睪丸細(xì)胞自噬及相關(guān)信號通路研究進(jìn)展

劉晨笑 許亞輝 劉殿龍 郭 健

自噬是一種高度保守的細(xì)胞分解代謝機(jī)制,是指胞質(zhì)中受損的蛋白或細(xì)胞器被溶酶體降解、再利用的過程,這是細(xì)胞質(zhì)成分降解和回收的基本形式,也是應(yīng)對外界環(huán)境壓力時重要的細(xì)胞反應(yīng),對于維持細(xì)胞存活和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。 自噬具有雙面性,正常情況下,絕大多數(shù)細(xì)胞都存在利于生長存活的基礎(chǔ)水平的自噬,但當(dāng)細(xì)胞長期處于饑餓、氧化應(yīng)激或炎癥狀態(tài)時,自噬就會被異常激活,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能紊亂和毒性反應(yīng),從而加速細(xì)胞的程序性死亡,即“自噬性死亡”[1]。

睪丸是男性的主要性器官,由曲細(xì)精管和間質(zhì)細(xì)胞組成,其中曲細(xì)精管又包括支持細(xì)胞(sertoli cells,SCs)和生精細(xì)胞。 SCs 是構(gòu)成血-睪屏障的重要結(jié)構(gòu),緊鄰生精細(xì)胞,為生精提供穩(wěn)定的環(huán)境和營養(yǎng)支持;間質(zhì)細(xì)胞可分泌睪酮,缺乏會造成生精細(xì)胞大量死亡。 自噬活動在睪丸中非?；钴S,尤其是SCs 和間質(zhì)細(xì)胞,自噬過度或不及均會影響睪丸功能和精子的正常發(fā)生,甚至影響生殖。 目前,自噬作為一個熱門方向在各類疾病中被廣泛研究,現(xiàn)就睪丸細(xì)胞自噬及相關(guān)信號通路進(jìn)行綜述。

一、自噬概述

自噬根據(jù)胞質(zhì)中底物降解途徑的不同分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。 其中巨自噬是生物體內(nèi)最普遍、研究最廣泛的自噬方式,是指胞質(zhì)內(nèi)受損的蛋白或細(xì)胞器被源于高爾基體的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬小體,隨后與溶酶體融合并被其降解的過程。 本文所指的自噬均為巨自噬。

1.自噬活動中重要的結(jié)點(diǎn)蛋白：ULK1 是酵母自噬相關(guān)基因1(autophagy-related gene1,ATG1)的哺乳動物同源基因,與ATG13、FIP200 和ATG101 結(jié)合形成ULK 復(fù)合體來啟動自噬,ULK1 基因缺失可嚴(yán)重抑制自噬。 ULK1 上有多個磷酸化位點(diǎn),其上游的多種信號分子,如AMPK、mTOR、ROS 等,可通過相應(yīng)位點(diǎn)激活或抑制ULK1,從而啟動或抑制自噬[2]。

Beclin-1 是ATG6/Vps30 的哺乳動物同源基因,是ULK1 的直接靶點(diǎn),被激活后介導(dǎo)其他自噬蛋白定位到自噬前體,參與自噬小體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成。 人類Beclin-1 包含3 個結(jié)構(gòu)域,即Bcl-2 結(jié)合部位(Bcl-2-homology-3,BH3)、螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain,CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain,ECD),自噬調(diào)控蛋白可與Beclin-1 的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而促進(jìn)或抑制自噬[3]。

LC3 是ATG8 的哺乳動物同源基因,位于自噬體膜,與PE 結(jié)合后參與自噬體膜的形成[4]。 其在細(xì)胞中有兩種存在形式,自噬發(fā)生時,pro-LC3 被ATG4切掉C 端120 個氨基酸形成胞質(zhì)型LC3(LC3-Ⅰ),隨后被APG7L/ATG7 激活,并與PE 結(jié)合形成LC3-PE(LC3-Ⅱ),附著于自噬體膜上[4];自噬過程中,LC3-Ⅱ與泛素化的目標(biāo)底物結(jié)合并被自噬體包裹;自噬完成后,自噬體外的LC3-Ⅱ被ATG4B 脂化重新形成LC3-Ⅰ,并回收、利用,自噬體內(nèi)者則隨內(nèi)容物一起降解。 LC3-Ⅱ是自噬成熟的標(biāo)志,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ用以評估自噬通量的高低[5]。

自噬相關(guān)蛋白(autophagy related genes,ATG)是一類調(diào)控自噬起始、自噬體形成以及自噬體與溶酶體融合過程的功能蛋白質(zhì),如ATG13 參與自噬啟動,ATG14 參與雙層膜結(jié)構(gòu)的形成,ATG12、ATG16 促進(jìn)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的延伸,ATG5 促進(jìn)雙層膜結(jié)構(gòu)閉合等[6]。

2.自噬的過程：自噬是由前自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)隔離細(xì)胞質(zhì)成分、蛋白聚集物或細(xì)胞器,最終閉合形成自噬小體。 其過程大概分為5 個階段：(1)啟動：在應(yīng)激情況下,ULK1 發(fā)生去磷酸化,招募ULK2、ATG13、FIP200 等前體蛋白形成ULK1 復(fù)合體,啟動自噬。 (2)雙層膜結(jié)構(gòu)的形成：活化的ULK1 復(fù)合體激活下游Beclin-1,p-Beclin-1 激活脂酶Vps34,同時Beclin-1 與Ⅲ型PI3K 結(jié)合,并募集Vps15、ATG14 形成Vps34-Vps15-Beclin-1 復(fù)合物,誘導(dǎo)雙層膜結(jié)構(gòu)形成。 (3)雙層膜結(jié)構(gòu)的延伸：ATG12、ATG5、ATG16 募集更多的自噬相關(guān)蛋白定位于前自噬體,同時LC3-Ⅰ與PE 結(jié)合形成LC3-Ⅱ,定位于雙層膜的內(nèi)外兩側(cè),促進(jìn)雙層膜結(jié)構(gòu)的延伸[7]。 (4)自噬小體的形成：泛素化底物(目標(biāo)廢棄物)與LC3-Ⅱ特異性結(jié)合,雙層膜結(jié)構(gòu)不斷延伸,最終將底物徹底包裹形成自噬小體。 (5)自噬小體的降解：自噬小體與溶酶體融合,溶酶體釋放大量蛋白水解酶將其降解,完成自噬。

二、睪丸內(nèi)的自噬通路

自噬在睪丸中十分活躍,該過程涉及多個分子和信號通路,根據(jù)對自噬的調(diào)控方向,分為正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控,分別對自噬起到促進(jìn)和抑制的作用。 在睪丸內(nèi)涉及的主要通路有幾下幾種。

1.抑制睪丸細(xì)胞自噬的信號通路：PI3K/Akt/mTOR 信號通路是研究最為廣泛的一條自噬通路,其經(jīng)典過程為細(xì)胞信號分子與細(xì)胞膜受體及受體底物結(jié)合后激活PI3K,使得PIP 和PIP2 磷酸化,形成PIP2和PIP3,PIP3 磷酸化Akt,p-Akt 可激活mTORC1,進(jìn)而磷酸化ULK1、ATG13、ATG14 等蛋白以阻止ULK復(fù)合體和Beclin-1 復(fù)合體的形成,從而抑制自噬的啟動。 另外,Ⅰ型PI3K 的p110α 亞基還可以通過Nrf2-ARE 依賴的途徑促進(jìn)細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng),調(diào)控ROS 的水平,從而激活A(yù)kt,起到抑制自噬的作用[8]。Huang 等[9]研究發(fā)現(xiàn),黃曲霉素B1 可抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路,誘導(dǎo)睪丸組織過度自噬,造成睪丸損傷和精子質(zhì)量下降。 Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn),ZEA 可通過抑制該信號通路來誘發(fā)自噬來逆轉(zhuǎn)ZEA引發(fā)的細(xì)胞周期停滯。 Zhu 等[11]研究發(fā)現(xiàn),ROS 積累可抑制該信號通路來誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞過度自噬,促進(jìn)死亡。 目前在生精細(xì)胞中尚無相關(guān)研究。

2.促進(jìn)睪丸細(xì)胞自噬的信號通路

(1)腺苷酸激活蛋白激酶信號通路：腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是觸發(fā)自噬的關(guān)鍵上游調(diào)控因子,它主要受細(xì)胞能量水平調(diào)控,當(dāng)細(xì)胞缺氧或ATP 消耗過量時,AMP 可催化2 個ADP 形成1 個AMP 和1 個ATP,使得胞內(nèi) AMP/ATP 比值增高, 進(jìn)而激活A(yù)MPK,AMPK 通過磷酸化TSC2 和Raptor 來抑制mTORC1 的活化,同時激活下游的ULK1 來誘發(fā)自噬[12]。 此外,AMPK 還可以直接激活ULK1 的多個位點(diǎn)(如S317、S555 和S777 等)來引發(fā)自噬[13]。 既往研究發(fā)現(xiàn),在SCs、間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞中,激活A(yù)MPK信號通路可促進(jìn)自噬發(fā)生,防止有害刺激致細(xì)胞進(jìn)一步受損,減輕生殖損傷[14～16]。

(2)PRR 信號通路：自噬在控制細(xì)菌感染和促進(jìn)天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,啟動免疫的信號分子又可以通過一系列途徑來激活自噬,自噬與免疫相互調(diào)節(jié), 共同抵御病原微生物的入侵。 PRR 信號通路與自噬相關(guān),但目前在睪丸中的作用機(jī)制研究甚少,可作為今后的一個研究方向。 TLR 是第一個被證明參與自噬的PRR。 TLR4 可以啟動天然免疫反應(yīng),TRAF6 是TLR4 信號通路中的關(guān)鍵分子,能夠通過招募Beclin-1 來誘發(fā)自噬。 TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 能識別病毒核酸,其下游的信號轉(zhuǎn)接分子MyD88 也能與Beclin-1 結(jié)合來介導(dǎo)自噬。 Marina等[17]研究證實(shí)了TLR 在SCs 中的存在,但未闡明其與自噬的相互作用,在間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中的作用尚無研究。

NOD1 可在大鼠SCs 中表達(dá),Hayrabedyan 等[18]提出,NOD1 可促進(jìn)IL-1β 前抑制和自噬體成熟阻滯,NOD2 可促進(jìn)caspase-1 激活、IL-1β 分泌和自噬成熟, 但具體機(jī)制仍有待于深入研究。 Hayrabedyan 等[18]還指出,SCs 能夠利用NALP3 炎性小體和caspase-1 在生理環(huán)境中產(chǎn)生IL-1β,IL-1β能夠靶向與溶酶體結(jié)合并降解,引發(fā)自噬。 其在間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中與自噬活動的相互作用尚無明確說法。

NF-κB 對自噬活動具有雙向調(diào)節(jié)作用。 一方面, TNF-α 誘導(dǎo)NF-κB 的激活可抑制細(xì)胞自噬,如在NF-κB 缺乏的細(xì)胞中,TNF-α 可導(dǎo)致ROS 積累誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。 另一方面,NF-κB 又可以誘導(dǎo)自噬,如NF-κB 可與Beclin-1 基因啟動子的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而引發(fā)自噬。 Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn),ANKRD49 蛋白在各級生精細(xì)胞的核中大量表達(dá),可通過激活NF-κB 來增強(qiáng)自噬,提供能量,對饑餓狀態(tài)的細(xì)胞具有保護(hù)作用。 目前該通路在SCs 和間質(zhì)細(xì)胞中的自噬作用還有待于進(jìn)一步研究。

(3)CAMP/PKA 信號通路：CAMP/PKA 信號通路是一種由G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的從胞外到核內(nèi)的經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)通路,可在能量危機(jī)期間維持細(xì)胞存活。 其調(diào)控自噬的方式為：胞外信號與G 蛋白受體結(jié)合,激活腺苷酸環(huán)化酶,將胞外信號傳遞至胞內(nèi),進(jìn)而產(chǎn)生第二信使cAMP。 cAMP能夠與PKA 的兩個催化亞基(PKA-c)結(jié)合,使得兩個調(diào)節(jié)亞基(PKA-r)解離并進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而激活下游靶蛋白CREB,活化的CREB 在CBP 的協(xié)助下激活自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。 Bhattacharya 等[20]研究發(fā)現(xiàn)了睪丸SCs 中cAMP 的大量存在,但并未說明該信號通路與自噬的關(guān)系。 目前在間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中尚無明確研究。

(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)是誘導(dǎo)自噬的一條重要途徑,一些生理、病理應(yīng)激,如聚集傾向蛋白、缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外排等,均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊障礙,從而引起ER stress,而ER stress正是通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)來激活自噬,UPR 負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),由3 種跨膜蛋白調(diào)控,即IRE1α、PERK 和ATF-6,其中ATF-6 可直接誘導(dǎo)DAPK1 表達(dá),進(jìn)而啟動多種途徑增加自噬通量[21]。 既往研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境刺激可激活ER stress,進(jìn)而直接或間接地引起SCs、間質(zhì)細(xì)胞及生精細(xì)胞的自噬活動,介導(dǎo)對細(xì)胞的保護(hù)作用,防止細(xì)胞過度凋亡,維持男性生殖能力[22～24]。

3.雙向調(diào)節(jié)睪丸細(xì)胞自噬的信號通路

(1)絲裂原活化蛋白激酶信號通路：絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一組進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,介導(dǎo)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 該通路包含一組三級磷酸化依賴的激酶, 即 MAPK、 MAPK 激酶(MEK 或者 MKK)、MAPK 激酶的激酶(MEKK 或者M(jìn)KKK),其激活順序?yàn)镸KKKs 磷酸化并激活MEKs,進(jìn)而激活MAPK,完成胞內(nèi)外信號的傳遞。 經(jīng)典的MAPK 通路主要包括ERK、JNK 及p38 激酶,其誘發(fā)睪丸自噬的機(jī)制如下：ERK 可被生長因子、激素及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等刺激激活,其激活途徑為Ras→Raf→MEK1/2 激酶→ERK1/2。 活化的Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路不僅能通過Ras 或ERK 激活自噬,而且能通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(如LC3、p62)的表達(dá),直接誘導(dǎo)自噬發(fā)生[25]。 JNK 是MAPK 中的應(yīng)激活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,可被環(huán)境應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子、G 蛋白偶聯(lián)受體和生長因子等刺激所激活,隨后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi),并通過多種途徑誘發(fā)自噬：一方面,它能夠磷酸化Bcl-2d 的多個位點(diǎn),促使Bcl-2 競爭性結(jié)合Bcl-2/Bcl-xL,破壞Bcl-2/Beclin-1 復(fù)合物,釋放出Beclin-1,游離的Beclin-1 能有效誘導(dǎo)自噬[26];JNK 又可以磷酸化c-Jun N 端的第63 和73 位點(diǎn),增加c-Jun 轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)Beclin-1 的表達(dá),提高自噬水平;另一方面,JNK 能上調(diào)調(diào)控?fù)p傷的自噬調(diào)節(jié)劑DRAM,調(diào)控自噬溶酶體融合成為自噬體并在細(xì)胞內(nèi)積聚,從而促進(jìn)自噬[27]。

p38 是一類酪氨酸激酶,具有4 種不同的亞型：p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK12)、p38δ(MAPK13)。 p38 信號通路對自噬具有促進(jìn)和抑制的雙重調(diào)控作用。 其中p38α 亞型能夠通過磷酸化ATG5, 抑制自噬泡延伸,阻止LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ,同時下調(diào)ERK 活性, 從而起到顯著降低細(xì)胞自噬水平的作用。

Duan 等[28,29]研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激反應(yīng)可激活JNK 通路來促進(jìn)SCs 自噬,這種自噬機(jī)制可防止后續(xù)有害因素進(jìn)一步損傷細(xì)胞,然而自噬過度也會損傷生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,影響生殖。 Ma 等[30]研究發(fā)現(xiàn),激活p38 MAPK 信號通路可顯著降低SCs 的自噬水平,導(dǎo)致BTB 功能受損,影響生育能力。 目前在間質(zhì)細(xì)胞中尚無明確的研究。

(2)p53/mTOR 信號通路：p53/mTOR 信號通路是介導(dǎo)自噬反應(yīng)的常見通路。 在細(xì)胞核中,p53 主要通過激活DRAM 和AMPK 來誘導(dǎo)自噬。 其中DRAM是p53 的靶基因,可編碼溶酶體蛋白,表達(dá)后可誘導(dǎo)自噬體聚集,而p53 可以直接激活DRAM 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[31]。 p53 激活A(yù)MPK 通過兩種方式,一則通過激活A(yù)MPK 的β1 和β2 亞單位從而活化AMPK,二則誘導(dǎo)Sestrin1/Sestrin2 表達(dá)并與AMPK 的α 亞基相互作用來磷酸化AMPK 的Thr172,從而激活A(yù)MPK,之后抑制mTOR,啟動自噬[32]。 在細(xì)胞質(zhì)中,基礎(chǔ)水平的p53 即可起到抑制作用,這種作用是通過抑制AMPK活性和激活mTOR 來實(shí)現(xiàn)的,但是p53 抑制AMPK 活性的作用機(jī)制仍未明確。 Tian 等[33]研究發(fā)現(xiàn),p53磷酸化可引起生精細(xì)胞自噬,但Wei 等[34]卻在busulfan 干預(yù)精原祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)p53 缺失可導(dǎo)致mTOR 信號通路被抑制,誘發(fā)自噬,也說明了p53信號通路的雙重調(diào)控作用。 目前在SCs 和間質(zhì)細(xì)胞中的作用還鮮有報(bào)道。

三、展 望

自噬活動在睪丸中非?；钴S,并且調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜,雖然啟動自噬體形成的分子機(jī)制已經(jīng)明確,但誘發(fā)睪丸細(xì)胞自噬的相關(guān)信號通路的研究仍存在缺漏,例如PI3K/Akt/mTOR 信號通路是否在生精細(xì)胞中發(fā)揮抑制自噬的作用、cAMP/PKA 和p53 信號通路是否在間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)自噬的作用、RLR 和DNA 感受器是否與各睪丸細(xì)胞自噬活動存在相互關(guān)系等問題還尚不明確,并且除前文中提到的通路外,可能還存在更多未知的信號通路或調(diào)控機(jī)制,例如男性雌激素升高是否會引起睪丸細(xì)胞自噬等,這都是今后探索的方向。

此外,睪丸是男性的主要生殖器官,也是精子產(chǎn)生的部位,自然與生殖能力的強(qiáng)弱密切相關(guān),睪丸中正?；虍惓５淖允苫顒佣伎赡軐ι彻δ墚a(chǎn)生有利或不良的影響。 據(jù)了解,正常范圍的自噬可作為一種細(xì)胞存活機(jī)制,調(diào)控睪丸功能,而自噬過度則會導(dǎo)致Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡或自噬性細(xì)胞死亡,引起SCs、間質(zhì)細(xì)胞或生精細(xì)胞損傷,影響睪丸功能,最終影響生殖,如饑餓、營養(yǎng)缺乏等刺激會促進(jìn)睪丸自噬來提供能量,氧化應(yīng)激、激素紊亂等刺激會促進(jìn)睪丸自噬來穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境,從而維持SCs、間質(zhì)細(xì)胞或生精細(xì)胞的正常功能,促進(jìn)精子的正常發(fā)生,從而維持相對正常的生殖能力;如果有害刺激過量,如ROS 積累過多,則會導(dǎo)致過度自噬,引發(fā)睪丸細(xì)胞程序性死亡,造成睪丸功能障礙,從而影響生殖;反之,若自噬不及則會造成睪丸細(xì)胞周期停滯,影響細(xì)胞增殖,也會造成睪丸功能障礙,影響生殖。 由此可見,睪丸中的自噬水平對男性生殖功能具有重要意義,但目前對于兩者之間的關(guān)系尚無明確報(bào)道,需要進(jìn)一步探索。

綜上所述,自噬是研究睪丸組織生理病理機(jī)制的一條重要思路,隨著未來對自噬及其信號通路的深入研究,靶向干預(yù)自噬調(diào)控分子有望成為預(yù)防和治療睪丸功能異常的新策略,從而為臨床治療男性生殖障礙等相關(guān)疾病提供新方法。