基于p38MAPK通路探討益氣利濕湯對阿霉素致慢性腎小球腎炎大鼠的干預(yù)作用

李 瑩，張春戩，楊 磊，劉曉艷，尚 靖，鄭佳新

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis,CGN)以雙側(cè)腎小球不同程度的炎性病變?yōu)橹饕±碜兓?，以蛋白尿、血尿、水腫、高血壓為主要臨床表現(xiàn)，其病程長、易復(fù)發(fā)[1-2]。CGN患者若得不到及時有效的治療，長期存在的蛋白尿可通過介導(dǎo)炎癥介質(zhì)、細胞因子等對腎小球和腎小管造成持續(xù)性損害，引起不同程度的腎功能減退甚至腎臟纖維化，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭[3-5]。CGN的全球發(fā)病率約為13.4%，而我國的患病率約為10.8%，且隨著高血壓、糖尿病、肥胖及代謝綜合征等疾病發(fā)病率的升高，CGN的發(fā)病率逐年增高[6]。相關(guān)統(tǒng)計顯示，CGN已經(jīng)成為引起慢性腎衰竭的首要疾病，其導(dǎo)致的慢性腎衰竭約占其總數(shù)的64.1%[1，7]。益氣利濕湯是治療腎病的臨床經(jīng)驗方，臨床研究證實其可以明顯改善慢性腎炎患者的血尿、蛋白尿及臨床癥狀[8]，實驗研究證實其可通過影響血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)/血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)信號通路起到減輕阿霉素腎病大鼠蛋白尿的作用[9]，但其具體作用機制尚未明確。本實驗基于p38MAPK信號通路，旨在進一步探討益氣利濕湯治療CGN的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠50只，體重(200±20)g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，照明時間12 h/d。本實驗相關(guān)操作經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院倫理委員會批準進行(SY3R-2022028)。

1.2實驗藥物 益氣利濕湯，組方：黃芪20 g、黨參20 g、芡實20 g、車前子15 g、黃芩15 g、半枝蓮20 g、魚腥草20 g、白花蛇舌草20 g、柴胡15 g、地骨皮15 g、麥冬15 g、茯苓15 g、僵蠶20 g，購自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院。藥物加5倍量水煎煮2次，濾過，合并煎煮藥液，濃縮至每1 mL含生藥3.5 g的濃縮液備用。雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥股份有限公司，批號：1905121B；阿霉素(注射用鹽酸多柔比星)，海正輝瑞制藥有限公司，國藥準字H33021980。

1.3實驗儀器及試劑 深圳雷杜RT-2100C酶標儀，日立LST-003全自動生化儀，奧體BK-DM500光學(xué)顯微鏡，Bio-Rad IQTM5 PCR 儀。尿白蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血白蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(貨號分別為C035-2-1，C013-2-1，C011-2-1，A028-1-1，A110-2-1，A111-2-1，C009-3-1，C010-3-1)；p38MAPK抗體購于Cell Signaling Technology公司，貨號：9212S；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、β-actin單抗和標記的二抗均購于Abcam公司(貨號分別為ab92486，ab8226，ab6721)。

1.4實驗方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為空白組、模型組、雷公藤組、益氣利濕湯中劑量組、益氣利濕湯高劑量組，每組10只。空白組大鼠給予生理鹽水0.5 mL/只尾靜脈注射，其他4組大鼠均給予阿霉素6 mg/kg尾靜脈注射。1周后檢測24 h尿蛋白定量證實造模成功后，雷公藤組給予雷公藤多苷混懸液0.85 mg/(kg·d)灌胃，益氣利濕湯中、高劑量組分別給予益氣利濕湯24.15 g/(kg·d)、48.3 g/(kg·d)灌胃，空白組與模型組均給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃5周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1大鼠狀態(tài)及生化指標 于實驗期間密切觀察各組大鼠的狀態(tài)，在末次灌胃之后將大鼠置于代謝籠中24 h留取尿液標本，使用雙縮尿比色法測定各組大鼠24 h尿蛋白定量；稱取大鼠體重，詳細記錄一般情況，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg的劑量麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心取上清，使用生化分析儀，采用ELISA法測定血清中BUN、SCr、ALB、AST、ALT、TC、TG水平。

1.5.2腎臟組織病理形態(tài) 取各組大鼠的腎臟組織，使用多聚甲醛進行固定，之后按照步驟分別進行脫水、包埋及切片后進行HE染色，觀察腎臟組織的形態(tài)。

1.5.3腎臟組織中TGF-β1及p38MAPK蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：取適量腎組織剪碎，加入RIPA裂解液，制備勻漿，提取蛋白并使用BCA法測定其蛋白含量。隨后依次進行上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜，在TBST中清洗1 min之后使用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，封閉結(jié)束后加入稀釋過的兔抗鼠單克隆抗體，密封后在4 ℃下孵育過夜。在TBST中清洗3次后加入使用辣根過氧化物酶標記過的羊抗兔二抗，之后在37 ℃下孵育1 h，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影，讀取目的條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值來表示蛋白的相對表達量。

1.5.4腎臟組織中TGF-β1及p38MAPK mRNA表達情況 采用RT-PCR法檢測：取部分腎組織用液氮固定，通過Trizol試劑提取大鼠腎臟組織中的總RNA，具體方法按說明書進行。將提取到的RNA使用氯仿進行處理，4 ℃下離心15 min(10 000 r/min)，使用75%乙醇沉淀，在25 μL的反應(yīng)體積中對樣品的總RNA(2 μg)進行反轉(zhuǎn)錄，擴增程序：55 ℃3 min，90 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，66 ℃ 2 min，進行40個循環(huán)。使用PCR儀測定熒光信號，將所獲得的數(shù)據(jù)依照公式2-△△Cq計算相對表達量。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’；p38MAPK上游引物5’-CCGAGCGATACCAGAAC-3’，下游引物5’-CACATCCAACAGACCAATC-3’；β-actin上游引物5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，下游引物5’-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3’。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 注射阿霉素后第2天，大鼠尾部出現(xiàn)紅腫，食量開始減少，大便偏稀，倦臥，互相畏縮，部分大鼠出現(xiàn)爛尾；實驗過程中模型組死亡3只，雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組各死亡2只，益氣利濕湯低劑量組死亡1只。實驗結(jié)束后，空白組大鼠飲食、二便等一般狀態(tài)均正常；模型組大鼠消瘦、精神萎靡，大便稀溏；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠上述癥狀較模型組明顯減輕。

2.2各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量明顯高于空白組(P<0.05)；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠24 h尿蛋白定量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組均明顯低于益氣利濕湯中劑量組(P均<0.05)；各組間血清BUN、SCr水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比較

2.3各組大鼠肝功能及血脂指標比較 與空白組比較，雷公藤組大鼠血清ALT、AST水平均明顯升高(P均<0.05)，模型組和益氣利濕湯中、高劑量組均無明顯變化(P均>0.05)；模型組大鼠血清ALB水平明顯降低(P<0.05)，血清TC、TG水平均明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較，雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠血清ALB水平均明顯升高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均明顯降低(P均<0.05)。與益氣利濕湯中劑量組比較，雷公藤組和益氣利濕湯高劑量組大鼠血清ALB水平均更高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均更低(P均<0.05) 。見表2。

表2 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠血清肝功能指標及血脂指標水平比較

2.4各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠腎單位飽滿無間隙，腎小球內(nèi)可見少量紅細胞，腎小管內(nèi)細胞豐富且排列規(guī)整；模型組大鼠的腎小管上皮細胞可見空泡樣變性，間質(zhì)內(nèi)可見局灶性炎性細胞浸潤及大量蛋白管型，并伴有纖維組織增生性改變；與模型組相比，雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠上皮細胞空泡變性程度較輕，炎性細胞浸潤和蛋白管型減少，且均無纖維組織增生性改變，其中雷公藤組病變程度最輕。見圖1。

2.5各組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK表達情況 模型組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)；雷公藤組及益氣利濕湯中、高劑量組大鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且雷公藤組及益氣利濕湯高劑量組均明顯低于益氣利濕湯中劑量組(P均<0.05)。見圖2及表3、表4。

表3 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、p38MAPK蛋白相對表達量比較

表4 空白組和慢性腎小球腎炎各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、p38MAPK mRNA相對表達量比較

3 討 論

免疫機制是腎小球疾病的始發(fā)機制，而炎癥介質(zhì)的參與則在此基礎(chǔ)上促進了腎小球疾病的發(fā)生及進展[10]。多條炎癥相關(guān)信號通路相互影響、相互作用，共同參與了腎臟組織的炎癥反應(yīng)，其中包括占據(jù)重要地位的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核因子-κB ( NF-κB)[11-12]。TGF-β1、血小板源性生長因子(PDGF)及白細胞介素等還能夠激發(fā)下游信號通路并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)，進而對核內(nèi)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄或表達進行調(diào)控，最終產(chǎn)生炎癥效應(yīng)[13]。

作為MAPK家族的重要成員之一，p38MAPK信號通路能轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細胞外信號，尤其會在氧化應(yīng)激環(huán)境中產(chǎn)生大量包括炎癥細胞、炎癥因子在內(nèi)的炎癥介質(zhì)，從而引起腎臟的足細胞凋亡及基質(zhì)沉積等病理效應(yīng)。在腎小球疾病的發(fā)生過程中，p38MAPK信號通路可以被氧化應(yīng)激、前炎癥因子及高血糖等多種因素誘導(dǎo)而激活，接著通過激活下游炎癥細胞、誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達及產(chǎn)生細胞因子等途徑導(dǎo)致足細胞損傷[14]。TGF-β1與p38MAPK密切相關(guān)，相互影響，TGF-β1能夠以p38MAPK的上游啟動因子的身份存在，從而激活p38MAPK，也可以作為p38MAPK的下游產(chǎn)物而引發(fā)炎癥反應(yīng)。TGF-β1介導(dǎo)的p38MAPK信號通路與CGN病程進展過程密切相關(guān)，并在其中起關(guān)鍵作用[15]。p38MAPK的過度激活導(dǎo)致其下游產(chǎn)物相應(yīng)增多進而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、細胞凋亡并且損傷腎臟組織，且該通路可以與其他相關(guān)通路協(xié)同作用，進一步加重腎臟損傷；另外，p38MAPK可以通過對TGF-β1、NF-κB等因子表達的調(diào)控影響腎間質(zhì)纖維化的進展，是腎臟纖維化的一條經(jīng)典途徑[16]。

益氣利濕湯是王鐵良教授治療腎病的經(jīng)驗方劑，方中黃芪、黨參補氣升陽，脾肺同調(diào)，可同時助脾運化、助肺行水，并且現(xiàn)代藥理研究表明此二味中藥可以增強機體的免疫功能[17-18]；芡實補益脾腎，與芪、參相合脾腎同補，使得先后天相互滋養(yǎng)；茯苓淡滲利濕，與參、芪相配更增利水之能；黃芩清上焦心肺之熱，肺熱清則清肅下行，心火清則心腎相交；地骨皮、麥冬有滋陰清熱之功，地骨皮還具有調(diào)節(jié)免疫及降低血糖、血壓、膽固醇的作用[19]；車前子通利水道，滲濕泄熱；僵蠶祛風(fēng)通絡(luò)；柴胡疏肝理氣，兼以和解少陽；另外酌加半枝蓮、白花蛇舌草、魚腥草等防其熱化。此方補氣與養(yǎng)陰并重，兼以清熱利濕，諸藥相配, 相輔相成，使得諸邪得去、諸證得解。

本實驗通過對TGF-β1/p38MAPK表達水平的檢測探索其是否為益氣利濕湯治療CGN的作用靶點，結(jié)果顯示益氣利濕湯可以顯著降低阿霉素致CGN大鼠的24 h尿蛋白定量及血清TC、TG，升高血清ALB，可有效減輕腎臟病理學(xué)改變，減少炎性細胞浸潤及蛋白管型的數(shù)量，其機制可能與調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號通路進而抑制炎癥反應(yīng)損傷有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。