西藏藏族結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達的相關(guān)性研究

沈燕如，泥永淘，胡偉，李磊，歐珠羅布

1.西藏大學(xué)附屬阜康醫(yī)院消化內(nèi)科，西藏拉薩 850000；2.西藏大學(xué)附屬阜康醫(yī)院實驗室，西藏拉薩 850000；3.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏拉薩 850000

《2020全球癌癥報告》顯示，2018年全球結(jié)直腸癌新發(fā)193萬例，死亡93萬例，居第3位常見癌癥和第2位常見癌癥死亡原因[1]?？v觀國內(nèi)，結(jié)直腸癌位居第3位常見癌癥和第5位常見癌癥死亡原因[2]。與結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的主要基因突變靶點和信號調(diào)控通路中，研究最多且最典型的是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，而K-ras、PIK3CA基因是導(dǎo)致EGFR下游信號通路持續(xù)激活的主要原因之一。西藏海拔高，特殊環(huán)境及飲食背景下，藏族結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達情況及其相關(guān)性值得探究，但目前鮮有相關(guān)研究報道。基于 此，本研究選取2020年9月—2021年9月于西藏大學(xué)附屬阜康醫(yī)院就診的70例藏族結(jié)直腸癌患者為研究對象，分析藏族結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因表達情況及三者之間的相關(guān)性，旨在為藏族結(jié)直腸癌患者分子靶向治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院診治的藏族結(jié)直腸癌患者70例為研究對象。本研究通過西藏大學(xué)附屬阜康醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。70例患者中男43例，女27例；年齡34～75歲，平均（53±11.8）歲。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)切除腫瘤組織/內(nèi)鏡活檢組織病理確診結(jié)直腸癌；②臨床資料完整；③世居西藏。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有放療或化療史者；②合并其他惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1熒光定量PCR法檢測K-ras、PIK3CA基因突變將石蠟包埋的結(jié)直腸癌組織5 μm厚切片，連續(xù)切10張。DNA提取試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）提取切片中的結(jié)直腸癌組織DNA，K-ras基因突變檢測試劑盒和PIK3CA基因突變檢測試劑盒檢測K-ras基因第2、3、4外顯子和PIK3CA基因第20外顯子突變情況。

1.3.2免疫組化SP法檢測EGFR基因表達EGFR單克隆抗體（鼠抗人）、pv-6000試劑盒、DAB染色液、PBS緩沖液（粉末）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按照試劑盒說明進行實驗操作，采用PBS代替一抗作陰性對照，已知的陽性切片作陽性對照。以細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性。

1.4 觀察指標(biāo)

分析藏族結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達情況，三者與臨床病理特征的關(guān)系及三者之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達情況分析

70例藏族結(jié)直腸癌患者中有28例存在K-ras基因突變，突變率為40.0%；6例存在PIK3CA基因突變，突變率為8.6%；43例EGFR基因呈陽性表達，陽性率為61.4%。

2.2 K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達與臨床病理特征關(guān)系

K-ras基因突變率，右半結(jié)腸癌患者高于左半結(jié)腸癌患者、TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡分層（分為≥60歲和＜60歲）、性別、腫瘤直徑（分為≥5 cm和＜5 cm）和分化程度的結(jié)直腸癌患者之間K-ras基因突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PIK3CA基因突變率，低分化結(jié)直腸癌患者高于中高分化結(jié)直腸癌患者，TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡分層、性別、原發(fā)部位和腫瘤直徑的結(jié)直腸癌患者之間PIK3CA基因突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。EGFR基因陽性表達，TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡分層、性別、原發(fā)部位、腫瘤直徑和分化程度的結(jié)直腸癌患者之間EGFR基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 藏族結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達的相關(guān)性

5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突變。K-ras基因突變和PIK3CA基因突變之間存在正相關(guān)（r=0.271，P=0.023）。19例患者存在K-ras基因突變且EGFR基因陽性表達，但K-ras基因突變和EGFR基因陽性表達之間無相關(guān)性（r=0.108，P=0.374）。4例患者存在PIK3CA基因突變且EGFR基因陽性表達，但PIK3CA基因突變和EGFR基因陽性表達之間無相關(guān)性（r=0.033，P=0.787）。

3 討論

EGFR又稱HER-1，為HER/erbB家族成員，在缺乏特異性配體時，其處于抑制狀態(tài)，當(dāng)EGFR配體與EGFR胞外結(jié)合域結(jié)合后可致EGFR二聚化和激活。一些惡性腫瘤細胞異常產(chǎn)生EGFR配體，以自分泌方式激活EGFR，另外EGFR亦可以被自身的突變激活。EGFR的激活刺激下游通路（RAS/MAPK和PI3K/AKT信號通路等）的激活，導(dǎo)致癌細胞增殖。EGFR存在于細胞質(zhì)及細胞膜表面，在癌組織中表達最高，在腺瘤中表達中等，在正常上皮中表達極低。本研究結(jié)果顯示，EGFR基因陽性表達率較高，為61.4%，與文獻報道基本一致[3]。

K-ras屬RAS基因家族，是癌癥中最常突變的癌基因。K-ras基因編碼的K-ras蛋白有GTP酶活性，其如同一個分子開關(guān)，在活化和非活化的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)之間循環(huán)。K-ras蛋白結(jié)合GTP時為活化態(tài)，K-ras蛋白與下游信號分子結(jié)合并激活相應(yīng)效應(yīng)分子，信號實現(xiàn)傳遞；當(dāng)GTP水解且K-ras蛋白結(jié)合GDP時為失活態(tài)，信號被阻止。當(dāng)K-ras基因突變后，K-ras蛋白的GTP酶活性降低，其水解GTP能力下降，與GTP牢固結(jié)合，持續(xù)處于活化態(tài)，從而放大下游信號通路。這導(dǎo)致細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，細胞不依賴EGFR地激活信號，持續(xù)增殖甚至癌變[4]。本研究結(jié)果顯示，K-ras基因突變率為40.0%，與文獻報道基本一致[5-6]。

PI3K/AKT是EGFR激活的第2個主要信號通路。EGFR與配體結(jié)合激活PI3K。PI3K由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成。p110可使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3隨后激活A(yù)KT，而AKT可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。PIK3CA是編碼p110的基因，正常細胞中p110為低活性，當(dāng)PIK3CA突變后可通過激活p110，刺激AKT信號而致細胞增殖和侵襲。本研究中PIK3CA基因突變率為8.6%，朱鳳偉等[6]研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者中PIK3CA突變率為5.67%，而Poulsen TS等[7]研究得出PIK3CA在結(jié)直腸癌患者中突變率為18.8%，該差異可能與民族及環(huán)境有關(guān)。

進一步分析K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系，本研究顯示右半結(jié)腸癌患者及TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者Kras基因突變率更高。本結(jié)果與美國癌癥數(shù)據(jù)庫分析的19877例無轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的相關(guān)研究結(jié)論相一致[8]。有研究表明K-ras基因突變同結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。本研究顯示K-ras基因突變與年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度無關(guān)。朱鳳偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，此與本研究結(jié)果一致。但不同的是其研究顯示K-ras基因突變與肝轉(zhuǎn)移和臨床分期亦無關(guān)。另也有研究指出K-ras基因突變率隨年齡增加而升高[10]。分析上述不同可能與樣本量及民族地域差異有關(guān)。本研究顯示，低分化結(jié)直腸癌患者及TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者PIK3CA基因突變率更高。劉鑫等[5]研究亦發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者其PIK3CA基因突變率更高。但另有研究顯示，PIK3CA基因突變與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度及臨床分期均無關(guān)[6]，該差異可能與腫瘤異質(zhì)性有關(guān)，還需進一步研究驗證。本研究中TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者EGFR基因陽性表達率更高。Nemanqani DM等[3]研究亦發(fā)現(xiàn)EGFR在晚期結(jié)直腸癌中有較高的表達。本研究顯示不同年齡分層、性別、原發(fā)部位、腫瘤直徑和分化程度患者之間EGFR基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而Lawan AI等[11]研究顯示腫瘤大小與EGFR陽性表達之間存在關(guān)聯(lián)，與本文不一致，可能與本研究樣本量較少有關(guān)。

本研究中，有5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突變（突變率為7.1%），兩者之間存在正相關(guān)，與報道一致[12]。但K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因陽性表達之間無相關(guān)性。有研究指出K-ras基因突變與EGFR基因突變幾乎不會同時出現(xiàn)，考慮兩者的基因突變在腫瘤的發(fā)生中是獨立存在的[13]。抗EGFR單抗是結(jié)直腸癌最常用的靶向藥物，抗EGFR單抗能結(jié)合EGFR的胞外區(qū)域阻止配體與EGFR結(jié)合，抑制EGFR及其下游信號通路的激活。K-ras基因突變后可抵抗EGFR單抗，導(dǎo)致EGFR單抗治療無效[14]。在EGFR單抗治療無效的患者中，K-ras基因突變占30%～40%，有研究提出PIK3CA基因突變可能是導(dǎo)致K-ras野生型患者EGFR單抗治療無效的原因[15]。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為K-ras和PIK3CA基因突變狀態(tài)與化療療效相關(guān)。美國綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)NCCN指南[16]建議所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行K-ras基因突變檢測，K-ras基因突變患者不建議應(yīng)用西妥昔單抗和帕尼單抗。西藏藏族群居于高原環(huán)境，飲食習(xí)慣與低海拔區(qū)人群有明顯不同，藏族人群結(jié)直腸癌疾病特征及K-ras、PIK3CA基因突變及EGFR基因表達情況自有特點。本研究中，存在樣本量小、，缺乏生存隨訪等缺陷，需進一步探究。

綜上所述，70例藏族結(jié)直腸癌患者中K-ras基因突變率為40.0%，PIK3CA基因突變率為8.6%，EGFR基因陽性表達率為61.4%。K-ras基因突變和PIK3CA基因突變存在正相關(guān)，但K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因陽性表達之間無相關(guān)性。所以，在結(jié)直腸癌進展過程中，K-ras基因和PIK3CA基因可能是協(xié)同作用，而K-ras、PIK3CA基因與EGFR基因可能是相關(guān)獨立作用，對此還需進一步研究。有必要對藏族結(jié)直腸癌患者進行K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達檢測，不但有利于精準(zhǔn)治療，改善預(yù)后，同時也可為完善藏族結(jié)直腸癌基因突變情況提供研究參考。