羊 晨,涂 鏡,翟 楊,尹文銀,曾糧斌,魏寶陽**
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,湖南 長沙 410205;3.懷化鶴城宏興農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)綜合開發(fā)有限公司,湖南 懷化 418000)
肺形側(cè)耳(Pleurotus pulmonarius)屬于蘑菇綱(Agaricomycetes)傘菌目(Agaricales)側(cè)耳科(Pleurotaceae)側(cè)耳屬(Pleurotus),商品名為鳳尾菇,在我國20多個省份均有分布[1]。肺形側(cè)耳為人工栽培的重要食用菌平菇(Pleurotus ostreatus)的近源品種,其子實體營養(yǎng)價值豐富,含多種氨基酸及礦質(zhì)元素,入藥有祛風(fēng)散寒、舒筋活絡(luò)、降膽固醇等功效[2-4]。側(cè)耳屬真菌直接作為食物進(jìn)行生產(chǎn)時產(chǎn)出的子實體品質(zhì)較優(yōu),近來其菌絲體發(fā)酵處理農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的作用也在逐漸受到關(guān)注。
實驗室研究人員從湘鄉(xiāng)市采集、分離獲得1株野生的側(cè)耳屬菌株,通過對其進(jìn)行分子鑒定,探索其菌絲生長最適培養(yǎng)條件,完成初步出菇試驗,為開發(fā)湖南當(dāng)?shù)匾吧秤镁Y源提供參考。
1.1.1 供試菌株
野生的側(cè)耳屬菌株,于2021年4月采集自湘鄉(xiāng)市翻江鎮(zhèn)洪門村。采集的菌株標(biāo)本在本實驗室進(jìn)行分離、保藏,編號為ce1。
1.1.2 培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 18 g,水 1 000 mL,pH 7.0~7.2。用于菌種的分離與保藏。
碳源培養(yǎng)基:碳源20 g、酵母粉2 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂18 g,水1 000 mL,pH 自然[5]。
氮源培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、氮元素2 g、磷酸二氫鉀 3 g、硫酸鎂 1.5 g、瓊脂 18 g,水 1 000 mL,pH自然。
1.1.3 培養(yǎng)料
栽培種培養(yǎng)料設(shè)置5個配方。配方1:稻草秸稈80%、米糠19%、蔗糖1%;配方2:稻草秸稈60%、木屑20%、米糠19%、蔗糖1%;配方3:稻草秸稈40%、木屑40%、米糠19%、蔗糖1%;配方4:稻草秸稈60%、蓮蓬殼20%、米糠19%、蔗糖1%;配方5:稻草秸稈40%、蓮蓬殼40%、米糠19%、蔗糖1%。
1.1.4 原材料
稻草選用當(dāng)年曬干的稻草秸稈,粉碎成小段,長度為2 cm~3 cm,拌料前在質(zhì)量濃度為15 g·L-1的石灰水中浸泡1 d,擠干水分后備用。木屑為本地食用菌基地生產(chǎn)所用雜木屑。蓮蓬殼采用湖南湘潭蓮子產(chǎn)區(qū)干蓮蓬,粉碎,粒徑約為1 cm~2 cm。
1.2.1 菌株分離
野外采集的野生側(cè)耳于當(dāng)天采用子實體分離法進(jìn)行分離培養(yǎng)。將子實體用75%乙醇浸泡1 min,在無菌條件下用解剖刀縱切菌柄,切取菌柄與菌褶交界處的小塊菌肉(直徑為2 mm~3 mm),無菌紙上吸干水分。于PDA平板上涂布質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的硫酸鏈霉素200 μL。將切取的菌塊接種至平板上,每皿接種4塊,于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過數(shù)次純化后,得到野生側(cè)耳純化菌株。菌株活化后,使用內(nèi)徑為4 mm的打孔器打孔,將菌塊接入裝有1 mL甘油(體積分?jǐn)?shù)為50%)的凍存管中,保存于-20℃冰箱。
1.2.2 分子鑒定
野生側(cè)耳菌株ce1的鑒定采用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS(internal transcribed spacer)鑒定法,即對 5.8 S rDNA及其兩側(cè)的ITS1和ITS2基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和聚類分析。利用植物DNA提取試劑盒提取菌絲體總DNA。PCR擴(kuò)增采用真菌ITS 通 用 引 物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),反應(yīng)體系為 25 μL。以 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,然后交由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用BLAST進(jìn)行比對分析,選取側(cè)耳菌株ce1的近緣不同種菌株ITS序列,利用MEGA 10軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行同源性分析。
1.2.3 光照試驗
光照試驗采用PDA培養(yǎng)基,配制好的培養(yǎng)基于121℃高溫滅菌20 min,冷卻后倒平板。平板中央接種活化后直徑為4 mm的側(cè)耳菌株ce1菌絲塊,接種后將平板置于25℃光照氣候箱中培養(yǎng)。通過調(diào)整包裹平板的遮光紙,設(shè)置4個光照強(qiáng)度,分別為0、1 000 lx、3 000 lx、6 000 lx,每組3個平行。菌絲測量方法:培養(yǎng)至第7天時,采用“十”字交叉法測量菌落直徑,記錄菌絲長勢。
1.2.4 碳源試驗
試驗用碳源分別為葡萄糖、甘露醇、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖,每組3個平行。按照碳源培養(yǎng)基配方分別進(jìn)行配制,121℃高溫滅菌20 min,冷卻制板。接種后將平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。菌絲的測量方法同1.2.3。
1.2.5 氮源試驗
試驗用氮源分別為酵母粉、尿素、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、麥麩、豆餅粉、玉米粉,每組3個平行。計算各氮源含氮量,在含氮量相等的條件下,按照氮源培養(yǎng)基配方配制氮源培養(yǎng)基。于121℃高溫滅菌20 min,冷卻制板。接種后將平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。菌絲測量方法同1.2.3。
1.2.6 溫度試驗
選用 1.2.4 得出的最優(yōu)碳源和 1.2.5 得出的最優(yōu)氮源,配制溫度試驗培養(yǎng)基。接種后將平板分別置于19℃、22℃、25℃、28℃、31℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。菌絲測量方法同1.2.3。
1.2.7 pH 試驗
pH 培養(yǎng)基選用 1.2.4 得出的最優(yōu)碳源和 1.2.5 得出的最優(yōu)氮源進(jìn)行配制。分別用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度,使pH分別為5、6、7、8、9,總共5組,每組3個平行。接種后的平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。菌絲測量方法同 1.2.3。
1.2.8 栽培試驗
按照1.1.3中的配方分別配制5組培養(yǎng)料,攪拌均勻后調(diào)整含水量為60%。使用15 cm×30 cm的聚丙烯塑料袋,每袋裝濕料500 g,套環(huán)封口并包上報紙防止雜菌污染。121℃高溫滅菌2 h,冷卻后接種。為保持試驗條件一致,從活化后的肺形側(cè)耳平板中挑取1塊直徑為4 mm的菌塊接入菌包蓋口,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),記錄菌絲長勢以及菌絲滿袋時間。待菌絲長滿后,將套環(huán)打開,卷起上部栽培塑料袋,移入光照氣候箱。出菇條件設(shè)置為溫度20℃、空氣濕度90%、光照強(qiáng)度1 000 lx。采收時,旋轉(zhuǎn)子實體根部,盡量保證采收整個子實體,避免殘留菇腳在菌包內(nèi)造成污染。采收后,將小菇、死菇和未采凈的菇腳用消毒后的解剖刀剔除,然后將菌包置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)1 d,恢復(fù)菌絲活力,待新菌絲形成再將菌包移至光照氣候箱中繼續(xù)出菇。記錄開袋時間、采收時間、子實體鮮質(zhì)量,計算生物學(xué)效率。子實體經(jīng)液氮研磨后保存于-20℃冰箱。
1.2.9 菌糠酶活性初步測定
1)粗酶液制備
出菇期結(jié)束后,挑選正常出菇的菌棒,取菌棒中心部位菌糠,用液氮冷凍后磨碎,保存于-20℃冰箱。纖維素酶粗酶液的浸提條件為溫度30℃、時間1.0 h、料液比1∶40;木聚糖酶粗酶液的浸提最佳條件為溫度25℃、時間2.0 h、料液比1∶50。浸提后于4 000 r·min-1離心 10 min,上清液為粗酶液[6]。
2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取葡萄糖1.0 g,配制1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL 和 2.0 mL,再分別加入蒸餾水 3 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL 和 1.0 mL;然后每支試管各加入2 mL DNS顯色液搖勻,沸水浴5 min,迅速冷卻后定容至25 mL,充分搖勻;在520 nm處測定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:與葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法相同,配制好的木糖溶液在500 nm處測定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。
3)酶活力測定
取2支10 mL干燥刻度試管,試管1中加入1%羧甲基纖維素鈉溶液(用 0.1 mol·L-1、pH 4.8 的檸檬酸緩沖液配制)2 mL和粗酶液1 mL,試管2中加入 1%木聚糖溶液(用 0.1 mol·L-1、pH 4.6 的醋酸緩沖液配制)2 mL和粗酶液1 mL;均置于40℃水浴,30 min后立即加入DNS試劑2 mL,煮沸5 min后取出冷卻。試管1于520 nm處測定吸光度值,試管2于500 nm處測定吸光度值。以加熱滅活的粗酶液為對照。試管1和試管2分別按照葡糖糖、木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算被纖維素酶分解的纖維素含量或木聚糖被酶分解的木聚糖含量。
酶活力單位定義:1 g菌糠(干質(zhì)量)1 min水解纖維素或木聚糖生成1 μmol葡萄糖或木糖的酶量定義為一個酶活力單位,以IU·g-1表示[8-9]。
1.2.10 數(shù)據(jù)分析方法
使用Excel 2016軟件、Word 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖,采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.1.1 菌株形態(tài)鑒定
野生菌株ce1的子實體形態(tài)及菌絲體形態(tài)見圖1。
圖1 野生菌株ce1的子實體(A)和菌絲體(B)形態(tài)Fig.1 Morphology of fruit bodies(A)and mycelia(B)of wild strain ce1
如圖1所示,野生菌株ce1的子實體側(cè)生,單生,白色,體積較大,近扇形延展,邊緣呈波浪狀,菌蓋直徑為5 cm~15 cm;菌褶呈白色,致密,長短不等,延申至菌柄基部。其純培養(yǎng)菌絲潔白濃密,不產(chǎn)色素。菌株ce1具有顯著的側(cè)耳科真菌特征,可確定其為側(cè)耳科真菌。
2.1.2 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
通過PCR擴(kuò)增和序列測定,獲得菌株ce1菌絲體的ITS序列片段如下。
經(jīng)BLAST在線對比,該序列與肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius的相似性為99.41%。利用MEGA 10軟件,以菌株ce1與側(cè)耳屬菌株的ITS片段序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖2。
圖2 基于ITS序列的菌株ce1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ce1 based on ITS sequences
如圖2所示,野生菌株ce1的ITS序列與肺形側(cè)耳聚為一支,可以確定菌株ce1為肺形側(cè)耳。
不同光照強(qiáng)度對菌絲生長的影響見表1。
表1 不同光照強(qiáng)度下肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長情況Tab.1 Mycelial growth of Pleurotus pulmonarius strain ce1 under different light intensities
由表1可知,供試肺形側(cè)耳菌株的菌絲在0~6 000 lx的光照強(qiáng)度下均能生長,但菌絲生長速度和生長情況有差異。菌絲在光照強(qiáng)度為0(黑暗)條件下培養(yǎng)7天后,菌落直徑和生長情況顯著優(yōu)于其他試驗組,此結(jié)果與Davinia等[10]的報道相同。說明肺形側(cè)耳菌株在菌絲生長階段不需要光照,過強(qiáng)的光照對菌絲的生長具有抑制作用。
供試碳源對菌絲生長的影響見表2。
表2 不同供試碳源培養(yǎng)基中肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長情況Tab.2 Mycelial growth of Pleurotus pulmonarius strain ce1 in different carbon source media for testing
由表2可知,在6種供試碳源培養(yǎng)基上肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲均可生長。其中,可溶性淀粉組的菌落直徑平均值最高,但與蔗糖組和甘露醇組相比沒有顯著差異;蔗糖組的菌落直徑顯著高于葡萄糖組、乳糖組、果糖組,且菌絲生長情況也優(yōu)于除葡萄糖組外的其他4個試驗組。綜合考慮各碳源原料成本和配制方法難度,選用蔗糖為該肺形側(cè)耳菌株的最適碳源。
供試氮源對菌絲生長的影響見表3。
表3 不同供試氮源培養(yǎng)基中肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長情況Tab.3 Mycelial growth of Pleurotus pulmonarius strain ce1 in different nitrogen source media for testing
由表3可知,在等氮條件下配制氮源培養(yǎng)基,肺形側(cè)耳菌株ce1在除尿素以外的其他7種供試氮源培養(yǎng)基下均可生長;菌絲無法在尿素組正常生長,與鐘麗娟等[5]的研究結(jié)果相符。酵母粉組的菌落直徑顯著高于除玉米粉組外的其他試驗組,且菌絲生長情況優(yōu)于玉米粉組。綜合考慮各氮源材料的配制方法和原材料的成本,選用酵母粉為該肺形側(cè)耳菌株菌絲的最適氮源。
培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響見表4。
表4 不同培養(yǎng)溫度下肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長情況Tab.4 Mycelial growth of Pleurotus pulmonarius strain ce1 at different culture temperatures
如表4所示,因肺形側(cè)耳屬于高溫食用菌[11],在19℃~31℃均能生長。肺形側(cè)耳菌株ce1的菌落直徑在25℃、28℃、31℃條件下顯著大于19℃、22℃;培養(yǎng)溫度為22℃、25℃的條件下菌絲生長情況更優(yōu)。綜合考慮,選用培養(yǎng)溫度為25℃作為該肺形側(cè)耳菌株的最適生長溫度。
pH對菌絲生長的影響見表5。
表5 不同pH條件下肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長情況Tab.5 Mycelial growth of Pleurotus pulmonarius strain ce1 under different pH conditions
由表5可知,菌絲體在pH為5~9的培養(yǎng)基上均能生長。其中,pH為5時菌絲生長速度顯著慢于其他試驗組,且菌絲長勢差;pH 8、pH 9的試驗組與pH 6、pH 7的試驗組相比,菌絲生長速度沒有顯著差異,但菌絲長勢較差。因此選擇pH 6~7為最適pH范圍,且該試驗結(jié)果與劉月廉等[12]報道的結(jié)果相似。
2.7.1 肺形側(cè)耳菌株ce1的子實體特征
初步對肺形側(cè)耳菌株ce1進(jìn)行人工栽培,不同配方條件下兩潮菇的子實體特征見圖3。
圖3 不同培養(yǎng)料配方栽培肺形側(cè)耳菌株ce1的子實體特征Fig.3 Fruit body characteristics of Pleurotus pulmonarius strain ce1 cultivated in different formulas of substrates
由圖3可見,肺形側(cè)耳菌株ce1在不同的5個配方培養(yǎng)料上均可形成子實體。圖中子實體形態(tài)由于采摘時間不一致或栽培條件的限制,部分表現(xiàn)出菌蓋邊緣卷曲、出菇位置不一或不同菌包產(chǎn)量差異較大。但綜合試驗結(jié)果進(jìn)行分析,不同配方栽培的子實體在其他培養(yǎng)條件相同的情況下形態(tài)沒有明顯差異;綜合表現(xiàn)為子實體叢生,菌蓋體積較小,菌蓋中心偏黑,菌柄較長。人工栽培時出菇溫度偏高(約20℃),導(dǎo)致菌蓋邊緣顏色偏白,符合市售平菇的特點。
2.7.2 人工栽培肺形側(cè)耳菌株ce1的生長情況
不同培養(yǎng)料配方條件下,人工栽培肺形側(cè)耳菌株ce1的菌絲生長速度及出菇時間情況見表6。
表6 不同培養(yǎng)料配方栽培肺形側(cè)耳菌株ce1的生長情況Tab.6 The growth situation of Pleurotus pulmonarius strain ce1 cultivated in different formulas of substrates
由表6可知,采用配方1(全稻草培養(yǎng)料)時菌絲生長速度顯著慢于其他試驗組。使用添加了蓮蓬殼的配方4和配方5栽培菌株發(fā)現(xiàn),在生產(chǎn)第1潮菇時,菌絲長滿栽培袋之前袋口已經(jīng)生長出部分原基,因此其出菇時間顯著短于其他試驗組;但比較第2潮出菇時間,各配方之間沒有顯著差異。蓮蓬殼作為栽培肺形側(cè)耳的培養(yǎng)料組分時可能有促進(jìn)出菇的作用,但在后期營養(yǎng)供給能力可能下降。
2.7.3 肺形側(cè)耳菌株ce1栽培種產(chǎn)量分析
使用不同培養(yǎng)料配方栽培肺形側(cè)耳菌株ce1后,根據(jù)產(chǎn)量計算其生物學(xué)效率的分析結(jié)果見表7。
表7 不同培養(yǎng)料配方栽培肺形側(cè)耳菌株ce1的生物學(xué)效率Tab.7 Biological efficiency of Pleurotus pulmonarius strain ce1 cultivated in different formulas of substrates
由表7可知,配方2中第1潮菇的生物學(xué)效率顯著高于其他試驗組,但第2潮菇的生物學(xué)效率和生物學(xué)效率合計與其他試驗組沒有顯著差異。第2潮菇原基形成的成熟子實體數(shù)量及生物學(xué)效率較第1潮菇顯著減少,推測是有以下原因:1)第1潮菇生長消耗了菌棒中的營養(yǎng);2)經(jīng)過長時間的開袋處理后,栽培袋表面含水量降低,菌絲無法形成原基;3)第2潮菇菇蕾主要形成于培養(yǎng)料和塑料袋的間隙中,子實體在間隙中生長可能會影響產(chǎn)量;4)第1潮菇采收過程中干癟、腐爛的子實體未處理干凈,同時氣候箱中空氣濕度較高,導(dǎo)致培養(yǎng)料表面被霉菌污染。綜合以上原因,肺形側(cè)耳子實體第2潮菇生物學(xué)效率降低。
按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的試驗方法,得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液線性回歸方程為:
該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.991 7。
得到的木糖標(biāo)準(zhǔn)液線性回歸方程為:
該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.995 8。
由相關(guān)系數(shù)R2可知2個標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擬合度較好,可分別用其模型進(jìn)行酶活力分析。在人工栽培肺形側(cè)耳菌株ce1出菇后,收集不同配方的菌糠進(jìn)行酶活性測定,結(jié)果詳見表8。
表8 不同菌糠中纖維素酶和木聚糖酶的活性Tab.8 Viability of cellulase and xylanase in different chaff
由表8可知,在各個配方的菌糠中纖維素酶和木聚糖酶的活性均沒有顯著差異。表明該肺形側(cè)耳菌株的菌絲均能利用不同配方培養(yǎng)料中的纖維素和木聚糖,肺形側(cè)耳菌絲能利用的碳源種類較廣泛。
目前,可人工栽培的常規(guī)食用菌品種種類較少,隨著市場需求的擴(kuò)大,野生食用菌的價格居高不下。進(jìn)行野生食用菌的人工馴化栽培,可優(yōu)化人工栽培食用菌品種單一化問題,并獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益。此次在湖南當(dāng)?shù)夭杉⒎蛛x得到了一株野生側(cè)耳菌株,通過分子鑒定技術(shù)確定了其種類為肺形側(cè)耳;此肺形側(cè)耳菌株的菌絲適合在純黑暗條件下生長,菌絲生長最適碳源為淀粉,最適氮源為酵母粉,最適溫度為25℃,最適培養(yǎng)基pH為6~7。采用蓮蓬殼、木屑和稻草作為培養(yǎng)料的主要原料,通過栽培試驗發(fā)現(xiàn)該肺形側(cè)耳菌株在溫度為20℃、光照強(qiáng)度為1 000 lx、空氣濕度為90%的條件下成功出菇。
湘潭蓮藕產(chǎn)業(yè)正蓬勃發(fā)展,但其副產(chǎn)物蓮蓬殼尚未得到合理利用。采收蓮子后,蓮蓬殼常廢棄于水田中,造成水體污染。在本試驗中,使用蓮蓬殼添加量最多的配方5(稻草秸稈40%、蓮蓬殼40%、米糠19%、蔗糖1%)栽培該肺形側(cè)耳菌株后,其子實體特征、生物學(xué)效率、纖維素酶和木聚糖酶的活性與其他配方相比沒有顯著差異。證明加入蓮蓬殼可優(yōu)化肺形側(cè)耳培養(yǎng)料內(nèi)部結(jié)構(gòu),改善稻草培養(yǎng)料持水性不強(qiáng)、前處理難度較大的問題,且對菌株的出菇產(chǎn)量和栽培周期沒有影響。因此,在湘蓮產(chǎn)地周邊推廣蓮蓬殼栽培食用菌技術(shù),不僅節(jié)省原料成本、運(yùn)輸成分,同時可解決蓮藕栽培產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物處理問題。同時,通過此次試驗,也為食用菌企業(yè)提供新型原料的利用思路,為湖南當(dāng)?shù)毓睫r(nóng)提供技術(shù)參考。