HAdV-7感染誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡

楊中英，魏建華，任 洛，陳詩(shī)懿，劉恩梅，臧 娜

400014 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科，國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育與疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 兒童感染免疫重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

人腺病毒(human adenovirus，HAdV)是引起兒童重癥肺炎的最重要的病毒病原之一[1]，感染后易并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征[2]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[3-4]等急性危重疾病，致死率達(dá) 50%以上[5]，嚴(yán)重危害兒童生命健康。目前，人腺病毒已發(fā)現(xiàn)至少 100個(gè)基因型(http://hadvwg.gmu.edu/)，分為7個(gè)亞屬(A～G)。其中，HAdV-7是引起全球范圍內(nèi)兒童重癥腺病毒肺炎最常見(jiàn)的基因型[5-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在急性呼吸道感染患兒中B亞屬HAdV-7 檢出率約 45%，其中 31.3%患兒發(fā)生重癥肺炎，27.5%并發(fā)呼吸衰竭[8]。然而，臨床上缺乏特異性的抗腺病毒藥物，且HAdV-7 感染引起嚴(yán)重肺損傷的分子機(jī)制尚不清楚。而肺泡上皮細(xì)胞是外界環(huán)境與肺組織的界面，在屏障保護(hù)、產(chǎn)生黏液和表面活性劑、啟動(dòng)免疫反應(yīng)、肺損傷及修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[9-11]。由于HAdV-7通過(guò)空氣傳播，肺泡上皮細(xì)胞很容易受到感染而成為HAdV-7主要的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。肺泡上皮細(xì)胞的活性對(duì)維持肺泡結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，其正?；钚詥适Ш凸δ芪蓙y是急性肺損傷發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素[12]。已有研究顯示，肺泡上皮細(xì)胞的凋亡、壞死性凋亡等多種死亡方式參與了流感病毒感染、脂多糖等引起的肺損傷[13-16]。鐵死亡(ferroptosis)是一種全新的可調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡形式，其實(shí)質(zhì)是大量鐵累積和脂質(zhì)過(guò)氧化[17]。鐵死亡已被證實(shí)參與了多種急慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，抑制鐵死亡逐漸成為多種疾病治療和干預(yù)的重要靶點(diǎn)[18-21]。然而，HAdV 感染所致肺損傷中肺泡上皮細(xì)胞死亡啟動(dòng)方式和作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討HAdV-7感染是否導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞鐵累積、脂質(zhì)氧化物增加，并誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，初步明確鐵死亡參與HAdV-7感染所致肺損傷的過(guò)程，以期為臨床治療重癥腺病毒感染提供一種新的思路和干預(yù)途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腫瘤性肺泡上皮細(xì)胞(A549)和正常人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(HPAEpiC)均購(gòu)自ATCC，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所兒童呼吸病學(xué)研究室穩(wěn)定傳代后保存提供。CD46人源化小鼠設(shè)計(jì)和繁殖購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。氯化銫購(gòu)自默克公司，氯化銫離心柱購(gòu)自伯樂(lè)(Bio-Rad)公司。CCK-8 試劑盒、Deferoxamine(DFO)、Ferrostatin-1(Fer-1)和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的探針(H2DCFDA)均購(gòu)自MCE公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司。電鏡專(zhuān)用 戊二醛固定液(2.5%)和胞內(nèi)亞鐵離子熒光探針FerroOrange分別購(gòu)自森貝伽生物科技和東仁化學(xué)科技公司， RNA快速提取試劑盒購(gòu)自奕杉生物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物公司。全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司，一抗稀釋液、快速轉(zhuǎn)膜液及快速封閉液均購(gòu)自新賽美公司。預(yù)制膠和MOPS-SDS Running Buffer購(gòu)自ACE公司。一抗Anti-xCT rabbit antibody 購(gòu)自Abcam公司，Anti-GPX4 rabbit antibody、Western blot二抗(山羊抗兔)和直標(biāo)內(nèi)參GAPDH、β-actin購(gòu)自成都正能生物公司，超敏ECL發(fā)光液購(gòu)自美倫生物公司。普魯士藍(lán)染色液(DAB增強(qiáng)法)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 病毒分離與純化

從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科1名確診腺病毒感染的住院患兒的鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates, NPAs)中分離HAdV-7(CQ45), 體外培養(yǎng)擴(kuò)增，采用氯化銫密度梯度離心法純化病毒[22]，按照FU等[5]和CHIKHALYA等[23]的計(jì)算方法，最終得到的病毒濃度為3×1011vp/mL。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549和HPAEpiC細(xì)胞在添加10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，做傳代和鋪板等處理。如進(jìn)行病毒感染，則使用含2%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行感染后的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞均放置于37 ℃、5% CO2的孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以2 000個(gè)/孔，100 μL/孔的培養(yǎng)基鋪96孔板。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%，將腺病毒按10感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)感染細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DFO工作濃度為50 μmol/L)，在各時(shí)間點(diǎn)向每孔加入含10% CCK-8 溶液的培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5～2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的光密度值。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%；As:實(shí)驗(yàn)孔光密度值(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和腺病毒處理)；Ac:對(duì)照孔光密度值(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，無(wú)腺病毒)；Ab:空白孔吸光度值(含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞和腺病毒)。

1.5 透射電鏡觀察細(xì)胞的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)

按3 ×105/孔接種細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)24 h后，以10 MOI感染A549和HPAEpiC細(xì)胞, 感染后48 h觀察到細(xì)胞發(fā)生腺病毒感染的典型病變后才用胰酶消化并收集于離心管中，1 000 r/min，5 min離心。然后棄去上清液，用吸管沿管壁緩慢加入1∶5(2.5%戊二醛∶0.01 mol/L PBS緩沖液)稀釋的固定液，重懸細(xì)胞。4 ℃，靜置5 min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL尖底離心管中，12 000 r/min離心10 min，輕輕棄去上清液，高速離心后的樣品體積不小于半顆綠豆大小。用吸管沿管壁緩慢加入2.5% 戊二醛固定液，放置于4 ℃環(huán)境中，用裝有冰袋的泡沫盒運(yùn)送至成都里來(lái)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行投射電鏡掃描。

1.6 ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞按照3×105/孔接種于6孔板，24 h后以10 MOI HAdV-7病毒感染細(xì)胞，感染后48 h,對(duì)照組和腺病毒感染組均添加含H2DCFDA (終濃度10 μmol/L)的培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min。然后用0.05%胰蛋白酶消化，含2%胎牛血清培養(yǎng)基中和后收集，2 500 r/min離心5 min。最后重懸于新鮮培養(yǎng)基中，立即用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 MDA水平檢測(cè)

首先配制TBA儲(chǔ)存液：25 mg TBA用6.76 mL TBA配制液配制，最終濃度即為0.37%。金屬浴加熱到70 ℃，再劇烈震蕩以促進(jìn)溶解。然后配制MDA檢測(cè)工作液: 根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的MDA檢測(cè)工作液(一次加樣量：150 μL TBA稀釋液，50 μL TBA儲(chǔ)存液，3 μL抗氧化劑)。再取適量標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至1、2、5、10、20、50 μmol/L，于各1.5 mL離心管中加入0.1 mL稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，隨后加入0.2 mL MDA檢測(cè)工作液?；靹蚝?，99 ℃金屬浴加熱15 min后，水浴冷卻至室溫，1 000×g室溫離心10 min。取200 μL上清加入到96孔板中，酶標(biāo)儀在532 nm測(cè)定吸光度。通過(guò)標(biāo)曲計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量后，以單位重量的蛋白含量(BCA法)來(lái)表示最初樣品中的MDA含量(μmol/mg)。

1.8 細(xì)胞二價(jià)鐵離子檢測(cè)

HPAEpiC細(xì)胞以1×105/mL接種在35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。HAdV-7以10 MOI感染48 h后,將含有FerroOrange (1 μmol/L) 的HBSS溶液添加到細(xì)胞中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.9 細(xì)胞總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照奕杉生物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總的RNA, 使用Nano Drop one超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取的RNA濃度，然后以1 000 ng總量按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用CFX96 Touch熒光定量PCR儀 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參， 2-ΔΔCt法分析各目的基因 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。具體的引物序列見(jiàn)表1。

表1 各目的基因及內(nèi)參基因序列

1.10 細(xì)胞蛋白提取及Western blot檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞(3×105/孔)鋪于6孔板，感染HAdV-7后24、48、72 h后，用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，并以 BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組總蛋白濃度。蛋白質(zhì)在4%～20% 預(yù)制膠濃縮分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，快速封閉液封閉15 min后，孵育一抗(GPX4，1∶5 000；xCT，1∶2 000)于 4 ℃過(guò)夜，取出膜以 1×TBST 洗脫后，室溫孵育二抗(GAPDH，1∶10 000)，使用化學(xué)發(fā)光(ECL)法獲得蛋白條帶,用于比較分析。

1.11 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.11.1 腺病毒感染動(dòng)物模型建立 將6～8周齡的12只CD46人源化小鼠[賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司]按完全隨機(jī)分組分為對(duì)照組(Control)、腺病毒感染組(HAdV-7)、鐵死亡抑制劑組(Fer-1)和鐵死亡抑制劑預(yù)處理后腺病毒感染組(HAdV-7+Fer-1)。稱(chēng)量小鼠質(zhì)量后，F(xiàn)er-1組和HAdV-7+Fer-1組腹腔注射Fer-1(10 mg/kg)，1 h后予以10%水合氯醛溶液3～5 μL/g腹腔注射麻醉小鼠，HAdV-7組和HAdV-7+Fer-1組予以80 μL (20 μL/次×4次)含3×1011vp/mL病毒工作液滴鼻接毒，Control組和Fer-1組則以同等體積的病毒液溶劑滴鼻。

1.11.2 肺組織石蠟切片制備及HE染色 感染3 d后，10%水合氯醛溶液麻醉處死小鼠，摘取眼球取血后取出上述實(shí)驗(yàn)小鼠左肺組織放入的4%多聚甲醛中，固定24 h以上。脫水后以肺門(mén)朝下將肺組織包埋成組織蠟塊，4 μm切片，然后進(jìn)行肺組織HE染色，封片后于顯微鏡下采集圖像。

1.11.3 肺組織普魯士藍(lán)染色 石蠟切片脫蠟至水(同肺組織HE染色), 按照 1∶1 的比例配置 Perls 染色工作液，滴加到切片上至完全覆蓋組織，濕盒內(nèi) 37 ℃孵育 20 min后，蒸餾水輕輕沖洗3次，每次10 s。按照 1∶9 配置孵育工作液，覆蓋組織后盒內(nèi) 37 ℃孵育 10～20 min；1×PBS 輕輕浸洗3次，每次1 min。按照19∶1 的比例配置增強(qiáng)工作液,滴加至完全覆蓋組織，置于濕盒內(nèi) 37 ℃孵育 10～20 min，再1×PBS 輕輕浸洗3次，每次 5 s，滴加復(fù)染液染色 3～5 min，蒸餾水浸洗10 min。最后，脫水封片(同HE染色)。

1.11.4 肺組織蛋白提取及Western blot檢測(cè) 稱(chēng)取適量的肺組織按照凱基生物的全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提蛋白，根據(jù)標(biāo)本數(shù)以1 mL∶5 μL∶5 μL∶1 μL的比例依次取Lysis Buffer、磷酸酶抑制劑、100 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑配置蛋白裂解液。每個(gè)肺組織標(biāo)本中按0.1 g/1 mL蛋白裂解液,電動(dòng)勻漿器研磨肺組織(冰上低溫操作)，然后冰水中超聲5 min×2次后，4 ℃，14 000 r/min，離心20 min，取上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管。使用賽默飛NanoDrop one超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取的蛋白濃度，以計(jì)算蛋白上樣量。根據(jù)蛋白液加入5×loading buffer，離心、震蕩、離心混勻，99 ℃加熱10 min后瞬時(shí)離心，分裝后保存于-80 ℃冰箱。Western blot步驟同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.11.5 肺組織炎癥病理評(píng)分 光學(xué)顯微鏡下，主要評(píng)估氣管、細(xì)支氣管、血管周?chē)胺伍g質(zhì)的炎癥，炎癥病理評(píng)分參照DENG等[24]使用的方法，采用0～3分制，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 肺組織炎癥病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.11.6 肺組織損傷評(píng)分 根據(jù)HONG等[25]和TANAKA等[26]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用0～4分制，平均得分為肺損傷病理評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HAdV-7感染對(duì)肺泡上皮細(xì)胞活性的影響

采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，結(jié)果顯示，HAdV-7感染A549和HPAEpiC細(xì)胞后24、48、72 h，兩種細(xì)胞的細(xì)胞活性均明顯降低，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性降低更明顯(圖1)。

2.2 HAdV-7感染肺泡上皮細(xì)胞后細(xì)胞線(xiàn)粒體改變

透射電鏡下觀察，HAdV-7感染A549和HPAEpiC細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，感染組的線(xiàn)粒體體積變小，嵴減少甚至消失,外膜破裂，出現(xiàn)了鐵死亡特征性形態(tài)改變(圖2),提示HAdV-7感染可能誘導(dǎo)了肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡。

圖2 透射電鏡觀察HAdV-7感染前后肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)

2.3 HAdV-7感染肺泡上皮細(xì)胞后ROS和MDA水平

HAdV-7感染A549細(xì)胞后，ROS水平較對(duì)照組升高，感染后48 h和72 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3A)。ROS化學(xué)性質(zhì)活潑，極易攻擊胞膜、核酸、蛋白質(zhì)等多種細(xì)胞成分，對(duì)細(xì)胞造成致命損傷，ROS與細(xì)胞膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA)。HAdV-7感染A549細(xì)胞后48 h, MDA水平顯著增加(P<0.05，圖3C)。在HPAEpiC細(xì)胞中，HAdV-7感染同樣增加了胞內(nèi)ROS累積(48、72 h,P<0.01，圖3B)以及MDA水平(P<0.05，圖3D)。

a:P<0.05，b:P<0.01,與Control組比較

2.4 HAdV-7感染肺泡上皮細(xì)胞后胞內(nèi)二價(jià)鐵離子水平

運(yùn)用胞內(nèi)亞鐵離子熒光探針FerroOrange檢測(cè)HPAEpiC細(xì)胞中的Fe2+水平,發(fā)現(xiàn)感染組較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)FerroOrange熒光強(qiáng)度增加(P<0.01，圖4)，說(shuō)明HAdV-7感染細(xì)胞導(dǎo)致胞內(nèi)Fe2+累積。

A: FerroOrange檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+的熒光圖；B:各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度 a:P<0.01,與Control組比較

2.5 HAdV-7感染肺泡上皮細(xì)胞后鐵死亡相關(guān)分子的基因表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果(圖5A、F)顯示，與非感染組相比，A549和HPAEpiC細(xì)胞感染HAdV-7后，SLC7A11/xCT的mRNA表達(dá)水平顯著降低(A549和HPAEpiC: 24、48、72 h，P<0.01)。如圖5B、G所示，HAdV-7感染同時(shí)降低了GPX4的mRNA表達(dá)水平(A549: 24、72 h,P<0.01, 48 h,P<0.05; HPAEpiC: 24、48、72 h，P<0.01)。由此可見(jiàn)，HAdV-7感染致使宿主細(xì)胞的SLC7A11/xCT和GPX4在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制而出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HPAEpiC細(xì)胞感染HAdV-7后SLC7A11/xCT和GPX4蛋白表達(dá)水平降低(圖6)。此外，兩種細(xì)胞感染后，鐵調(diào)素(HAMP)表達(dá)上調(diào)(A549: 72 h,P<0.01; HPAEpiC: 24 h,P<0.05, 48、72 h，P<0.01，圖5C、H)，說(shuō)明HAdV-7感染上皮細(xì)胞后，胞內(nèi)鐵動(dòng)員增加。膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC40A1)是負(fù)責(zé)細(xì)胞鐵輸出，然而，HAdV-7感染后24、48、72 h, 兩種細(xì)胞的編碼膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)下調(diào)(A549: 24、48、72 h,P<0.01; HPAEpiC: 24 h,P<0.05, 48、72 h,P<0.01，圖5D、I)。另一方面，感染組的鐵蛋白重鏈 1(FTH1)的mRNA水平較對(duì)照組降低(A549: 72 h,P<0.01; HPAEpiC: 48、72 h,P<0.01，圖5E、J)，提示HAdV-7感染后肺泡上皮細(xì)胞阻止鐵參與Fenton反應(yīng)，抗細(xì)胞氧化損傷的能力減低。

a：P<0.05，b：P<0.01，與Control組比較

A: Western blot檢測(cè)GPX4和SLC7A11/xCT蛋白的表達(dá)；B、C: GPX4(B)和SLC7A11/xCT(C)蛋白的表達(dá)水平 a：P<0.05，與Control組比較

2.6 HAdV-7感染CD46人源化小鼠后肺組織鐵染色和鐵死亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平

肺組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HAdV-7感染小鼠的肺組織有更多的非血紅素鐵沉積(圖7A)。HAdV-7感染小鼠后肺組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)(P<0.05)與胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)(P<0.01)表達(dá)水平較非感染組均降低(圖7B～D)，提示HAdV-7感染可能抑制谷氨酸-胱氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(System Xc-)，致使直接失活GPX4且表達(dá)降低，從而導(dǎo)致宿主氧化防御能力降低并導(dǎo)致鐵死亡。

a：P<0.05，b:P<0.01，與Control組比較

2.7 予鐵死亡抑制劑后，HAdV-7感染的肺泡上皮細(xì)胞存活情況和CD46人源化小鼠肺組織病理情況

為進(jìn)一步證實(shí)鐵死亡在腺病毒感染中的作用，在體外實(shí)驗(yàn)中引入鐵死亡特異性抑制劑DFO和Fer-1，觀察抑制鐵死亡后細(xì)胞的活性變化(圖8A、B)。DFO能夠抑制HAdV-7誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡，在HPAEpiC中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同樣地，HAdV-7+Fer-1組的細(xì)胞活性顯著高于HAdV-7組(A549:P<0.05; HPAEpiC:P<0.01)。CD46人源化小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HAdV-7感染小鼠后，細(xì)支氣管周?chē)凸芮?、血管周?chē)霈F(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主(圖8C)，提示HAdV-7感染引起了嚴(yán)重的肺損傷；進(jìn)一步在體內(nèi)予以Fer-1后，HAdV-7感染后肺組織病理炎癥明顯減輕，且肺損傷有所改善，見(jiàn)圖8C～E。

A、B:予以鐵死亡抑制劑后各組細(xì)胞存活情況 1：Control組；2：DFO組；3：Fer-1組；4：HAdV-7組；5：HAdV-7+DFO組；6：HAdV-7+Fer-1組；a：P<0.01，與Control組比較；b:P<0.05，c：P<0.01，與HAdV-7組比較；C:HE染色觀察各組肺組織形態(tài)變化(×200)；D、E:肺組織炎癥病理評(píng)分和肺損傷評(píng)分 1：Control組；2：Fer-1組；3：HAdV-7組；4：HAdV-7+Fer-1組；a：P<0.01，與Control組比較；b:P<0.05，與HAdV-7組比較

3 討論

人腺病毒是兒童病毒性肺炎的主要原因，占兒童肺炎的4%～10%[7,27]， 腺病毒感染后不僅引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)等急性危重癥，還會(huì)導(dǎo)致閉塞性細(xì)支氣管炎等慢性肺部疾病[28]，給患兒家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。由于目前還沒(méi)有針對(duì)腺病毒感染的特異性治療藥物[29]，對(duì)于腺病毒引發(fā)重癥肺炎和多種并發(fā)癥的機(jī)制亟待深入研究。

HAdV-7引發(fā)的下呼吸道感染常伴有嚴(yán)重的肺部炎癥和肺損傷。急性肺損傷(ALI)以彌漫性肺泡損傷為特征，可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮的損傷和死亡，激活炎癥細(xì)胞[15,30-31]。本研究結(jié)果顯示，HAdV-7感染導(dǎo)致了肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549、HPAEpiC細(xì)胞活性降低，提示HAdV-7誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致肺損傷。既往對(duì)肺損傷的研究多關(guān)注肺部炎癥細(xì)胞的死亡，如在膿毒癥所致肺損傷小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校种浦行粤＜?xì)胞凋亡可促進(jìn)肺損傷[32]；川芎嗪可通過(guò)抑制肺泡巨噬細(xì)胞焦亡和凋亡減輕急性肺損傷等[33]。肺泡上皮細(xì)胞作為肺損傷的重要靶細(xì)胞，其死亡方式在肺損傷中的研究較少，但仍有研究報(bào)道，肺泡上皮細(xì)胞的凋亡[15]、壞死[34]等參與了肺損傷的病理生理，而鐵死亡作為一種新的死亡方式則鮮有報(bào)道。有臨床研究報(bào)道，ARDS的嚴(yán)重程度與鐵以及鐵相關(guān)蛋白的水平有關(guān)[35]。本研究中HAdV-7感染肺上皮細(xì)胞系，細(xì)胞線(xiàn)粒體均發(fā)生鐵死亡特征性形態(tài)變化，MDA、ROS以及胞內(nèi)亞鐵離子增加，同時(shí)鐵死亡通路中的關(guān)鍵基因表達(dá)水平改變，提示HAdV-7感染引起了肺泡上皮細(xì)胞的鐵死亡，但HAdV-7誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制仍待深入研究。最近研究報(bào)道，SARS-CoV-2誘導(dǎo)免疫激活的同時(shí)會(huì)引發(fā)炎癥因子風(fēng)暴，尤其是IL-6的大量增加，刺激HAMP，進(jìn)而阻斷SLC40A1編碼的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載，而誘導(dǎo)鐵自噬觸發(fā)不穩(wěn)定鐵池的增加，最終通過(guò)多聚多不飽和脂肪酸(PL-PUFA)過(guò)氧化促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[36]。本研究結(jié)果中，HAdV-7感染后HAMP表達(dá)上調(diào)，SLC40A1表達(dá)上調(diào)，表明HAdV-7感染與SARS-CoV-2類(lèi)似，增加胞內(nèi)鐵動(dòng)員而鐵輸出受到抑制。同時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞感染HAdV-7后，F(xiàn)TH1表達(dá)降低，提示胞內(nèi)維持機(jī)體鐵離子的可溶和非毒性狀態(tài)的貯鐵蛋白減少。由此可見(jiàn)，HAdV-7感染觸發(fā)了鐵代謝紊亂，過(guò)多的鐵通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量的活性氧致使肺泡上皮細(xì)胞損傷甚至死亡，這也與油酸所致肺損傷小鼠模型中報(bào)道的鐵超載結(jié)果一致[37]。此外，研究報(bào)道氧葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)通過(guò)抑制SLC7A11和GPX4，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡[38]，本研究也得到類(lèi)似的結(jié)果，HAdV-7感染降低xCT的表達(dá)而抑制半胱氨酸的輸入，導(dǎo)致谷胱甘肽的消耗，從而導(dǎo)致抗氧化酶GPX4的失活，ROS累積使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力不足促進(jìn)靶細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。總之，HAdV-7感染可引起細(xì)胞內(nèi)鐵離子過(guò)載、xCT-GPX4軸耗竭所致的ROS過(guò)量產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)障礙。

予以鐵死亡抑制劑， HAdV-7感染所致的細(xì)胞死亡和肺部損傷明顯改善，這與抑制鐵死亡可以減輕膿毒癥模型中的肺損傷、心臟損傷和肝臟損傷等[20,39-41]研究報(bào)道一致，從而提示靶向肺泡上皮細(xì)胞的鐵死亡可能是治療HAdV-7感染所致肺損傷的新策略，而抑制鐵死亡可能是臨床治療 HAdV-7重癥感染的重要靶點(diǎn)。因此，亟需更多的科學(xué)探索以確認(rèn)鐵死亡在HAdV-7感染相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究顯示，A549和HPAEpiC兩種細(xì)胞在HAdV-7感染后鐵死亡相關(guān)分子表達(dá)量及應(yīng)用鐵死亡抑制劑的效應(yīng)等方面略有差異，可能是由于兩種細(xì)胞的來(lái)源不同。A549是一種腫瘤性細(xì)胞，主要用于肺腺癌的研究，其本身的死亡方式與正常肺泡上皮就有所不同，用A549研究肺損傷模型中的鐵死亡，可能存在偏倚。于是本研究采用正常的人肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)行了平行試驗(yàn)，兩種細(xì)胞所得結(jié)果在腺病毒感染與非感染組之間的趨勢(shì)是一致的。

目前，對(duì)于鐵死亡的研究仍處于初級(jí)階段，還需要在不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约芭R床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究探索。例如，鐵死亡主要通過(guò)炎癥和氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷，而在本實(shí)驗(yàn)還未涉及HAdV-7感染后續(xù)炎癥反應(yīng)與鐵死亡的關(guān)系；在HAdV-7感染模型中可能會(huì)存在其他死亡方式，而其他形式的細(xì)胞死亡方式與鐵死亡的相互作用以及這種相互作用在肺損傷的作用尚不明確，仍待進(jìn)一步探究。

綜上，本研究結(jié)果顯示，HAdV-7感染導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞鐵累積、抗氧化系統(tǒng)破壞，從而引起肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；阻斷鐵死亡能夠減輕HAdV-7感染所致肺部損傷，這可能為臨床重癥腺病毒感染的治療提供新的思路。