基于腸干細(xì)胞治療膿毒癥腸屏障功能障礙的研究進(jìn)展

梁 群 賈 璇 潘 郭海容 田 圓 王瀚黎

膿毒癥是由于感染引起宿主免疫失調(diào)反應(yīng)而導(dǎo)致臟器功能衰竭的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),亦是引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS) 的主要原因。 每年罹患膿毒癥的患者為(1900 ～4890)萬,發(fā)生率和病死率持續(xù)上漲,約占全球死亡人數(shù)的20%,是全球性的健康危機[1]。 長期以來,腸道一直被認(rèn)為是膿毒癥MODS 的發(fā)動機,腸道受損后,內(nèi)毒素從腸內(nèi)轉(zhuǎn)移到循環(huán)中,加重膿毒癥[2,3]。 因此,探究膿毒癥相關(guān)腸功能損傷機制及基于腸干細(xì)胞(intestinal stem cell,ISCs)治療膿毒癥腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的方法,對提高膿毒癥患者治愈率及改善預(yù)后生存質(zhì)量具有現(xiàn)實意義。

正常腸黏膜屏障由機械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障構(gòu)成,對維持機體正常運轉(zhuǎn)起重要作用。膿毒癥導(dǎo)致腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列病理生理變化：腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞,分泌產(chǎn)生腸道蛋白水解酶,腸微生物群組成改變,上皮通透性增加,黏膜機械、化學(xué)屏障功能受損,腸內(nèi)毒素穿過腸屏障到達(dá)其他無菌器官定植、過度生長,生物屏障結(jié)構(gòu)改變,引發(fā)感染,破壞免疫屏障,出現(xiàn)SIRS、MODS,危及患者生命。

一、腸干細(xì)胞概述

腸干細(xì)胞(intestinal stem cell,ISCs)是一種未分化且具有高核質(zhì)比的隱窩底部柱狀細(xì)胞(crypt base columnar cells,CBC),因其具有增殖、再生、轉(zhuǎn)化為分化細(xì)胞和產(chǎn)生組織的能力一直備受關(guān)注。 干細(xì)胞區(qū)域的組成包括：位于隱窩底部+1 ～+3 位置、 +4 位置的CBC 以及潘氏(Paneth)細(xì)胞[4]。 +4 位置的細(xì)胞長時間呈現(xiàn)類靜止?fàn)顟B(tài),作為功能性干細(xì)胞貯備庫,在組織損傷或CBC 缺失情況下激活其“干性”,再次進(jìn)入分裂狀態(tài);Paneth 細(xì)胞通過維持ISCs 生態(tài)位影響其增殖、分化[5]。 Paneth 細(xì)胞和+4 位置CBC 共同維持ISCs 動態(tài)平衡。

根據(jù)特性可將ISCs 分為兩大群體：活躍增殖的aISC(actively proliferating intestinal stem cell)和緩慢增殖的儲備rISC(reserve or more quiescent intestinal stem cell)[6]。 有實驗表明,腸道周轉(zhuǎn)率很大程度上取決于ISCs 的自我更新,即細(xì)胞在活躍循環(huán)和靜止表型之間的轉(zhuǎn)換,aISC 介導(dǎo)正常情況下的腸上皮更新,rISC 在組織損傷時完成特定再生任務(wù)[7]。

ISCs 具有兩個顯著特點,一是產(chǎn)生多譜系分化的子代細(xì)胞,二是長期保持自我更新。 ISCs 產(chǎn)生一個高度增殖的轉(zhuǎn)擴細(xì)胞池,細(xì)胞向上遷移到絨毛,并分化為兩個主要的細(xì)胞譜系,用于吸收食物的吸收系細(xì)胞和用于分泌激素的分泌系細(xì)胞[8]。 正常情況下,腸上皮細(xì)胞通過ISCs 分化的子代細(xì)胞,每3 ～5天更新一次;當(dāng)腸道受損時,即使ISCs 數(shù)量減少,若Paneth 細(xì)胞和+4 位置CBC 受損相對較輕,依然能夠恢復(fù)腸道功能,維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。 在修復(fù)腸上皮的過程中,Paneth 細(xì)胞通過Wnt 配體與Frizzled 受體及其共受體復(fù)合物低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6 結(jié)合,與T 淋巴細(xì)胞因子相互作用,識別下游的靶基因,激活rISC,使其“休眠”狀態(tài)轉(zhuǎn)為活躍狀態(tài),加速修復(fù)腸上皮黏膜,通過恢復(fù)上皮細(xì)胞更新,完成ISCs 生態(tài)位重建[9]。 與此同時,Notch 信號對腸道祖細(xì)胞的增殖和分化有調(diào)節(jié)功能,通過作用于olfactomedin4 基因,抑制轉(zhuǎn)錄因子Atoh1 表達(dá),引導(dǎo)祖細(xì)胞分化,增加其數(shù)量,達(dá)到滿足ISCs 增殖的目的[10]。

在ISCs 增殖、分化和凋亡的過程中,受到腸道多重信號的影響,依賴于不同信號途徑的相互作用,以維持ISCs 的穩(wěn)態(tài),各通路交織成為信號通路網(wǎng),調(diào)控ISCs 的增殖和分化,使腸道內(nèi)各細(xì)胞群處于穩(wěn)定狀態(tài)。

二、膿毒癥相關(guān)腸屏障功能障礙

膿毒癥對相關(guān)腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的影響主要包括兩個方面,其一是膿毒癥引起細(xì)胞凋亡、壞死,最終導(dǎo)致腸缺血,誘發(fā)壞死性IBDF;其二是感染造成的炎性反應(yīng)損傷黏膜上皮,增加腸黏膜通透性,造成持續(xù)進(jìn)行性IBDF。

1.壞死性IBDF：膿毒癥對腸屏障功能損傷分3個階段推進(jìn)。 第1 階段損傷是內(nèi)臟灌注不足或缺血;第2 階段損傷是復(fù)蘇期間腸血流的恢復(fù),導(dǎo)致缺血-再灌注損傷;第3 階段損傷是腸屏障功能的喪失,出現(xiàn)腸系膜微循環(huán)障礙,造成壞死性損傷。 膿毒癥主要病理機制是“招募”炎性細(xì)胞,產(chǎn)生過度促炎反應(yīng)[11]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖以及損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),包括線粒體DNA、高流動性組蛋白B1 和血清淀粉樣蛋白A 等,導(dǎo)致腸內(nèi)皮黏附因子水平隨中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增加而上調(diào),這些一線防御細(xì)胞在腸道中產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子,引發(fā)炎性反應(yīng),引起細(xì)胞大量凋亡和壞死,導(dǎo)致腸道血液灌注不足及回流障礙,引起腸缺血性損傷[12]。 腸道局部缺血早期始于表層,后向腸壁深部發(fā)展,腸系膜血流量突然減少或中斷,破壞腸內(nèi)動態(tài)平衡,近端循環(huán)中內(nèi)臟血流量的減少導(dǎo)致深度缺血,甚至誘發(fā)腸局部壞死,形成不可逆的缺血性IBDF。

2.進(jìn)行性IBDF：病原相關(guān)分子入血后,啟動病原相關(guān)分子模式,脂多糖結(jié)合蛋白識別LPS,并與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合,活化NF-κB、MAPK 信號通路,引起級聯(lián)反應(yīng),釋放大量的炎性介質(zhì),發(fā)生炎性反應(yīng)[13]。 重癥患者機體防御系統(tǒng)本就脆弱,在這種情況下,機體防御系統(tǒng)“重新編程”,既無法消除原發(fā)感染,也無法防止繼發(fā)感染[14]。 凋亡和壞死機制損害黏膜上皮,導(dǎo)致DAMPs 進(jìn)一步釋放,這種惡性循環(huán)延續(xù)到后續(xù)的炎性反應(yīng)中,導(dǎo)致潰瘍和出血增加,使黏膜穩(wěn)態(tài)失衡加劇[15]。 黏膜穩(wěn)態(tài)失衡,異常激活腸道免疫細(xì)胞,改變控制細(xì)胞間緊密連接的調(diào)節(jié)因子[16]。膿毒癥大鼠模型中,可以觀察到緊密連接蛋白和封閉蛋白claudin-1、3、4、5 和8 重新排布,腸上皮內(nèi)緊密連接蛋白和內(nèi)皮屏障功能調(diào)節(jié)因子zonulin-1 超微結(jié)構(gòu)中斷,腸道通透性增加,腸內(nèi)相關(guān)致病因子大量易位,由此產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子,發(fā)生局部腸道炎性反應(yīng)[17]。 微循環(huán)再灌注恢復(fù)后,腸道內(nèi)DAMPs 首先被吸收到腸系膜淋巴系統(tǒng),經(jīng)由腸系膜淋巴管排入乳糜池,在左鎖骨下靜脈進(jìn)入體循環(huán)[18]。 肺動脈是DAMPs 經(jīng)由腸系膜淋巴管到達(dá)的第一個血管,因此,肺也是膿毒癥患者最常見的受累器官;DAMPs 進(jìn)入體循環(huán)后,全身細(xì)胞-趨化因子反應(yīng)的過度釋放,造成急性腎損傷;線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致肝衰竭[19]。 由此,膿毒癥造成持續(xù)進(jìn)行性IBDF 的同時,也伴隨各器官的急性損傷,造成MODS 甚至多器官功能衰竭,反向加速膿毒癥進(jìn)展[20,21]。

三、膿毒癥對ISCs、IBFD 影響及相關(guān)治療

膿毒癥對ISCs 及IBFD 影響主要涵蓋兩個基礎(chǔ)點：炎性細(xì)胞因子通過信號通路影響ISCs 活性,降低其修復(fù)黏膜損傷速度;灌注不足造成腸缺血性損傷影響ISCs 數(shù)量,加重黏膜損傷程度。 因此,可以基于以上兩點探究膿毒癥相關(guān)IBFD 的ISCs 靶向治療模式。

1.炎性細(xì)胞因子影響ISCs 活性：炎性細(xì)胞因子通過信號通路影響ISCs 活性。 PI3K/Akt 通路是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶家族,可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活率,在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用;Hippo 通路對于調(diào)控組織器官的大小和生長至關(guān)重要,YAP 蛋白作為Hippo通路中的核心因子,控制生物器官發(fā)育和調(diào)控細(xì)胞生長[22,23]。

膿毒癥期間,腸道中內(nèi)毒素刺激PI3K/Akt 通路,誘導(dǎo)產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇,Hippo/YAP 信號通路活性被其抑制,當(dāng)Hippo 信號失活時,LATS1/2 激酶失活,YAP 蛋白不能被磷酸化,YAP 蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核,結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄靶基因的表達(dá),降低ISCs 增殖分化速度,導(dǎo)致黏膜修復(fù)速度減緩,加重腸道受損程度、加劇膿毒癥病情發(fā)展[24]。

同時,炎性細(xì)胞因子通過改變ISCs 對稱分裂模式影響其活性[25]。 ISCs 在爭奪生態(tài)位空間、加速增殖分化時主要發(fā)生對稱分裂,膿毒癥期間,腸黏膜上皮細(xì)胞被破壞,大量炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)ISCs 發(fā)生不對稱分裂,導(dǎo)致分裂模式紊亂,生成分化潛能低、甚至無分化能力的無效子細(xì)胞,具有“干性”的ISCs 數(shù)量減少,延緩上皮黏膜修復(fù)速度,加速病情惡化。

2.灌注不足造成腸缺血性損傷影響ISCs 數(shù)量：隨著缺血時間延長,進(jìn)行性上皮損傷逐漸向隱窩延伸。 短暫缺血1 ～2h 后,再灌注加劇上皮損傷;缺血3h 后,隱窩組織學(xué)損傷逐漸明顯,ISCs 數(shù)量有所減少,絨毛上皮完全喪失;缺血持續(xù)4h 后,隱窩上皮近乎完全丟失,隱窩上皮細(xì)胞的數(shù)量明顯減少[26,27]。膿毒癥造成腸缺血性損傷通常大于4h,對隱窩的嚴(yán)重?fù)p傷已經(jīng)形成,ISCs 數(shù)量銳減,無法進(jìn)行有效的增殖分化。 膿毒癥期間,腸道組織嚴(yán)重缺氧,上皮細(xì)胞中的細(xì)胞外泌體微RNA-34a 增加,加速ISCs 不對稱分裂,使具有“干性”的ISCs 數(shù)量快速減少,ISCs 自我更新和分化能力減弱,無法及時替代凋亡的腸黏膜上皮細(xì)胞,屏障功能得不到修復(fù),相關(guān)IBFD 加劇。

3.基于ISCs 的治療：ISCs 移植是重建IBFD 患者上皮屏障的一種新型治療方法。 有實驗表明,ISCs可以進(jìn)行體外類器官培養(yǎng),與活體中的腸上皮相似,類器官同樣擁有隱窩、絨毛區(qū)及由ISCs 增殖分化的各類上皮細(xì)胞[28,29]。 為降低組織排斥風(fēng)險,可以通過內(nèi)鏡活檢從IBFD 患者的健康腸組織中收集ISCs,同時篩查與膿毒癥相關(guān)的突變基因,降低移植后腸道惡化風(fēng)險,用建立的類器官培養(yǎng)法進(jìn)行體外擴增,培養(yǎng)到所需數(shù)量的細(xì)胞后,通過內(nèi)鏡移植到目標(biāo)部位。 后期通過評估證實,與患者器官樣培養(yǎng)基比較,類器官簇狀、杯狀細(xì)胞表達(dá)率更高,最新的臨床評估認(rèn)為,這種治療方法值得深入研究并大規(guī)模推廣[30]。

四、展 望

腸道被認(rèn)為是系統(tǒng)性炎性反應(yīng)的來源和MODS的“引擎”,對腸屏障功能的病理生理學(xué)解釋還在隨著時間而不斷更迭。 腸道作為膿毒癥患者最先出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀的器官,腸黏膜上皮損傷導(dǎo)致IBDF,從局部微循環(huán)障礙發(fā)展為全身炎性反應(yīng)、免疫抑制,最終導(dǎo)致機體出現(xiàn)MODS。 近年來,隨著對膿毒癥IBDF 的深入理解,治療重點已從單純的抗炎抗感染轉(zhuǎn)至修復(fù)腸黏膜細(xì)胞、糾正黏膜功能障礙的多靶點治療,人們越來越需要找到安全、可行的方式,以恢復(fù)或預(yù)防膿毒癥患者出現(xiàn)IBFD。

綜上所述,ISCs 是參與IBFD 應(yīng)答的主要靶細(xì)胞之一,不僅是腸道炎性反應(yīng)中被動的靶細(xì)胞,也是一種效應(yīng)細(xì)胞;不單具有修復(fù)受損腸黏膜、改善腸道缺血、保護(hù)腸組織的作用,在嚴(yán)重感染反應(yīng)造成的IBDF中,還能起到調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能等保護(hù)機制。 故而,靶向ISCs 治療將從根本上調(diào)整膿毒癥患者相關(guān)IBFD 的治療策略,大幅度提高膿毒癥患者復(fù)蘇成功率,最終降低膿毒癥、膿毒性休克及MODS 的病死率,改善預(yù)后生存質(zhì)量。 因此,基于ISCs 療法的研究有望成為醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和生命科學(xué)等的前沿領(lǐng)域。