綜合生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示蘆竹耐鹽的候選基因

孫源長， 羅 琳， 林 輝， 林冬梅， 林占熺

(福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心， 福建 福州 350002)

隨著全球人口的快速增長以及人們生活水平的不斷提高，對能源的需求也顯著增加。但是化石燃料和不可再生能源是有限的，并且在日益減少，因此迫切需要大力發(fā)展和利用可再生能源，而生物質(zhì)能是其重要的組成部分。目前馬鈴薯(Solanumtuberosum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、小麥(Triticumaestivum)等作物和一些生物量較大的草本植物作為生物燃料應(yīng)用十分廣泛。雖然這些草本植物可以在耕地中正常生長，但是其與農(nóng)作物競爭生長，不適宜一起種植，因此將適應(yīng)能力強(qiáng)的草本植物種植到鹽漬地、干旱地區(qū)和土壤性質(zhì)差的區(qū)域是個(gè)不錯(cuò)的選擇。其中，土壤鹽漬化是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問題，目前世界上有100多個(gè)國家的土壤受到影響，面積超過了9億公頃[1]。它會顯著影響作物產(chǎn)量和區(qū)域的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。蘆竹隸屬于禾本科蘆竹亞科蘆竹屬，具有高生物量、高蛋白、高抗逆性等特點(diǎn)，在合適的環(huán)境下，蘆竹第2年就可以生產(chǎn)出高達(dá)40 t·hm-2·a-1的干物質(zhì)生物質(zhì)能，對應(yīng)的能量值約為150 MWh·hm-2·a-1[2]，可見蘆竹的生產(chǎn)潛力巨大，并且其在高鹽度條件下也可實(shí)現(xiàn)較為可觀的生物產(chǎn)量，因此將它們種植于鹽漬地中不僅可以改善生態(tài)環(huán)境而且它們不與糧食作物競爭，有利于克服糧食安全風(fēng)險(xiǎn)。之前Lloyd L. Nackley等人對蘆竹進(jìn)行過鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，使它們在一系列鹽濃度(0～42 dS·m-1NaCl)環(huán)境中生長60天，結(jié)果顯示，在最高鹽度下，蘆竹整體生長減少了80%以上。然而，死亡率為零，表明蘆竹能夠耐受較高濃度的鹽環(huán)境[3]。雖然已知蘆竹具有較強(qiáng)的耐鹽性，但其分子機(jī)制和一些重要的鹽響應(yīng)基因尚未可知，制約了對其耐鹽高產(chǎn)的遺傳改良。

近10年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，其成本不斷下降，越來越多的研究人員對植物進(jìn)行測序并通過生物信息學(xué)分析篩選到一些重要的基因與信號通路[4-7]，為相關(guān)的育種工作提供了更加有效的方案。本研究對蘆竹采用不同濃度梯度的鹽溶液處理，通過生理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究，篩選出參與鹽響應(yīng)的重要基因，豐富蘆竹的耐鹽基因資源，未來可以針對這些基因構(gòu)建突變體，對這些基因進(jìn)行深入研究，為耐鹽品種的培育提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心菌草圃選取了6個(gè)月大的長勢一致的蘆竹組培苗，移栽到溫室用1/5霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)1個(gè)月進(jìn)行緩苗，使植物在14 h光照/10 h黑暗的光周期下生長，濕度為60%，光照強(qiáng)度為350 μmol·m-2·S-1。待適應(yīng)環(huán)境后分別進(jìn)行0 mmol·L-1，50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaCl鹽濃度溶液的處理，處理時(shí)間為36小時(shí)。

1.2 生理指標(biāo)的測定

測定鹽脅迫后葉片的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性，脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和Fv/F0指標(biāo)。每個(gè)重復(fù)由2～4株蘆竹從上至下第3～5片葉片混合得到，共3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析軟件采用GraphPad Prism 8。采用索萊寶公司超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒測定SOD活性(型號：BC0175)，過氧化物酶(POD)試劑盒測定POD活性(型號：BC0095)，過氧化氫酶(CAT)試劑盒測定CAT活性(型號：BC0205)，脯氨酸(Pro)含量試劑盒測定Pro含量(型號：BC0295)，植物可溶性糖(Soluble sugar)含量試劑盒測定可溶性糖含量(型號：BC0035)，丙二醛(MDA)含量試劑盒測定MDA含量(型號：BC0025)。用英國Hansatech公司植物效率儀(型號：PocketPEA)測定2-4株蘆竹從上至下第3-5片葉片的中部光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率(Fv/F0)，每片葉子測定4次，每個(gè)重復(fù)的測定結(jié)果取平均值，共3個(gè)重復(fù)。

1.3 RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得

收集0，50，100，150，200 mmol·L-1NaCl鹽濃度溶液處理過的葉片，葉片中每個(gè)重復(fù)由2-4株蘆竹的從上至下數(shù)第2片葉片混合得到，共3個(gè)重復(fù)。

取各個(gè)樣品各0.2 g，用Trizol試劑盒提取總RNA。在1%瓊脂糖凝膠上評估RNA降解與污染。RNA的純度通過Nano Drop 2000(Thermo scientific)分光光度計(jì)檢查。RNA完整性通過Agilent 2100(Agilent Technologies)檢測。對合格的樣本在Illumina Novaseq 6000平臺進(jìn)行雙端測序，讀長為150 bp。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制及De novo組裝

為了得到更加完整的轉(zhuǎn)錄本，此次組裝額外使用了本實(shí)驗(yàn)室相同品種的15個(gè)蘆竹莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)由FastQC進(jìn)行質(zhì)量檢測。任何低質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)和接頭序列都通過Trimmomatic[8]軟件進(jìn)行過濾，最終得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Clean data)。使用Trinity-v2.13.2[9]軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)合并進(jìn)行De novo組裝，組裝得到的轉(zhuǎn)錄組文件利用CD-HIT[10]軟件去冗余(相似性設(shè)置為0.95)得到最終Unigene序列。

1.5 基因表達(dá)量化和差異表達(dá)分析

使用Bowtie2比對軟件和RSEM進(jìn)行基因表達(dá)定量，以通過Perl腳本align_and_estimate_abundance.pl和來自Trinity軟件的-est_method RSEM獲得讀取計(jì)數(shù)的數(shù)量[11-12]。隨后，使用R包DESeq2[13]進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析。DEGs的過濾標(biāo)準(zhǔn)是|log2FoldChange|≥1并且p-value adjusted(padj)≤0.05。

1.6 GO和KEGG富集分析

為了研究DEGs的生物學(xué)意義，使用clusterProfiler[14]R包對其進(jìn)行GO與KEGG富集分析。參數(shù)設(shè)置為校正后的P值小于0.05,基因的注釋來源為eggNOG5.0[15]數(shù)據(jù)庫。

1.7 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA(R包中的WGCNA v1.70-3)[16]用于探索基因與生理指標(biāo)之間的關(guān)系，以及基因與基因之間的關(guān)系。參照前人方法，通過絕對中值差異篩選出具有4分位數(shù)(Q1)表達(dá)和TPM值大于2的基因輸入WGCNA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[17]。最小模塊大小設(shè)置為30，最大模塊大小設(shè)置為20000，merge cut height設(shè)置為0.25，合并相似度為0.8的模塊，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。Cytoscape[18]工具用于構(gòu)建和可視化交互網(wǎng)絡(luò)。Turquoise和green模塊的權(quán)重分別設(shè)置為0.18與0.24。

1.8 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

通過qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的準(zhǔn)確性。本研究隨機(jī)選取5個(gè)DEGs進(jìn)行驗(yàn)證，以證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。根據(jù)Michele Poli等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取較為穩(wěn)定的RPN6基因作為內(nèi)參基因[19]，從Phytozome13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網(wǎng)站獲取高粱的RPN6基因的cds序列(S.bicolor v3.1.1|Sobic.006G092800.2 CDS)。之后從蘆竹最長轉(zhuǎn)錄本的cds中挑選與高粱RPN6基因相似度最高的作為蘆竹的RPN6 cds序列。所有的基因均采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)制造商的說明，使用TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用前將各組分別點(diǎn)甩離心。在PCR管中建立20 μL體系，得到的產(chǎn)物直接用于qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)根據(jù)PerfectStart?Green qPCR SuperMIX試劑盒說明書進(jìn)行。相對定量結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量[20]。qPCR引物見表1。

表1 用于qPCR反應(yīng)的引物Table 1 Primers for qPCR reactions

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對蘆竹生理生化的影響

隨著NaCl鹽濃度的改變，蘆竹的脯氨酸含量與可溶性糖含量發(fā)生了顯著變化。其中脯氨酸含量在鹽濃度為200 mmol·L-1處上升至最高值(P<0.01)。而可溶性糖含量在150 mmol·L-1處達(dá)到了最高值，在200 mmol·L-1處顯著下降到最低值(P<0.01)。具體情況如圖1所示。

圖1 不同鹽濃度下蘆竹的生理變化Fig.1 Physiological changes of Arundo donax under different salt concentrations

2.2 測序數(shù)據(jù)的組裝結(jié)果

使用Trinity-v2.13.2[9]軟件對所有Clean data進(jìn)行從頭組裝，共產(chǎn)生971 309個(gè)轉(zhuǎn)錄本，GC含量為47.14%。之后對組裝好的轉(zhuǎn)錄本用CD-HIT[10]軟件去冗余，得到最終的Unigene。表2與表3是對組裝結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，transcript contigs的N50達(dá)到了1 228 bp，unigene contigs的N50達(dá)到了1 126 bp，表明組裝效果較好，數(shù)據(jù)值得進(jìn)一步分析。

表2 基于所有transcript contigs的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 2 Stats based on all transcript contigs

2.3 不同鹽濃度脅迫下的基因表達(dá)量化和差異表達(dá)分析

在R中通過DESeq2包分析了蘆竹響應(yīng)鹽脅迫的DEGs。DEGs的過濾標(biāo)準(zhǔn)是|log2FoldChange|≥1并且padj≤0.05。在葉片中檢測到的差異表達(dá)基因?yàn)? 745個(gè)，其分布如圖2所示?？梢钥闯鲭S著鹽濃度的增加，在葉片中無論是上調(diào)差異表達(dá)基因，下調(diào)差異表達(dá)基因還是總的差異表達(dá)基因數(shù)量都是逐漸增加的。不高于100 mmol·L-1鹽濃度時(shí)都是上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目小于下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目，當(dāng)鹽濃度大于等于150 mmol·L-1時(shí)上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目大于下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目。這些結(jié)果表明蘆竹在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，隨著鹽濃度的增加調(diào)控過程也越來越復(fù)雜。

表3 基于所有unigene contigs的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Table 3 Stats based on all unigene contigs

圖3可以較為直觀地看出葉片各個(gè)組間差異表達(dá)基因的重疊數(shù)量。結(jié)果表明在葉片中有166個(gè)基因是不同濃度鹽處理下的差異表達(dá)基因所共有的，這些基因可能是鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因。并且隨著鹽濃度的增加，各個(gè)組別中特有的差異表達(dá)基因數(shù)目也逐漸增加。這可能是由于隨著脅迫程度的加深，越來越多特定的信號通路受到調(diào)控。例如在葉片中，leaf_0 mmol·L-1_vs_50 mmol·L-1到leaf_0 mmol·L-1_vs_100 mmol·L-1到leaf_0 mmol·L-1_vs_150 mmol·L-1再到leaf_0 mmol·L-1_vs_200 mmol·L-1的特有差異表達(dá)基因數(shù)目從295個(gè)上升到653個(gè)、1 226個(gè)、3 685個(gè)。從以上結(jié)果可以看出，葉片存在一些較為保守的差異表達(dá)基因來響應(yīng)鹽脅迫，并且隨著鹽濃度的加深有越來越多的特異性差異表達(dá)基因參與到表達(dá)調(diào)控中來。

圖2 不同鹽濃度下葉片差異表達(dá)基因的數(shù)目Fig.2 Number of differentially expressed genes in leaves under different salt concentrations

圖3 不同鹽濃度下葉片差異表達(dá)基因的venn圖Fig.3 Venn plot of differentially expressed genes in leaves under different salt concentrations

2.4 鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因分析

對166個(gè)在葉片中的鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因進(jìn)行差異倍數(shù)分析。在葉片中鹽響應(yīng)的核心差異表達(dá)基因大部分是上調(diào)的，小部分是下調(diào)的；并且這些上調(diào)基因相對于下調(diào)基因的差異倍數(shù)更大(圖4)。說明響應(yīng)鹽脅迫主要是通過基因的上調(diào)起作用的，這些上調(diào)基因相對于下調(diào)基因的反應(yīng)更加強(qiáng)烈。

對葉片中差異倍數(shù)最大的前10個(gè)核心差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋，這些基因很可能在蘆竹基礎(chǔ)鹽響應(yīng)過程中發(fā)揮著極其重要的作用。其中差異表達(dá)倍數(shù)最大的414_c1_g2_i5編碼去極化激活的Ca2+通道，與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；0_c1_g3_i2編碼富含亮氨酸的重復(fù)蛋白激酶家族成員，與植物的防御相關(guān)。具體情況見表4。

圖4 葉片中核心差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)分析Fig.4 Fold analysis of core genes expression differences in leaves based on log2FoldChange

表4 葉片中重要的鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因Table 4 Important salt-responsive core differentially expressed genes in leaves

2.5 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

對葉片在不同鹽濃度下的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析。GO富集結(jié)果(圖5)表明：在葉片響應(yīng)鹽脅迫中，50 mmol·L-1與100 mmol·L-1鹽濃度的差異表達(dá)基因主要富集到了與硝酸鹽、一氧化氮、活性氮和活性氧相關(guān)的條目。與之不同的是隨著鹽濃度的增加達(dá)到150 mmol·L-1，一些富集集中在了與光合作用、脯氨酸相關(guān)的條目。當(dāng)鹽濃度上升到200 mmol·L-1時(shí)，除了富集到了與光合作用相關(guān)的條目還富集到了細(xì)胞分裂素、支鏈氨基酸相關(guān)途徑。KEGG富集結(jié)果(圖6)表明：在葉片中，50 mmol·L-1鹽濃度只富集到了氮代謝通路；而100 mmol·L-1，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1鹽濃度還富集到了其他條目：例如類黃酮生物合成、芪類與二芳基庚烷類和姜酚生物合成、光合作用、光合作用-天線蛋白、玉米素生物合成和硒化合物代謝等代謝通路。

圖5 葉片中差異表達(dá)基因的GO富集結(jié)果Fig.5 GO enrichment results of differentially expressed genes in leaves

圖6 葉片中差異表達(dá)基因的KEGG富集結(jié)果Fig.6 KEGG enrichment results of differentially expressed genes in leaves

2.6 WGCNA分析

植物在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)會發(fā)生特定基因的表達(dá)調(diào)控，這些將反應(yīng)在某些生理特征中。為了探究與特定性狀相關(guān)的基因集的關(guān)鍵(hub)基因,研究蘆竹特異性的鹽響應(yīng)應(yīng)答過程，采用WGCNA分析蘆竹葉片響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)譜，檢測基因與生理指標(biāo)以及模塊內(nèi)基因之間的關(guān)系。

2.6.1模塊的篩選 結(jié)合生理指標(biāo)和葉片的15個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過絕對中值差異篩選出具有4分位數(shù)(Q1)表達(dá)和TPM值大于2的共14 013個(gè)基因輸入WGCNA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過計(jì)算基因間鄰接函數(shù)確定軟閾值為12。并且聚類得到38個(gè)模塊，其中turquoise模塊與Pro的相關(guān)性最高，相關(guān)性為0.87；green模塊與Pro的相關(guān)性也較高，相關(guān)性分別為0.79。具體見圖7。

2.6.2hub基因的鑒定 將2個(gè)目標(biāo)模塊的hub差異表達(dá)基因?qū)隒ytoscape構(gòu)建可視化交互式網(wǎng)絡(luò),結(jié)果如圖8所示。Turquoise模塊的240249_c0_g1_i1，104188_c0_g1_i3，219926_c0_g1_i1，18316_c0_g1_i4和7477_c11_g1_i1處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置；Green模塊的10454_c0_g1_i12，6117_c0_g1_i16，19205_c0_g1_i4，23765_c0_g1_i1和86581_c0_g1_i9處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置。對每個(gè)模塊Degree程度最強(qiáng)的基因進(jìn)行注釋，結(jié)果見表5，這些被認(rèn)為核心hub基因，其中與Pro相關(guān)的turquoise，green模塊的hub基因編碼核堿基抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外膜孔蛋白等相關(guān)蛋白質(zhì)，還包括一些具有某些特定結(jié)構(gòu)的蛋白例如RING/U-box超家族蛋白和RRM結(jié)構(gòu)域蛋白等等；而對2個(gè)模塊的核心hub基因進(jìn)行表達(dá)量分析(各組TPM平均值取log2)，圖9結(jié)果顯示turquoise與green模塊的基因表達(dá)量隨著鹽濃度的加深呈上調(diào)趨勢。

圖7 模塊與生理指標(biāo)關(guān)聯(lián)圖Fig.7 Correlation diagram between modules and physiological indicators

圖8 網(wǎng)絡(luò)分析2個(gè)模塊中的樞紐基因Fig.8 Net-work analysis the hub genes in two modules

表5 兩個(gè)模塊中前5個(gè)hub基因的注釋結(jié)果Table 5 Annotation results of the top 5 hub genes in the two modules

圖9 2個(gè)模塊中排名前5個(gè)hub基因的表達(dá)量分析Fig.9 Expression analysis of the top 5 hub genes in the two modules

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

由于RNA-seq具有一定的缺陷，可能會得到假陽性的結(jié)果，故需要利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。對葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)隨機(jī)挑選5個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，可以看出這些基因的相對表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的表達(dá)模式是基本一致的(圖10A～10E)，并且基因表達(dá)變化數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到了0.82(圖10F)，也說明了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中qRT-PCR所確定的表達(dá)模式具有較好的一致性。

3 討論

3.1 鹽脅迫對蘆竹的生理影響

植物在鹽脅迫的情況下會誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)的激活，包括抗氧化化合物，例如類胡蘿卜素和抗壞血酸鹽、谷胱甘肽、α-生育酚和幾種參與活性氧(ROS)解毒的酶，例如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等[21]。而一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也在抗逆過程中發(fā)揮著重要作用，如脯氨酸[22]與可溶性糖。脯氨酸是一種具有特殊構(gòu)象的氨基酸，是初級代謝所必需的。壓力環(huán)境導(dǎo)致植物中脯氨酸的過量產(chǎn)生，進(jìn)而通過維持細(xì)胞膨脹或滲透平衡來賦予壓力耐受性；穩(wěn)定膜，從而防止電解質(zhì)泄漏；使活性氧(ROS)濃度在正常范圍內(nèi)，防止植物氧化爆發(fā)。MDA是脂質(zhì)過氧化的細(xì)胞毒性產(chǎn)物，也是評價(jià)自由基產(chǎn)生和組織損傷的指標(biāo)之一。Fv/F0是Fv與F0的比值，也是Fv/Fm(最大熒光)的一種表達(dá)方式，表示光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率。

圖10 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Fig.10 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes注：圖A～E中左側(cè)縱坐標(biāo)為qPCR相對表達(dá)量，右側(cè)縱坐標(biāo)為TPM值。A,13361_c0_g1_i15；B,14873_c0_g1_i6；C,70740_c0_g1_i2；D,129260_c0_g2_i1；E,122017_c0_g1_i1；F,相關(guān)性分析圖Note：In Figures A to E,the left ordinate is the relative expression level of qPCR,and the right ordinate is the TPM value. A,13361_c0_g1_i15;B,14873_c0_g1_i6;C,70740_c0_g1_i2;D, 129260_c0_g2_i1;E,122017_c0_g1_i1；F，Correlation diagram of validated genes

本研究中，對蘆竹在0 mmol·L-1，50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaCl鹽溶液下的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性，脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和Fv/F0指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示隨著鹽濃度的增加，脯氨酸含量在200 mmol·L-1處達(dá)到最高值?？扇苄蕴呛吭?50 mmol·L-1處達(dá)到了最高，200 mmol·L-1處下降到最低值。而其他生理指標(biāo)變化并不明顯，說明其對鹽環(huán)境可能并不是十分敏感，并沒有對其造成較大的損傷，具有一定的耐受性，也可能是由于脅迫時(shí)間與濃度不足導(dǎo)致的。

3.2 蘆竹鹽響應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因

為了確定蘆竹響應(yīng)鹽脅迫的相關(guān)基因，利用DESeq2進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示這些差異表達(dá)基因主要與硝酸鹽、一氧化氮、活性氮、活性氧、類黃酮生物合成、芪類與二芳基庚烷類和姜酚生物合成、光合作用、玉米素生物合成和硒化合物代謝等條目相關(guān)。這些過程可能在蘆竹響應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。而414_c1_g2_i5(TPC1)，4389_c1_g1_i14，4238_c0_g1_i12，0_c1_g3_i2，8776_c0_g1_i37(GSH2)和37109_c0_g1_i12可能是蘆竹響應(yīng)鹽脅迫過程中的關(guān)鍵基因。414_c1_g2_i5(TPC1)是從植物克隆的第一個(gè)TPC通道[23]，定位于液泡膜，負(fù)責(zé)產(chǎn)生慢速液泡(SV) 電流，參與各種生理過程的調(diào)節(jié)，例如發(fā)芽、氣孔開放、茉莉酸的生物合成以及高鹽濃度誘導(dǎo)的長距離鈣信號傳播[24]。4389_c1_g1_i14在細(xì)胞分化，細(xì)胞壁生物發(fā)生，化學(xué)穩(wěn)態(tài)，發(fā)育生長等方面起作用；4238_c0_g1_i12是與AtMSU81 同源的無功能假基因；0_c1_g3_i2是富含亮氨酸的重復(fù)蛋白激酶家族的成員，可以與FRD3相互作用，參與檸檬酸鹽外流運(yùn)輸；8776_c0_g1_i37(GSH2)編碼谷胱甘肽生物合成酶，三肽谷胱甘肽(GSH)是真核細(xì)胞中主要的非蛋白質(zhì)硫醇化合物，參與細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，這在植物暴露于氧化應(yīng)激期間尤為重要，已被證實(shí)能夠提高抵抗逆境脅迫的能力[25-26]。37109_c0_g1_i12為HAD超家族，IIIB酸性磷酸酶亞家族成員。

結(jié)合生理生化指標(biāo)對差異基因進(jìn)行WGCNA分析，以探求與生理變化對應(yīng)的相關(guān)基因，從不同角度研究蘆竹的核心鹽響應(yīng)基因。與Pro相關(guān)的turquoise，green模塊的hub基因編碼核堿基抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外膜孔蛋白等相關(guān)蛋白質(zhì)，還包括一些具有某些特定結(jié)構(gòu)的蛋白例如RING/U-box超家族蛋白和RRM結(jié)構(gòu)域蛋白等等。其中核堿基抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中運(yùn)輸黃嘌呤和尿酸，已有相關(guān)研究證明黃嘌呤和尿酸在緩解鹽脅迫方面具有潛在用途，并且過表達(dá)核堿基抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因可增強(qiáng)植物的耐鹽性[27]。而一些與DUF1645[28]，RING/U-box[29]，RRM[30]和MYB[31]相關(guān)的基因家族也被證實(shí)在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本文綜合生理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)來探究蘆竹對不同程度鹽脅迫的響應(yīng)變化。結(jié)果表明隨著鹽濃度的增大，蘆竹脯氨酸和可溶性糖的含量會發(fā)生顯著變化。但其對鹽環(huán)境并不是十分敏感，具有一定的耐受性。而在響應(yīng)鹽脅迫的過程中，差異表達(dá)基因主要被富集到了與硝酸鹽、一氧化氮、活性氮、活性氧和類黃酮生物合成相關(guān)的通路。一些變化倍數(shù)較大的核心差異表達(dá)基因和一些與脯氨酸含量變化相關(guān)的基因可能具有重要作用，可作為候選的耐鹽基因。本研究結(jié)果可為蘆竹耐鹽的分子機(jī)制研究提供線索，也為今后蘆竹的分子育種提供參考。