酮體對(duì)小鼠膿毒癥急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究

張家麗 佐拉木·買買提 于 虎

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是由多種因素引起的以腎功能快速下降為特征的臨床綜合征[1,2]。 AKI 是敗血癥和內(nèi)毒素血癥的常見并發(fā)癥,超過50%的敗血癥患者發(fā)展為AKI[3]。 與其他原因引起的AKI 比較,膿毒癥誘發(fā)AKI 的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜,死亡風(fēng)險(xiǎn)更高,住院時(shí)間更長(zhǎng),預(yù)后更差,目前仍缺乏有效的防治方法[3,4]。 越來(lái)越多的證據(jù)表明,膿毒癥過程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)誘發(fā)的氧化應(yīng)激增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致腎小球或腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞功能紊亂、脫落或凋亡,甚至大面積的死亡[5,6]。 許多臨床研究也支持氧化應(yīng)激損傷在膿毒癥誘導(dǎo)的腎功能進(jìn)展性衰竭中起了關(guān)鍵作用[7,8]。 因此降低膿毒癥腎臟的氧化應(yīng)激可能是膿毒癥相關(guān)AKI 治療的重要靶點(diǎn)。

酮體是人體生命活動(dòng)重要的替代能源,近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的驅(qū)動(dòng)因子發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[9]。 酮體包括β-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮,其中β-羥基丁酸占循環(huán)酮體水平的80%,也被證實(shí)是主要發(fā)揮功能的成分[9]。 有研究證實(shí),增加終末期心力衰竭患者酮體利用可以明顯改善心功能[10]。 也有研究發(fā)現(xiàn),對(duì)老年小鼠進(jìn)行生酮喂養(yǎng)可以減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷,最終表現(xiàn)出記憶和認(rèn)識(shí)能力的提升[11]。 臨床研究也證實(shí),給運(yùn)動(dòng)員賽前服用含酮飲料可以顯著增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[12]。 但鮮有研究觀察酮體對(duì)膿毒癥AKI 的作用。 本研究使用連續(xù)3 天酮脂灌胃增加體內(nèi)酮體濃度,通過腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠膿毒癥腎損傷,觀察酮體對(duì)于LPS 誘導(dǎo)的AKI是否具有保護(hù)作用并研究其可能的機(jī)制。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司;血酮試紙及血酮儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司;尿腎損傷分子-1(urinary kidney injury molecule-1,KIM-1)ELISA 檢測(cè)試劑盒(MKM100)購(gòu)自美國(guó)R&D System 公司;FOXO3A抗體(66428-1)、SOD2 抗體(20809-1)購(gòu)自中國(guó)Proteintech 公司;酮脂購(gòu)自美國(guó)MCE 公司,溶于水制備成100mg/ml 溶液4℃保存;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、 過氧化氫酶(catalase,CAT)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、尿微量白蛋白(urine microalbumin,UALb)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司。

2.動(dòng)物分組和模型建立：本研究符合《美國(guó)NIH實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用指南》 的規(guī)定,18 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠,體質(zhì)量為18.0 ～22.0g(約7 ～8 周齡),購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司。 將小鼠保持在無(wú)病原體的條件下,進(jìn)行22℃、12h/12h 光/暗循環(huán),自由獲取食物和水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組,每組6 只。 具體處理如下,實(shí)驗(yàn)組：對(duì)小鼠連續(xù)3 天,每天晨9：00 時(shí)灌胃酮脂(1mg/g);模型組：連續(xù)3 天灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。 實(shí)驗(yàn)組和模型組第3 天灌胃結(jié)束后30min 腹腔注射LPS(10mg/kg)以誘導(dǎo)膿毒癥AKI。對(duì)照組：連續(xù)3 天灌胃等量0.9% 氯化鈉溶液,第3天腹腔注射等量0.9% 氯化鈉溶液。 LPS 處理后24h,取小鼠膀胱尿、血和兩側(cè)腎組織,血液樣本4000r/min 離心10min 取上清,-80℃留存?zhèn)溆谩?左腎組織用4%多聚甲醛固定,右腎組織-80℃留存?zhèn)溆谩?/p>

3.腎功能指標(biāo)(SCr、BUN、UAIB/Cr 和KIM-1)檢測(cè)：參照試劑盒說(shuō)明測(cè)定各組小鼠血中SCr 和BUN水平,同樣參照說(shuō)明檢測(cè)尿液樣本中KIM-1 和UALb/Cr 水平。

4.腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)：取各組小鼠左腎,多聚甲醛固定和石蠟包埋后切3μm 厚的切片,HE 染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化,倒置顯微鏡下采用細(xì)胞水腫、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血對(duì)與腎組織相對(duì)應(yīng)的5 個(gè)區(qū)域的損傷程度進(jìn)行盲法評(píng)分。AKI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分5 個(gè)等級(jí)：0 分,正常腎組織;1 分,腎小管受損范圍＜25%;2 分,腎小管受損范圍≥25%且＜50%;3 分,腎小管受損范圍≥50% 且＜75%;4分,腎小管受損范圍≥75%。

5.氧化應(yīng)激水平檢測(cè)：各組小鼠分別取20mg 腎臟,按照試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行MDA 含量,SOD、GSH和CAT 活性測(cè)定。 BCA 法定量校正蛋白后得到MDA 含量(nmol/mg)、SOD 活性(U/g)、GSH 活性(U/g)和CAT 活性(U/g)。

6.從腎組織中提取總蛋白,用BCA 蛋白濃度試劑盒進(jìn)行蛋白定量后將蛋白變性,將含有30μg 蛋白質(zhì)的樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h 后,分別用FoxO3a 一抗(1∶1000)和SOD2(1∶10000)一抗在4℃下孵育過夜,次日,TBST 洗膜3 次,加入熒光兔二抗(1∶10000)溶液室溫?fù)u床孵育1h,TBST 洗膜3 次后進(jìn)行顯影。用Image J 測(cè)得FoxO3a 和SOD2 灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH 灰度值之比作為相對(duì)表達(dá)值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,使用非配對(duì)雙尾Student t檢驗(yàn)對(duì)兩組之間計(jì)量資料進(jìn)行分析,使用重復(fù)測(cè)量單因素方差分析結(jié)合Sidak檢驗(yàn)對(duì)成組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.酮體對(duì)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠腎功能和組織結(jié)構(gòu)的影響：與對(duì)照組比較,模型組小鼠BUN、SCr、UALB/Cr 和KIM-1 水平均顯著升高(P＜0.001,圖1 中B ～E)。 實(shí)驗(yàn)組血β-羥基丁酸濃度明顯高于對(duì)照組和模型組(P＜0.001,圖1A)。 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組BUN 和SCr 水平及UALB/Cr 和KIM-1 水平均有所降低(P＜0.001,圖1 中B ～E)。 同樣,各組小鼠腎臟組織學(xué)改變與腎功能結(jié)果一致,模型組小鼠腎組織損傷明顯,表現(xiàn)為明顯的腎小球壞死、空泡樣變性,腎間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1F),腎損傷評(píng)分高于對(duì)照組(P＜0.001,圖1G)。與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠腎損傷程度有所改善(圖1F),腎損傷評(píng)分降低(P＜0.001,圖1G)。

圖1 各組小鼠腎功能指標(biāo)和腎組織病理結(jié)構(gòu)

2.酮體對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷氧化應(yīng)激的影響：與對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織MDA 含量顯著上升(P＜0.001,圖2A),其余抗氧化酶,包括SOD、GSH 和CAT 活性均明顯下降(P＜0.001,圖2中B ～D)。 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織MDA含量較低(P＜0.001,圖2A),SOD、GHS 和CAT 活性均有一定恢復(fù)(P＜0.001,圖2 中B ～D)。

圖2 各組小鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)

3.酮體對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷FoxO3a 和SOD2 蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織中FoxO3a 和SOD2 蛋白水平均明顯下降(P＜0.001)。 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠腎組織FoxO3a和SOD2 蛋白表達(dá)有所上升(P＜0.001),詳見圖3。

圖3 蛋白免疫印跡檢測(cè)各組小鼠腎組織中FoxO3a 和SOD2 的表達(dá)

討 論

AKI 是一種以血肌酐水平快速升高和腎臟排泄功能突然喪失為特征的復(fù)雜臨床綜合征,已被視為與高發(fā)生率和高病死率相關(guān)的重大公共衛(wèi)生問題[13]。全球范圍內(nèi),住院或重癥監(jiān)護(hù)病房患者的AKI 患病率相當(dāng)驚人[4,13]。 盡管腎臟替代療法已取得相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步,但大多數(shù)患者仍然面臨嚴(yán)重腎功能損害[2,4]。值得注意的是,敗血癥被看做是危重患者AKI 的重要觸發(fā)器。 大量研究表明,膿毒癥誘導(dǎo)的AKI 腎功能變化更明顯,腎臟組織學(xué)變化更劇烈,總體病死率更高[2,14]。 因此,迫切需要制定有效的治療策略來(lái)緩解這一嚴(yán)重臨床癥狀并改善預(yù)后。

本研究通過腹腔注射LPS 誘導(dǎo)小鼠膿毒癥后,小鼠腎小球?yàn)V過功能指標(biāo)BUN 和SCr 和腎小管損傷指標(biāo)KIM-1 都明顯增高,提示AKI 的發(fā)生[16,17]。HE 染色也顯示腎組織結(jié)構(gòu)的破壞,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡,小管內(nèi)可見散在鑄型和脫落細(xì)胞及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,15]。 本研究中酮脂灌胃的小鼠上述指標(biāo)和腎臟結(jié)構(gòu)都趨于正常,明確了酮體對(duì)膿毒癥腎損傷的保護(hù)作用。 此外,大量研究已經(jīng)證明活性氧爆發(fā)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是AKI 發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[6,18]。 在生理?xiàng)l件下,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與抗氧化防御處于平衡,當(dāng)活性氧生成過多時(shí),抗氧化通路被激活以清除增多的活性氧,以維持細(xì)胞正常功能,其中SOD、CAT 和GSH 都是胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)[5,6]。 本研究發(fā)現(xiàn),LPS 處理的小鼠腎組織內(nèi)上述幾種抗氧化酶活性均顯著下降,脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA 含量也明顯增加。 因此,減輕腎臟氧化應(yīng)激可能對(duì)急性腎損傷起到保護(hù)作用。

近年來(lái),酮體作為信號(hào)分子,在調(diào)節(jié)蛋白翻譯后修飾以及炎癥和氧化應(yīng)激過程中的重要作用備受關(guān)注[9,19]。 β-羥基丁酸是循環(huán)血中酮體的主要形式,生理?xiàng)l件下,人血液中β-羥基丁酸濃度維持在0.02 ～0.10mmol/L,禁食48 ～72h 可提升至2 ～3mmol/L,更長(zhǎng)時(shí)間的禁食或生酮喂養(yǎng)會(huì)進(jìn)一步增加其至5 ～8mmol/L[9,10]。 有研究發(fā)現(xiàn),在人胚胎腎細(xì)胞,β-羥基丁酸可以通過促進(jìn)組蛋白乙?；瘉?lái)增加抗氧化基因的表達(dá),從而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激[20]。 也有研究發(fā)現(xiàn),β-羥基丁酸可以通過增加谷胱甘肽過氧化氫酶活性對(duì)缺血性腦卒中起到保護(hù)作用[11]。 總之,酮體已經(jīng)在細(xì)胞、動(dòng)物和在體層面都顯示出相當(dāng)?shù)囊嫣?但尚未研究觀察酮體對(duì)膿毒癥急性腎損傷的影響。因此本研究通過灌胃酮脂升高小鼠血酮濃度并且改善了小鼠腎功能和腎損傷,同時(shí)伴隨抗氧化酶活性的提高,更重要的是發(fā)現(xiàn)抗氧化通路FoxO3a 及下游靶蛋白SOD2 表達(dá)的增強(qiáng),從而介導(dǎo)腎臟抗氧化應(yīng)激,這與既往研究結(jié)果一致[20]。

綜上所述, 酮體可以通過促進(jìn)抗氧化通路FoxO3a 和SOD2 的表達(dá),減輕氧化應(yīng)激損傷來(lái)防止腎功能惡化和腎組織的破壞。 本研究也存在一定的不足,酮體上調(diào)FoxO3a 和SOD2 表達(dá)的具體機(jī)制,還需要進(jìn)行更深層次地驗(yàn)證。