響應(yīng)面法優(yōu)化蘆竹中蘆竹堿提取工藝

李琳，楊培龍，李秀梅，潘方方，閆海潔*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所（北京 100081）

蘆竹（Arundo donax）又名蘆荻、江葦，多年生，禾本科蘆竹屬多年生植物。莖干直立挺拔，高2～6 m，莖粗1～2 cm，葉片寬大鮮綠，形似蘆葦、竹子，但屬于不同的植物。蘆竹原產(chǎn)于匈牙利[1]，在中國南方地區(qū)有亞種。燃燒熱值在16.8 kJ以上，且單位面積生物質(zhì)能產(chǎn)量高，早期作為替代煤炭的生物質(zhì)能源材料被引進(jìn)中國。蘆竹喜潮，在中國主要分布在廣東、四川、浙江等地區(qū)，通?？梢蚤L到6 m。平均每年每公頃30～40 t的干物質(zhì)量[2]。蘆竹的適應(yīng)性極強(qiáng)，由于其根系發(fā)達(dá)，蔓延性強(qiáng)，可以很好地吸收水分，所以耐干旱。不僅如此，蘆竹還可在鹽堿地、沙地等環(huán)境中生存[3-4]。蘆竹有多種用途，可作為生物燃料，干物質(zhì)直接燃燒熱值為3 400 kJ/kg。它是世界上生長最快的陸地植物之一，對土壤耕作、肥料和殺蟲劑的需要很少。歐盟公布蘆竹是所有能源生物質(zhì)作物中最有生產(chǎn)力和最低影響的作物[5]，并提議蘆竹成為產(chǎn)生沼氣的能源作物，自從2013年起，意大利已有25個(gè)農(nóng)場種植蘆竹[6]；蘆竹還可防止水土流失[7]，對不同pH、酸堿度、含重金屬離子的土壤具有修復(fù)作用[8]；蘆竹被用于污水處理[9]；1937—1962年，在意大利，蘆竹被用于大規(guī)模的紙張和溶解紙漿的工業(yè)基礎(chǔ)中；蘆竹在中國古代被當(dāng)作牧草來飼喂牛羊，有研究表明，蘆竹的蛋白質(zhì)含量高，纖維含量低，可作為一種優(yōu)質(zhì)飼料原料，特別是蘆竹幼嫩的枝葉是雞、牛等喜歡的青綠飼料[10]；成熟蘆葦作為原料，以其優(yōu)良性能和管狀形狀被用作建筑材料，與竹子相似之處在于它們在建筑物中結(jié)合方式，但蘆竹更靈活；蘆竹還可用來制作樂器。

蘆竹中含有多種生物堿，如蘆竹辛、蘆竹胺、蘆竹堿等，蘆竹堿又名格胺、克胺、禾堿、禾草堿、2-二甲氨甲基吲哚，純凈的蘆竹堿為片狀或針狀白色結(jié)晶，熔點(diǎn)128℃，溶于醇、醚、氯仿，微溶于冷丙酮，幾乎不溶于水和石油醚[11]，中國化學(xué)家刑其毅最先完成其化學(xué)合成與結(jié)構(gòu)測定[12]。蘆竹堿存在于蘆竹、羽扁豆、麥芽、排前草中，蘆竹中蘆竹堿含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山羊草中蘆竹堿含量[13]，具有多種生物活性[14]，是色氨酸的重要中間體，并在動(dòng)物和人體的氨基酸代謝過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。蘆竹堿具有清熱瀉火作用，中醫(yī)用于治療熱病煩渴、風(fēng)火牙痛、小便不利，作用擬膽堿，可降低腎上腺素對平滑肌的影響[17]。蘆竹堿對昆蟲幼蟲，如蚜蟲有選擇性毒性作用，但對哺乳動(dòng)物無毒[18]。蘆竹堿單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）具有抑制活性，可開發(fā)蘆竹堿類生物農(nóng)藥[19-20]。蘆竹堿還可作為防污活性物質(zhì)[21]。

對于蘆竹堿合成工藝的研究較多[22-28]，但對于蘆竹堿天然提取的方法研究很少，有學(xué)者采用氯仿或乙醇、水、冰醋酸的混合溶液提取蘆竹堿[29-30]，蘆竹堿在水中溶解性較差。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆竹（采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園）；乙醇（分析純，北京化工廠）；鹽酸（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品責(zé)任有限公司）；氫氧化鈉、三氟乙酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；蘆竹堿標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；乙腈（色譜純）。

1.2 儀器與設(shè)備

SY-1000恒溫超聲提取機(jī)（北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司）；高效液相色譜儀；ME-204電子天平、FE-28 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；YF114微型植物粉碎機(jī)（中國江陰市新友機(jī)械制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆竹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取0.2 g蘆竹堿溶于1 mL 70%的乙醇中，得到質(zhì)量濃度0.2 mg/mL蘆竹堿溶液，利用高效液相色譜儀測定上樣量分別為5，10，15，20和25 μL的峰面積，以蘆竹堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆竹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Y=2E+07X+49 288，R2=0.998 3。

1.3.2 原料的預(yù)處理

蘆竹收割清洗后于65℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，用植物粉碎機(jī)粉碎，過40目分析篩后保存于密封袋中，備用。

1.3.3 蘆竹堿的提取

按照一定料液比，稱取一定量蘆竹粗粉置于500 mL燒杯中，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至合適pH，在一定功率和溫度下超聲提取一定時(shí)間，靜置0.5 h，取上清液于離心管中以8 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

1.3.4 蘆竹堿的測定

高效液相色譜法。色譜柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A，0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相B，乙腈；檢測波長269 nm；流速1 mL/min；柱溫30℃。程序：0～25 min 5%～100% B；25～30 min 100% B。

1.3.5 單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

選取超聲功率、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比值、pH這6個(gè)因素對蘆竹中蘆竹堿的提取得率的影響，各個(gè)因素的水平為：超聲功率400，500，600，700和800 W，提取時(shí)間20，30，40，50和60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，40%，50%，60%，70%和80%，提取溫度30，40，50，60和70℃，液料比值20，30，40，50和60 mL/g，pH 5，6，7，8和9。根據(jù)單因素試驗(yàn)，選出超聲功率、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)主要影響因素，利用響應(yīng)面法對蘆竹中蘆竹堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.4 蘆竹堿提取率的計(jì)算

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010計(jì)算，以±s表示，采用Design-Expert 8.06對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對蘆竹堿提取率的影響

如圖1所示，隨著超聲功率增加，得率呈先增加后減少趨勢，因?yàn)楣β试酱?，空化效果增?qiáng)，但是太大功率會(huì)產(chǎn)生大量空化泡，減少能量的傳遞，使得率降低[31]。因此，超聲功率控制在600 W為宜。

圖1 超聲功率對蘆竹堿得率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對蘆竹堿提取率的影響

如圖2所示，在20～50 min超聲時(shí)間內(nèi)，蘆竹堿得率明顯上升，50 min時(shí)達(dá)到最大，之后得率隨時(shí)間增加而下降。這是因?yàn)樵诔曌饔孟?，隨著時(shí)間延長，提取液能夠更充分地滲入物料中，促進(jìn)蘆竹堿溶出，然而超聲時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致蘆竹堿降解。因此，超聲時(shí)間控制在50 min左右。

圖2 超聲時(shí)間對蘆竹堿得率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆竹堿提取率的影響

如圖3所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%～60%時(shí)，蘆竹堿得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而增加，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，蘆竹堿得率達(dá)到最大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，蘆竹堿得率反而有所下降。原因是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，溶解在有機(jī)溶劑中的蘆竹堿量會(huì)隨之增加，但乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到一定限度時(shí)，蘆竹中其他物質(zhì)會(huì)被提取出來，反而影響蘆竹堿得率。因而選取乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆竹堿得率的影響

2.1.4 超聲溫度對蘆竹堿提取率的影響

如圖4所示，隨著溫度升高，蘆竹堿得率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，50℃時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著溫度升高，體系黏度降低，加速傳質(zhì)過程[32]。溫度過高可能會(huì)破壞蘆竹堿結(jié)構(gòu)，同時(shí)雜質(zhì)浸出量增加，故選取最佳超聲溫度50℃為宜。

圖4 超聲溫度對蘆竹堿得率的影響

2.1.5 液料比值對蘆竹堿提取率的影響

如圖5所示，液料比值20～40 mL/g范圍內(nèi)，液料比值對蘆竹堿得率影響不大，隨著料液比繼續(xù)增大，得率下降?？紤]到后續(xù)濃縮回收工藝難度和節(jié)約原料原則，選擇液料比值40 mL/g為宜。

圖5 液料比值對蘆竹堿得率的影響

2.1.6 pH對蘆竹堿提取率的影響

如圖6所示，在pH 5～9范圍內(nèi)，pH對蘆竹堿的得率影響不大，因此選擇pH 5左右。

圖6 pH對蘆竹堿得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.06統(tǒng)計(jì)分析軟件中響應(yīng)曲面法的Box-Behnken模式，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對蘆竹堿得率影響顯著的3個(gè)因素——超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C），建立三因素三水平中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17個(gè)試驗(yàn)方案，其中12個(gè)析因試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以蘆竹堿得率為響應(yīng)值，建立影響因素和蘆竹堿得率間的數(shù)學(xué)模型：Y=-1.166 88+4.689 98E-003A+ 0.015 266B+9.743 18E-003C-2.243 75E-006AB+ 1.373 77E-005AC-6.637 50E-006BC-4.252 66E- 006A2-1.291 36E-004B2-1.539 76E-004C2。

由表3可知，該模型p＜0.000 1，說明該二次回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)（p=5.42＞0.05）顯著，說明未知試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。決定系數(shù)R2=0.995 4，說明該模型對試驗(yàn)擬合情況較好，較好地反映蘆竹堿得率與超聲功率、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析表

從表3中可以看出，超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率二次項(xiàng)、超聲時(shí)間二次項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)、超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項(xiàng)對響應(yīng)值影響極顯著，其他因素的影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖7（a）～（c）反映在試驗(yàn)范圍內(nèi)3個(gè)因素的交互作用，同時(shí)第3個(gè)因素固定在零水平。綜合比較6組圖可知，等高線圖c最圓，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互作用對提取蘆竹中蘆竹堿得率的影響最小，而等高線圖b呈橢圓形，說明超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用對提取蘆竹中蘆竹堿得率的影響最大。各因素對響應(yīng)值的影響順序?yàn)椋撼暪β剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間。

圖7 各兩因素交互作用對蘆竹堿得率影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.3 最佳提取工藝驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測超聲提取蘆竹中蘆竹堿的最佳工藝條件是：超聲功率632.54 W、超聲時(shí)間58.73 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)52.10%。在此條件下蘆竹堿得率的預(yù)測值為1.000 25%。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整優(yōu)化條件為：超聲功率600 W、超聲時(shí)間5 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度50℃、液料比值40 g/mL、pH 5。重復(fù)3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，蘆竹堿的實(shí)際得率為1.02%，與理論預(yù)測值接近（相對誤差1.96%），說明響應(yīng)面分析法適用于對蘆竹中蘆竹堿超聲提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用超聲提取蘆竹中的蘆竹堿，并考察單因素對蘆竹堿得率的影響，在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法得到蘆竹堿最佳提取工藝為：超聲功率600 W、超聲時(shí)間50 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度50℃、液料比值40 mL/g，pH 5。在此條件下，蘆竹中蘆竹堿得率為1.00%。試驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法對蘆竹中蘆竹堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)、合理的理論和試驗(yàn)依據(jù)。