• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于甘松HPLC指紋圖譜的模式識別研究及綜合主成分評價模型*

    2022-11-07 04:23:26楊祎辰王二歡王繼強田國慶唐茜琳郭方森王雪健馬存德
    中醫(yī)藥導報 2022年7期
    關鍵詞:甘松綠原產(chǎn)地

    楊祎辰,王二歡,王繼強,田國慶,唐茜琳,張 淼,郭方森,王雪健,馬存德

    (1.陜西國際商貿(mào)學院中藥研究院,陜西 咸陽 712046;2.陜西步長制藥有限公司,陜西 西安 710075;3.山東步長制藥股份有限公司,山東 菏澤 274000)

    甘松,別名香松、甘松香,始載于唐·陳藏器的《本草拾遺》[1]。明·李時珍稱其“產(chǎn)于川西松洲,味甘”,故而得名[2]。甘松外用祛濕消腫,內(nèi)服則有理氣止痛、開郁醒脾之功效[3]?,F(xiàn)代藥理臨床研究表明,甘松具有抗心律失常、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血壓等作用。Flora of China指出甘松屬共2種,分布于喜馬拉雅山區(qū),我國產(chǎn)1種,即Nardostachys jatamansi(D.Don)DC.[4],沿用至今。由于甘松適宜的生長環(huán)境嚴苛,人工栽培技術發(fā)展滯后,多年以來市場流通供給完全依賴野生采挖。因此,甘松的野生資源破壞嚴重,瀕臨滅絕。國內(nèi)學者對多種瀕危藥材的質量評價及資源高效利用進行了相關研究,但甘松卻少見報道,其研究主要集中在提取分離、臨床醫(yī)學及藥理藥效學等方向,涉及質量評價相關的研究較少[5]。僅有李瑩等[6]、劉國林等[7]及買吾蘭江等[8]對甘松的質量評價及特征圖譜進行了不同程度的研究,但樣本數(shù)量少、采集地點單一,且未建立共有模式,亦未能提出有效的質量評價方法,已不能有效反映當前主產(chǎn)區(qū)甘松藥材的整體質量,亟待深入開展相關研究。此外,基于指紋圖譜的綜合主成分分析評價,已作為當前中藥材質量評價手段之一,廣泛應用于丹參[9]、三棱[10]、秦皮[11]等多味大宗中藥材,其評價結果具有客觀、準確、適用范圍廣等特點,可彌補甘松藥材現(xiàn)代化質量評價手段的空白。基于上述現(xiàn)狀,本研究以不同產(chǎn)地收集的甘松藥材作為研究對象,通過HPLC法建立甘松藥材指紋圖譜,并運用主成分分析和系統(tǒng)聚類分析,對所有樣品的圖譜進行分析并篩選,建立甘松藥材指紋圖譜;并對其共有模式進行研究,構建甘松藥材的綜合主成分評價模型,為甘松藥材的質量評價提供方法及參考依據(jù),以期規(guī)范當前甘松藥材的市場流通及產(chǎn)地采收加工現(xiàn)狀,保障優(yōu)質的甘松藥材能夠應用于中醫(yī)藥臨床。

    1 儀器與試藥

    1.1 試藥筆者于2021年6—7月,前往四川、甘肅及青海3省,共采集27個批次甘松藥材樣品。經(jīng)陜西步長制藥有限公司副主任藥師馬存德鑒定,均為敗醬科甘松屬甘松Nardostachys jatamansi(D.Don)DC.。樣品采集信息表見表1。

    表1 甘松藥材樣品采集信息

    1.2 主要儀器與試劑LC-2030 Plus型液相色譜儀(日本SHIMADZU公司);TU-1810型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);TE124S型分析天平(德國Sartorius公司);QUINTIX224-1CN型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司);HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);DHG-9050B型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海瑯玕實驗設備有限公司);KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TQ-300型高速多功能粉碎機(上海市天祺盛世科技有限公司)。

    甘松新酮對照品(批號:AF21021603)、綠原酸對照品(批號:AF21012553)購于成都埃法生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純,購于美國BCR試劑公司;水為娃哈哈純凈水,其它試劑均為分析純。

    2 方法與結果

    2.1 色譜條件色譜柱:Diamonsil Plus 5 μm C18-A,250 mm×4.6 mm;流動相:A-(乙腈),B-(0.2%磷酸水溶液);柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:275 nm。洗脫條件見表2。各主成分與鄰峰之間分離度均大于1.5,分離度良好,所測定的各成分理論塔板數(shù)均不低于5 000。

    表2 洗脫條件

    2.2 對照品溶液的制備精密稱取甘松新酮對照品適量,加甲醇制成每1 mL中含0.250 0 mg的溶液;精密稱取綠原酸對照品適量,加甲醇制成每1 mL中含1.000 1 mg的溶液,即得。

    2.3 供試品溶液的制備精密稱取甘松藥材粉末(過40目篩)0.5 g,置具塞錐形瓶中,準確加入甲醇20 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率800 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,再稱質量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.4 方法學考察

    2.4.1 線性關系考察 用甲醇稀釋對照品溶液,分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍,搖勻,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,超聲除氣,備用。在“2.1”項條件下,以液相色譜峰面積(Y)對兩種成分濃度(mg/L,X),繪制標準曲線,分別建立甘松新酮和綠原酸的線性回歸方程:Y=31.380X+11.806,R2=0.999 9;Y=37.373X+36.920,R2=0.999 9。表明甘松新酮在7.8~250.0 mg/L濃度范圍內(nèi)、綠原酸在31.2~1 000.0 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

    2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(編號:S26),在“2.1”項條件下,連續(xù)進樣6次。甘松新酮含量分別為1.35%、1.35%、1.32%、1.28%、1.33%、1.43%,平均值為1.34%,RSD為3.74%,綠原酸含量分別為0.15%、0.14%、0.13%、0.14%、0.14%、0.15%,平均值為0.14%,RSD為4.65%。表明儀器精密度良好。

    2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(編號:S~26),分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項條件下測定。甘松新酮含量分別為1.36%、1.32%、1.32%、1.30%、1.30%、1.30%,平均值為1.32%,RSD為1.64%;綠原酸含量分別為0.15%、0.13%、0.14%、0.14%、0.14%、0.14%、0.13%,平均值為0.14%,RSD為4.79%。表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一樣品(編號:S26)6份,按“2.1”項方法制備,在“2.1”項條件下測定。甘松新酮含量分別為1.33%、1.32%、1.33%、1.35%、1.32%、1.30%,平均值為1.32%,RSD為1.09%;綠原酸含量分別為0.13%、0.13%、0.13%、0.14%、0.13%、0.13%,平均值為0.13%,RSD為2.71%。表明方法的重復性良好。

    2.4.5 含量測定 分別取27批次不同產(chǎn)地的甘松藥材,按“2.3”項方法制備,在“2.1”項條件下測定甘松新酮和綠原酸的含量。

    2.4.6 加樣回收率試驗 取已知質量分數(shù)的同一樣品(編號:S26)0.5 g,精密稱定,平行樣9份,分別加入供試品中待測成分含量50%、100%、150%的甘松新酮、綠原酸對照品各3份,混勻;按“2.3”項方法制備,在“2.1”項條件下測定,分別計算甘松新酮和綠原酸的加樣回收率。結果顯示,甘松新酮、綠原酸的平均回收率分別為97.67%和98.81%,RSD分別為1.46%和2.75%。(見表3)

    表3 加樣回收率試驗結果(n=3)

    2.5 樣品測定綠原酸和甘松新酮為甘松的次生代謝產(chǎn)物,應用于甘松質量評價[12-14]。其中,甘松新酮為現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的甘松藥材指標性成分。如圖1所示,27批次甘松藥材的綠原酸含量在0.10%~0.83%范圍內(nèi),其中S15(甘南州瑪曲縣阿萬倉鎮(zhèn)娘瑪寺)最高,為0.83%,較最低的S18(果洛州久治縣智合日散木)高出730.00%;而甘松新酮含量在0.40%~8.73%范圍內(nèi),其中S25(阿壩州紅原縣邛溪鎮(zhèn)-仿野生栽培)最高,為8.73%,較最低的S16(甘南州瑪曲縣阿萬倉鎮(zhèn)尼瑪?。└叱?082.50%??梢?,各產(chǎn)地甘松藥材的綠原酸和甘松新酮含量差異較大,主要原因考慮如下:(1)甘松屬于高原植物,生長條件苛刻,高原地區(qū)海拔跨度大、氣候各異,不同的生長環(huán)境影響植物的次生代謝;(2)甘松為多年生草本植物,本研究收集的樣品生長年限未知,導致主要活性成分含量差異較大;(3)甘松樣品根莖葉花比例不均一,同種藥材的不同部位有效成分含量亦存在一定的差異?,F(xiàn)行規(guī)定,本品按干燥品計算,含甘松新酮(C15H22O3)不得少于0.10%。本研究收集的27個不同批次甘松藥材均高于此一標準。

    圖1 不同產(chǎn)地甘松藥材主要活性成分含量

    2.6 指紋圖譜的建立與化學模式識別分析

    2.6.1 甘松藥材樣品指紋圖譜及相似度評價 通過將27批次不同產(chǎn)地的甘松藥材樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012版)軟件,并對其進行相似度評價分析。以編號為S26的樣品圖譜作為參照圖譜,篩選出17個主要特征峰,構建甘松藥材的指紋圖譜,并對2、13號峰進行指認,分別為綠原酸和甘松新酮。后經(jīng)多點校正,得到27批次甘松樣品圖譜與對照圖譜的相似度計算結果在0.754~0.996之間。其中,S7、S16、S25樣品的相似度分別為0.881、0.754、0.896,而其它批次樣品的相似度均大于0.900。(見圖2)

    圖2 27批次甘松藥材指紋圖譜

    2.6.2 聚類分析 通過將17個共有峰峰面積作為變量,運用SPSS 23.0軟件,采用組間聯(lián)接法,以平方歐式距離27批次甘松藥材樣品進行系統(tǒng)聚類分析,結果見圖3。當組間距離大于10時,27批次樣品聚為2類,其中S25(仿野生栽培品)、S27(大田栽培品)為一類,剩余批次為一大類。當組間距離為5~10區(qū)間,最多可分為5類。其中,S4、S25、S27分別單獨為一類;甘南州的2批(S7、S16)及S24(仿野生栽培品)為一類;剩余批次為一大類,聚類特征較為模糊。當組間距離為0~5區(qū)間,該大類中的甘南州的3批(S11、S13、S15)、果洛州的S18及阿壩州的(S20、S23)為一類;S5、S8、S9、S17、S26為一類;甘南州的5批(S1、S6、S10、S12、S14)及阿壩州的2批(S19、S21)為一類;甘南州的2批(S2、S3)為一類;阿壩州的2批(S7、S247)為一類;S22單獨為一類;同時,S4、S16、S25、S27分別單獨為一類。綜上,甘松野生品及栽培品差異明顯,而不同產(chǎn)地的甘松亦存在一定的差異。因此,可用聚類分析的方法對藥材樣品進行分類評價,其結果與相似度評價結果基本保持一致。

    圖3 27批次甘松藥材的聚類分析

    2.6.3 主成分分析(PCA)通過將27批次甘松藥材樣品的17個共有峰峰面積作為變量,采用SPSS 23.0軟件將原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)z-score標準化處理后。通過降維因子分析中的KMO檢驗和Barlett球形度檢驗,結果顯示:其中KMO取樣適切性量數(shù)為0.728,適合進行主成分分析;Bartlett球形度檢驗近似卡方為679.697,自由度為136,P=0.000<0.001,顯示該例變量可以為主成分分析提供合理基礎。同時,經(jīng)主成分分析及權重計算后,前3個主成分特征值均大于1,累積貢獻率達83.314(見表4);而因子分析碎石圖(見圖4)亦可看出,在第3個主成分特征值處出現(xiàn)拐點,后逐漸趨于平緩?;谏鲜龇治鼋Y果,故提取前3個成分為主成分?;谠摋l件,以產(chǎn)地作為Group,批次作為Observations,運用OriginPro 2021軟件對標準化處理后的原始數(shù)據(jù)進行主成分分析,并繪制Score Plot圖(見圖5)??梢钥闯?,除S4、S16、S25、S27外,其余批次藥材距離較近且均分別處于兩個置信橢圓范圍內(nèi),與系統(tǒng)聚類分析結果基本一致。

    圖4 碎石圖

    表4 27批甘松共有峰特征值與貢獻率

    圖5 Score Plot圖

    2.6.4 綜合主成分評價模型 由甘松主成分因子負荷矩陣(見表5)可知,主成分1主要解釋了F4~F5、F8~F17共13個色譜峰的信息,其中,F(xiàn)5及F8~F17在主成分1中的正相負荷值均大于0.6,即峰面積增加,第1主成分權重亦增大;主成分2主要解釋了F1~F3、F6共4個色譜峰的信息,僅有F7在主成分3中的正相負荷值大于0.6。此外,F(xiàn)7~F12、F16共7個色譜峰在全部主成分中負荷值均為正相。通過綜合主成分分析,將甘松17個共有峰在各主成分中的因子負荷值轉換為對應的線性組合系數(shù)(見表5),進而得到主成分1、2、3的評分線性方程Y1、Y2、Y3,再與3個主成分的方差貢獻率加權后即得到甘松藥材綜合質量評價模型F。將z-score標準化處理后的27批次甘松藥材樣品的17個共有峰峰面積數(shù)值依次代入上述方程及評價模型后,結果即為甘松藥材綜合主成分F值。對F值進行排序,其結果亦是對甘松質量綜合評價的結果。(見表6)

    表5 主成分分析因子負荷矩陣及線性組合系數(shù)

    表6 綜合主成分評價結果

    計算公式如下:

    綜上可知,主成分因子得分值計算公式為Yi=∑Xj·λj,而綜合主成分評價模型F=∑Yi;式中,Xj為標準化后的峰面積值,λj為線性組合系數(shù)。

    2.6.5 甘松藥材標準指紋圖譜的建立 基于相似度評價,參考主成分分析及系統(tǒng)聚類分析結果,將S4、S16、S25、S27批次剔除,取剩余23批次甘松樣品建立甘松藥材的標準指紋圖譜。將23批次甘松樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)重新導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)軟件,對其進行相似度評價(見表7);并繼續(xù)設定S26為參照圖譜,經(jīng)多點校正、匹配,R為生成的對照指紋圖譜(見圖6)。結果顯示,剩余23批次甘松樣品與對照圖譜比較的相似度均在0.915以上,這可為甘松藥材的質量評價提供科學依據(jù)。

    圖6 甘松藥材標準指紋圖譜

    表7 23批次甘松樣品的相似度評價

    3 討 論

    3.1 供試品的制備方法參照2020年版《中華人民共和國藥典》甘松新酮“含量測定”項下供試品溶液的制備方法[3],在超聲處理(功率50 W,頻率45 kHz)15 min條件下,開展重復性試驗時,RSD較大??紤]為超聲提取不充分,故采用超聲處理(功率800 W,頻率40 KHz)15 min,結果較好。此外,2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定甘松的入藥部位為根及根莖,而本研究所采集的甘松樣品均為全草。原因在于甘松資源均依賴于野生,且資源量匱乏,實際流通品均為全草。因此,結合市場及產(chǎn)地流通調(diào)研情況及文獻報道,本研究中各批次樣品檢測部位均為甘松全草。

    3.2 色譜條件的選擇為了保證建立的甘松指紋圖譜能夠體現(xiàn)更多的化學成分,且篩選的2種有效成分具有較好的分離度,使得該方法適宜于定量分析。故分別對綠原酸和甘松新酮對照品溶液在紫外190~400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長差異較大。綜合考慮,選擇在275 nm波長條件下對2種成分進行測定,結果較好。此外,配置2種成分的混合對照品溶液考察洗脫體系,結果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相,對混合對照品的分離度較好,基線穩(wěn)定,色譜峰理論塔板數(shù)高,同時也適用于供試品溶液。

    買吾蘭江等[8]建立的甘松藥材HPLC指紋圖譜方法需60 min,且30 min后已無共有特征峰出現(xiàn),僅標注4個共有峰;而李瑩等[5]以10批藥材,建立的甘松HPLC指紋圖譜方法則需65 min,但色譜峰分離度一般。本研究構建的HPLC指紋圖譜,分析時間短(40 min),減少了溶劑用量,降低了分析及人工成本,同時各色譜峰分離效果良好。

    3.3 分析方法評價23批次藥材與對照指紋圖譜相似度均在0.915以上,表明不同產(chǎn)地的甘松藥材質量較穩(wěn)定。主成分分析結果與聚類分析結果基本一致,大多數(shù)甘松野生品聚為一類,而甘松栽培品聚為一類,但其中亦有個別產(chǎn)地的甘松野生品與栽培品未能有效聚類。考慮由于部分產(chǎn)地的栽培甘松采用仿野生栽培模式,因此質量與野生品較為接近。此外,由于甘松屬多年生草本,而此生代謝產(chǎn)物的積累往往與植物的生長年限相關,野生甘松生長年限等信息的不明確,亦會影響聚類分析的結果。因此,尚需開展不同采收期栽培甘松或不同生長年限的野生甘松質量評價研究。綜上,建立的分析方法基本可行,亦可為甘松的來源及產(chǎn)地識別提供支持。

    3.4 綜合主成分評價模型指紋圖譜是中藥材質量評價、控制的主要手段之一,其可通過相似度評價體現(xiàn)不同批次藥材的差異;但當樣本量過大且相似度較為接近時,單一的指紋圖譜便不能有效、準確地判斷藥材質量的優(yōu)劣,往往需要結合統(tǒng)計學評價[15-17]。而綜合主成分評價法是在主成分分析的基礎上,在不損失或盡量少損失原樣本內(nèi)在指標信息的前提下,將數(shù)個具有一定相關性的指標通過加權計算,轉換成一個綜合指標F值,以此來進行綜合評價、考量,并據(jù)此對不同樣本進行優(yōu)劣排序。本研究建立的綜合主成分評價模型結果表明,S27、S25的F值最高,分別為隴南大田栽培品及阿壩仿野生栽培品,而系統(tǒng)聚類分析中當組間距離大于10時,S27、S25亦聚為一類,其它批次為一大類,二者結果保持一致;S2、S3的F值最低,均為甘南合作的野生品,而系統(tǒng)聚類分析中當組間距離小于3時,S2、S3聚為一類,故綜合主成分評價模型得到了系統(tǒng)聚類分析的驗證。因此,基于甘松藥材HPLC指紋圖譜構建的綜合主成分評價模型較好,具有一定參考價值。

    4 小 結

    本研究通過HPLC法建立了不同產(chǎn)地甘松藥材的指紋圖譜,通過主成分分析及系統(tǒng)聚類分析兩種統(tǒng)計學方法對色譜數(shù)據(jù)進行模式識別初探?;诜治鼋Y果,剔除了個別樣品,確定入選的樣品批次,最終得到了較為標準的甘松藥材對照指紋圖譜,為甘松藥材的質量評價研究奠定了基礎。此外,首次建立了基于指紋圖譜的甘松藥材綜合主成分評價模型。其評價結果與系統(tǒng)聚類基本保持一致,并能夠較好地體現(xiàn)相似度評價,其F值的優(yōu)劣排序具有一定的客觀性,可作為未來甘松藥材質量評價的手段。同時,研究結果亦表明不同產(chǎn)地的野生甘松藥材、野生與栽培甘松藥材的質量均具有明顯的差異。因此,基于本研究取得的成果,亟待進一步開展甘松野生與栽培品主要活性成分及不同產(chǎn)地甘松的主要活性成分含量研究,為甘松的產(chǎn)地與品質的相關性及甘松藥材的道地性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐[18-21]。但本研究亦有不足之處,由于全部27批次甘松樣品生長年限等信息不明確,導致主要活性成分含量測定差異較大,未能得到與產(chǎn)地的相互關聯(lián)性分析,具有一定的局限性,還需進一步優(yōu)化樣品采集方式,深入開展相關研究。

    猜你喜歡
    甘松綠原產(chǎn)地
    警惕“洗產(chǎn)地”暗礁
    中國外匯(2019年22期)2019-05-21 03:14:56
    蔓三七葉中分離綠原酸和異綠原酸及其抗氧化活性研究
    綠原酸對3T3-L1前脂肪細胞分化的抑制作用
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:56:46
    中藥甘松化學成分與藥理作用的研究進展
    食物離產(chǎn)地越遠越好
    基于總量統(tǒng)計矩法綜合評價不同產(chǎn)地甘松揮發(fā)油成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:50
    測定不同產(chǎn)地寬筋藤中5種重金屬
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:16
    金銀花中綠原酸含量不確定度的評定
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:42
    加強產(chǎn)地檢疫實現(xiàn)以檢促防
    甘松和匙葉甘松的比較研究
    久久久久国产精品人妻一区二区| av黄色大香蕉| 日韩视频在线欧美| 亚洲色图av天堂| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品一及| 美女内射精品一级片tv| 欧美3d第一页| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久精品人妻少妇| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品一区二区性色av| 草草在线视频免费看| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美丝袜亚洲另类| 人人妻人人看人人澡| 国产午夜福利久久久久久| 视频区图区小说| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 超碰av人人做人人爽久久| 男女边吃奶边做爰视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日本午夜av视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产精品国产精品| 一个人看的www免费观看视频| 免费观看a级毛片全部| 中国国产av一级| 亚洲成人久久爱视频| 中文字幕久久专区| 国产高潮美女av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国内精品宾馆在线| 成人美女网站在线观看视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产男女内射视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av日韩在线播放| 高清日韩中文字幕在线| 久久国内精品自在自线图片| 精品一区二区三卡| 中文天堂在线官网| 精品一区在线观看国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 2022亚洲国产成人精品| 一级毛片久久久久久久久女| 中文字幕免费在线视频6| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久午夜欧美精品| 男女边吃奶边做爰视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产成人午夜福利电影在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产伦理片在线播放av一区| 深夜a级毛片| 久久久久久久精品精品| 国产爽快片一区二区三区| 国产成人精品福利久久| 99久久精品热视频| 99久国产av精品国产电影| 观看免费一级毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 乱系列少妇在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 视频中文字幕在线观看| 免费黄网站久久成人精品| www.av在线官网国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品国产av蜜桃| www.av在线官网国产| 少妇丰满av| 一区二区三区四区激情视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲色图av天堂| 精品久久久久久电影网| 日本欧美国产在线视频| 少妇的逼水好多| 亚洲精品视频女| 亚洲最大成人av| 久久精品国产亚洲网站| 九草在线视频观看| 一本色道久久久久久精品综合| 日本一二三区视频观看| 欧美97在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品夜色国产| 久久久久久久久久成人| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 免费人成在线观看视频色| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中国国产av一级| 香蕉精品网在线| 精品酒店卫生间| 99热网站在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 岛国毛片在线播放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 性色avwww在线观看| 精品久久久噜噜| 日韩av在线免费看完整版不卡| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲成人一二三区av| 成人亚洲精品一区在线观看 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品人妻视频免费看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁在线播放成人免费| 高清毛片免费看| 免费观看在线日韩| 我要看日韩黄色一级片| 国产大屁股一区二区在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本wwww免费看| 99久久精品国产国产毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久色成人| 亚洲精品一二三| 欧美日韩视频精品一区| av卡一久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人精品久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 国产亚洲一区二区精品| 99视频精品全部免费 在线| 少妇的逼好多水| 秋霞在线观看毛片| 麻豆成人av视频| 又大又黄又爽视频免费| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 激情 狠狠 欧美| 极品教师在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 精品酒店卫生间| 久久久久国产网址| 日韩欧美精品v在线| 久久ye,这里只有精品| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 韩国av在线不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 一级毛片我不卡| 国产成人a区在线观看| 国产乱人视频| 欧美成人a在线观看| 免费少妇av软件| 国产精品偷伦视频观看了| videossex国产| 免费少妇av软件| 一区二区三区精品91| 天天躁日日操中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产 一区精品| 精品久久久精品久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲自偷自拍三级| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久6这里有精品| 国产成人精品一,二区| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产又色又爽无遮挡免| 一级毛片 在线播放| 一级黄片播放器| 精品酒店卫生间| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 99久国产av精品国产电影| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚州av有码| 国产乱来视频区| 国产精品一区二区在线观看99| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 如何舔出高潮| 久久久亚洲精品成人影院| av国产精品久久久久影院| 丝袜喷水一区| 国产黄频视频在线观看| 久久久色成人| 女人久久www免费人成看片| 国产亚洲91精品色在线| 中文字幕亚洲精品专区| 婷婷色麻豆天堂久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费人成在线观看视频色| 99热国产这里只有精品6| 久久久色成人| 夫妻性生交免费视频一级片| 一级毛片久久久久久久久女| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 韩国av在线不卡| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人91sexporn| 99久国产av精品国产电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲国产av新网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 午夜福利网站1000一区二区三区| av免费在线看不卡| 亚洲国产最新在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久热精品热| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲国产精品国产精品| av网站免费在线观看视频| 亚洲欧洲日产国产| 人妻系列 视频| 18+在线观看网站| 午夜福利在线在线| 在线观看国产h片| av黄色大香蕉| 亚洲欧洲国产日韩| 婷婷色av中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 久久ye,这里只有精品| 国产高清三级在线| 久久久久精品久久久久真实原创| av在线天堂中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 成年版毛片免费区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 午夜免费鲁丝| 国产91av在线免费观看| freevideosex欧美| 在线 av 中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产日韩欧美在线精品| av免费在线看不卡| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲精品第二区| 国产老妇女一区| 久久97久久精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产色片| 国产免费一级a男人的天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 亚州av有码| 熟妇人妻不卡中文字幕| 少妇丰满av| 色视频www国产| 22中文网久久字幕| 久久久久网色| 插逼视频在线观看| 69人妻影院| 亚洲精品一二三| 成人鲁丝片一二三区免费| av.在线天堂| 久久97久久精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇人妻 视频| 免费看日本二区| 午夜福利在线在线| 久久人人爽人人片av| 国内精品美女久久久久久| 男男h啪啪无遮挡| 在线播放无遮挡| 日韩av免费高清视频| av在线老鸭窝| 久久久久久伊人网av| 中文字幕免费在线视频6| 中文欧美无线码| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产男人的电影天堂91| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲av.av天堂| 日韩欧美精品免费久久| 最近中文字幕2019免费版| 免费观看无遮挡的男女| 大香蕉久久网| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产探花在线观看一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 男女那种视频在线观看| eeuss影院久久| 久久午夜福利片| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线免费观看不下载黄p国产| 18禁动态无遮挡网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲人与动物交配视频| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲成人av在线免费| 亚洲综合色惰| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲四区av| tube8黄色片| .国产精品久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 白带黄色成豆腐渣| 视频区图区小说| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久久久久久久成人| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产精品久久久久久精品古装| 激情 狠狠 欧美| 在线观看三级黄色| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久网色| 成年av动漫网址| 天堂中文最新版在线下载 | 哪个播放器可以免费观看大片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 两个人的视频大全免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产日韩欧美在线精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 搡老乐熟女国产| 国产一级毛片在线| 国产探花在线观看一区二区| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一级爰片在线观看| 国产黄片美女视频| 精品一区二区免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 尾随美女入室| 少妇的逼好多水| 国产日韩欧美在线精品| 日日撸夜夜添| 久久久久久久国产电影| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 如何舔出高潮| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日本三级黄在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 91aial.com中文字幕在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美人与善性xxx| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩一区二区三区影片| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲四区av| 成人毛片60女人毛片免费| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲色图av天堂| 精品久久久久久久末码| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男人和女人高潮做爰伦理| 永久网站在线| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产亚洲精品久久久com| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| av线在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| tube8黄色片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美精品国产亚洲| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久久精品精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 一区二区三区乱码不卡18| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色播亚洲综合网| 成年版毛片免费区| 国产亚洲精品久久久com| 日韩欧美 国产精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产黄频视频在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 一级片'在线观看视频| 成人欧美大片| 视频中文字幕在线观看| 女人久久www免费人成看片| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美精品国产亚洲| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产综合精华液| 免费av观看视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 男女啪啪激烈高潮av片| 69av精品久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| av在线观看视频网站免费| 99久久精品国产国产毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久人人爽人人片av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费观看性生交大片5| 国产精品国产av在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产亚洲91精品色在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日本wwww免费看| 国产视频内射| 亚洲欧美成人精品一区二区| 大码成人一级视频| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲最大成人av| www.av在线官网国产| 精品久久久精品久久久| 中文字幕av成人在线电影| 免费看av在线观看网站| 亚洲综合色惰| 久热这里只有精品99| 视频中文字幕在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 日本wwww免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 男女国产视频网站| 国产探花极品一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产亚洲91精品色在线| 内射极品少妇av片p| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 精品久久久精品久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩大片免费观看网站| 赤兔流量卡办理| 午夜免费鲁丝| av.在线天堂| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩视频在线欧美| 综合色丁香网| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最近的中文字幕免费完整| 国产黄频视频在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久ye,这里只有精品| 亚洲色图av天堂| 国产片特级美女逼逼视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一级片'在线观看视频| 亚洲国产精品999| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| kizo精华| 成人无遮挡网站| 国产老妇女一区| 亚洲精品第二区| 少妇人妻 视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产免费福利视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 黑人高潮一二区| 国产毛片在线视频| 国模一区二区三区四区视频| av网站免费在线观看视频| 亚洲av不卡在线观看| 97超视频在线观看视频| 尾随美女入室| 日本一二三区视频观看| 日韩欧美精品v在线| 国产色爽女视频免费观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 在线天堂最新版资源| 国产精品一区www在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产日韩欧美在线精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美区成人在线视频| 少妇熟女欧美另类| 国产精品久久久久久精品电影| 免费看不卡的av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 2022亚洲国产成人精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 激情五月婷婷亚洲| 在线a可以看的网站| 秋霞在线观看毛片| 色吧在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产av码专区亚洲av| 成年免费大片在线观看| 黑人高潮一二区| 日本熟妇午夜| 国产精品一区www在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产在线男女| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品熟女少妇av免费看| 久久人人爽人人片av| 一级毛片 在线播放| 亚洲性久久影院| 最近手机中文字幕大全| 只有这里有精品99| 国产高清三级在线| 国产高清有码在线观看视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产久久久一区二区三区| 97在线视频观看| 色网站视频免费| 美女高潮的动态| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 欧美变态另类bdsm刘玥| av国产久精品久网站免费入址| 免费看a级黄色片| 97在线人人人人妻| 亚洲av一区综合| 日本-黄色视频高清免费观看| 日本黄色片子视频| 午夜激情久久久久久久| 三级经典国产精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品乱久久久久久| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品,欧美精品| 天堂网av新在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日本免费在线观看一区| 成人二区视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产毛片a区久久久久| 下体分泌物呈黄色| 免费av毛片视频| 亚洲无线观看免费| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲美女视频黄频| 18+在线观看网站| 2021少妇久久久久久久久久久| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩中字成人| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 三级国产精品欧美在线观看| 日本三级黄在线观看| 18禁在线播放成人免费| 欧美精品一区二区大全| 极品少妇高潮喷水抽搐| 69人妻影院| 午夜日本视频在线| 国产 一区 欧美 日韩| 在线观看国产h片| 三级国产精品欧美在线观看| av线在线观看网站| 观看美女的网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一区有黄有色的免费视频|