量資料分析采用獨立樣本t檢驗。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據，采用非參數(shù)檢驗分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌株分布

對90 例分離金葡菌的皮膚軟組織感染患兒病例資料進行分析整理， 男51 例（56.7%），女39 例（43.3%）。年齡分布情況，小于28 d 的新生兒19例（21.1%），28 d～＜3 歲的嬰幼兒39 例（43.3%），3～＜6 歲學齡前兒童7 例（7.8%），≥6 歲的學齡期兒童25 例（27.8%）。分離的金葡菌中MRSA 44 株，主要包括臍部皮膚軟組織感染分離17 株（38.6%），其次是手部皮膚軟組織感染分離6 株（13.6%）。MSSA 46 株，其中頸部皮膚軟組織感染分離9 株（19.6%），其次是手部和耳前瘺管分離各6 株（13.6%）。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌所致兒童皮膚軟組織感染90 例的相關臨床信息Table 2 Clinical details of skin and soft tissue infections caused by Staphylococcus aureus in 90 children

表2（續(xù)）Table 2（continued）

2.2 菌株耐藥率

90 株金葡菌中MRSA 對青霉素的耐藥率為100%。未發(fā)現(xiàn)對利福平、利奈唑胺、萬古霉素、米諾環(huán)素及替加環(huán)素耐藥菌株。見表3。

表3 皮膚軟組織感染患兒分離的90 株金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的敏感性Table 3 Antimicrobial susceptibility of 90 strains of Staphylococcus aureus isolated from skin and soft tissue infections in children

2.3 葡萄球菌相關毒力基因

在腸毒素基因sea、seb、sec、sed、seg和sei6 個基因中以sei腸毒素基因的檢出率最高，為66.7%（60/90）。

icaA、sdrD、sdrE和clfA等4 個黏附毒素基因均有較高的檢出率。sdrD的檢出率為66.7%（60/90），sdrE為92.2%（83/90），icaA和clfA檢出率均為100%。大多菌株為多種黏附毒素基因攜帶株，如同時攜帶有icaA-clfA-sdrD-sdrE4 種基因的菌株達61.1%（55/90）。

溶血素基因中hla檢出率高，達100%；hlb的檢出率較hla低，為32.2%（29/90）。殺白細胞毒素基因pvl有較高檢出率，為58.9%（53/90）。中毒性休克綜合征毒素基因tst檢出率低，僅15.6%（14/90）。表皮剝脫毒素基因eta檢出率更低，僅2.2%（2/90）。

各組毒素基因在MRSA 和MSSA 中的檢出結果見表4，其中MSSA 組和MRSA 株均檢出殺白細胞毒素基因pvl，且pvl檢出率MSSA 高于MRSA；此外黏附毒素基因聯(lián)合攜帶率以及溶血毒素基因聯(lián)合攜帶率在MSSA 組亦均顯著高于MRSA組，但MRSA 組的seb腸毒素基因檢出率顯著高于MSSA 組；腸毒素基因sec-seg-sei和sec-seg聯(lián)合攜帶情況，MRSA 組亦均顯著高于MSSA 組。

表4 MRSA 組與MSSA 組毒素基因攜帶率分析Table 4 Analysis of virulence gene carrying rate in MRSA group and MSSA group

2.4 金葡菌MLST、SPA 和SCCmec 分子分型

2.4.1 金葡菌MLST 90 株兒童皮膚軟組織感染金葡菌主要的MLST 分型為ST22（46.7 %，42/90）、ST59（18.9 %，17/90）、以及其他各種ST1、ST15 等型共16 個型。

2.4.2 SPA 分型 90 株兒童皮膚軟組織感染金葡菌SPA 分 型 主 要 為t309（20.0 %， 18/90）、t437（16.7 %，15/90）、以及其他各種t005、t015 等共36 型。

2.4.3 金葡菌SCCmec分型 主要涉及44 株MRSA，主要為Ⅳ型和Ⅴ型，各占31.8%（14/44）和61.4%（27/44）,其他有2 株Ⅰ型和1 株Ⅲ型。見表5。

表5 兒童皮膚軟組織感染MRSA 的分子分型Table 5 Molecular typing of MRSA isolated from skin and soft tissue infections in children

綜 合MLST、SPA 和SCCmec分 型 在 兒 童皮膚軟組織感染MRSA 組中，最常見的流行株為ST22-t437 型， 占18.2%（8/44）；ST22-t437-SCCmecⅤ、ST22-t309-SCCmecⅤ均占9.1%，是MRSA 分離株最常見的克隆型；ST22-t437 型僅存在于MRSA 組。MSSA 組中最常見的流行株為ST22-t309 型和ST59-t309 型，均占15.2%（7/46）。ST59-t309 型僅存在于MSSA 組，ST22-t309（11/90）型是兒童皮膚軟組織感染中最常見的流行株。

3 討論

兒童是皮膚和皮膚結構感染患者中的主要群體之一，且復發(fā)率超過50%[14]。本組資料分離的90 株金葡菌中MRSA 株為44 株，MSSA 株為46 株。如同既往報道，本組的MRSA 對抗菌藥物的耐藥率顯著高于MSSA 菌株。故當金葡菌引起感染時需要盡快明確是MRSA 還是MSSA，為臨床用藥提供依據。本組資料MRSA 分離部位占比最高的為臍部皮膚軟組織，雖然按照MRSA 治療原則，不宜使用β 內酰胺類抗生素。但本研究對象均為兒童，且以新生兒臍部皮膚及皮膚結構感染為主，在無基礎疾病的前提下可以使用β 內酰胺類抗生素聯(lián)合外科清創(chuàng)換藥，臨床治療效果以及結局良好，僅在合并基礎疾病時考慮直接使用萬古霉素或利奈唑胺等糖肽類抗生素。此種治療與何禮賢[15]闡述的社區(qū)獲得性MRSA 所致皮膚軟組織感染輕者僅需外科處理，而不需要系統(tǒng)性藥物治療相一致。

本組資料6 類毒素基因的檢出率大多與文獻報道的相一致。如MRSA 組與MSSA 組中腸毒素基因以sei基因檢出率最高（59.1%和73.9%），與劉金月[16]發(fā)現(xiàn)的骨髓炎患者MSSA 組sei基因檢出率最高（46.67%）相一致。兩組中黏附毒素基因的檢出率≥50%，且大多是兩種或以上的毒素基因同時存在，如ica-clfA基因的檢出率為100%，此研究結果與Park 等[17]研究結果一致；提示金葡菌菌株的黏附能力均較強，推測可能是造成皮膚軟組織感染反復，細菌難以清除等的主要因素。MRSA 組與MSSA 組中溶血素基因hla基因的檢出率均為100%，提示其在金葡菌中具有高攜帶率，此研究結果與儲丹丹[18]研究結果相近。MRSA 組與MSSA 組兩種溶血素基因hla-hlb的同時攜帶率分別為52.27%與13.04%，MRSA 組攜帶率顯著高于MSSA 組（P＜0.05），提示溶血素毒素在兒童皮膚軟組織感染MRSA 中具有重要的致病作用。表皮剝脫毒素基因eta在MSSA 組中未檢出，在MRSA 組檢出率也普遍較低，僅為4.5%，與Koosha 等[19]研究結果較一致，分離自皮膚創(chuàng)口創(chuàng)面分泌物的金葡菌eta基因攜帶率僅為7.6%。提示皮膚軟組織感染及傷口分泌物中金葡菌的eta基因處于低攜帶率。MRSA 組與MSSA組中icaA基因的檢出率均為100%，sdrE基因在兩組間的檢出率較高（95.5%和89.1%）；seg基因檢出率與Kim 等[20]報道的關節(jié)假體金葡菌seg基因檢出率不一致，提示皮膚淺表與深層分離到金葡菌的毒力基因攜帶情況不同。sea基因在兩組中的檢出率分別為23.3%和17.6%，此研究結果顯著低于羅寒梅等[21]關于成年人痰液標本MRSA組63.33%的檢出率。MSSA 組未檢測到seb基因，MRSA 組seb基因檢出率為20.5%，然而此檢出率卻明顯低于儲丹丹[18]報道的云南省某三甲醫(yī)院MRSA 組菌株seb基因的檢出率（76.92%）。本組資料中sea基因與seb基因的攜帶情況均低于以上兩位學者的報道，推測與研究人群、標本來源部位以及地域不同相關。MRSA 組與MSSA 組中殺白細胞毒素基因pvl的檢出率均較高，分別為50.0%和67.4%。此研究結論高于儲丹丹[18]關于云南省的調研結果（33.85%），與海南Li 等[22]的研究結果較一致（47.6%），提示MRSA 菌株pvl基因攜帶率具有顯著的地域性差異。

本資料MRSA 組共檢出了15 個葡萄球菌A蛋白SPA 型別的序列，其中主要型別t437 占比為34.1%，此結果與大多數(shù)學者的研究結果一致[23-24]。MRSA 組的次要型別為t309 及t005，其占比分別為18.2%及9.1%，儲丹丹[18]探究云南省MRSA菌株的SPA 分型情況，研究結果顯示其次要型別為t030 及t034，占比分別為21.54%及7.69%，張杰[23]探究江西地區(qū)皮膚及皮膚結構感染患者MRSA 菌株的SPA 分型情況，結果顯示其次要型別為t114，占比為10%，提示MRSA 菌株SPA 分型的次要型別存在明顯的地域性差異和/或標本差異。

文獻報道ST22 型菌株具有極強的傳播能力和較大的毒性。Baldan 等[25]研究發(fā)現(xiàn)ST22-Ⅳ在體外能有效侵入細胞，體內致病性顯著性升高。同時pvl陽性曾被認為是社區(qū)感染MRSA 檢出的重要特征[26]。但在多年前pvl陽性菌株國內檢出率極低[27]。本組資料顯示引起90 例皮膚和皮膚結構感染最為常見的金葡菌菌株為ST22 型，此與Xiao 等[28]2019 年報道的北京地區(qū)皮膚與皮膚結構感染患者的金葡菌MLST 結果為ST22 型相同。90 株金葡菌中MLST ST22 型菌株共有42 株（46.7%42/90），MRSA 和MSSA 各 半， 均 為21 株。ST398 型僅有4 株，且均為MRSA 菌株。綜合SPA 分型及pvl檢測，本組資料顯示ST22-t309 菌株（12.2%，11/90）為本次皮膚軟組織感染患兒最常見的流行株。在21 株ST22 型的MSSA 中竟無一株t437 株，但有7 株ST22-t309（15.2%）和7 株為ST59-t309（15.2%）。無論是44 株MRSA或46 株MSSA 中均檢出多株pvl陽性株，檢出率分別是50%和67.4%。這與Xiao 等[28]2019 年報道的研究結果pvl50%的陽性檢出率大致相仿。本組資料顯示pvl陽性MRSA 主要為ST22-t437、ST15-t437、ST7-t437 和ST22-t309；在MSSA 中pvl陽性主要型別為ST22-t309 及ST59-t309。PVL是金葡菌的關鍵毒力因子，主要與皮膚或黏膜壞死病變相關。

因此，本組資料可以為臨床醫(yī)師治療兒童皮膚和皮膚結構感染提供基礎性數(shù)據，警惕可能因ST22 型等菌株流行導致的暴發(fā)性感染，提前做好預防措施。已經有研究報道1 種新型的殺白細胞毒素基因pvl陽性ST22 型MRSA 菌株在日本引起了長期的家族型感染[29]。因此，這種菌株的出現(xiàn)切不可掉以輕心，需引起重視。