QuEChERS-GCMS/MS法快速測(cè)定刺梨中15種農(nóng)藥殘留

李志 ，冉茂乾 ，徐孟懷 ，游元丁 ，焦彥朝*

1. 六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心（六盤水 553000）；

2. 貴陽(yáng)海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心國(guó)家果蔬檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（六盤水）（六盤水 553000）；3. 貴陽(yáng)海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心（貴陽(yáng) 550081）

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，又名茨梨、刺梨子。生于海拔500～ 2 500 m的向陽(yáng)山坡、溝谷、路旁以及灌木叢中，是貴州、鄂西山區(qū)、湘西等地的天然野果[1]。由于刺梨營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，被譽(yù)為“維生素C之王”[2-4]，在貴州省有大面積人工種植，為培育出品質(zhì)優(yōu)良刺梨，通常噴灑農(nóng)藥達(dá)到除蟲殺菌目的，但隨著農(nóng)藥的大量及不合理使用，刺梨中農(nóng)藥殘留對(duì)人類健康造成的負(fù)面影響日益顯露。

農(nóng)藥多殘留分析QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是用于高含水量食物中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的一種樣品處理和凈化技術(shù)，具有回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確、樣品容量高和非氯化溶劑使用少等優(yōu)點(diǎn)，減少試劑的消耗和操作人員與有害物質(zhì)的接觸。在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析，李彥生等[5]使用QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定三七中20種農(nóng)藥殘留；崔麗麗等[6]使用QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速測(cè)定人參中農(nóng)藥多殘留；李海暢等[7]使用QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)辣椒中33種農(nóng)藥殘留，鮮見(jiàn)使用GC-MS/MS結(jié)合QuEChERS方法進(jìn)行測(cè)定刺梨中農(nóng)藥殘留分析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，采用QuEChERS方法對(duì)刺梨進(jìn)行前處理，建立刺梨中15種農(nóng)藥殘留分析方法，具備經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和足夠精確等優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

刺梨（貴州六盤水），選用顆粒飽滿，無(wú)霉變的刺梨果，去掉種子和萼片，切碎，充分混勻，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

15種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)值100 μg/mL、規(guī)格1.2 mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）。

乙腈、正己烷（色譜純，德國(guó)Merck公司）；丙酮、甲苯（均為色譜純，美國(guó)Tedia試劑公司）；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）；Sep-Pak NH2固相萃取柱（美國(guó)Agela公司）；ECQUEU750CT-MP萃取鹽包（4 g MgSO4、1 g NaCl、0.5 g檸檬酸二鈉、1 g檸檬酸三鈉）、CUMPS18CT凈化離心管（150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg封尾C18，美國(guó)Agilent公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（Octadecylsilanel，C18，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

島津GC-MS/MS-TQ8050（配有AOC-20i+s自動(dòng)進(jìn)樣器、EI源，日本島津公司）；CPA224S德國(guó)賽多利斯電子分析天平（萊華爾科技（深圳）有限公司）；萊馳GM300刀式混合研磨儀（廣州艾威儀器科技有限公司）；Sigma 1-14K小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；EYELA10L-N-3010旋蒸蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器（美國(guó)ICM公司）；Sep-Pak NH2固相萃取柱（Agela有限公司）；DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）；0.45 μm有機(jī)濾膜（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

分別取單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg/mL，1.2 mL）各1 mL于2個(gè)10 mL容量瓶中，并用丙酮稀釋至刻度，即得濃度10 μg/mL混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放于冰箱中冷藏，有效期為3個(gè)月。

1.2.2 QuEChERS前處理

樣品前處理參考He等[8]、Lehotay[9]農(nóng)藥殘留方法提取并進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)，向50 mL離心管中加入5 g刺梨勻漿，混勻、平衡15 min后加入10 mL乙腈混合，加入ECQUEU750CT-MP萃取鹽包，劇烈振蕩1 min，在20℃，以5 000 r/min離心5 min，移取1 mL提取液至裝有150 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg封尾C18的2 mL微離心管中（CUMPS18CT），經(jīng)旋渦振蕩1 min后在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。移取0.5 mL提取液至2 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶，加入25 μL 1 μg/mL三苯基磷酸酯（TPP），進(jìn)行GC-MS/MS分析。

1.2.3 固相萃取

稱取5 g刺梨勻漿（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，旋渦振蕩5 min，加入5 g氯化鈉，再旋渦振蕩提取5 min，將離心管放入離心機(jī)，以5 000 r/min離心5 min，取上清液于雞心瓶，再次加入20 mL 乙腈重復(fù)提取2次，合并提取液濃縮至1 mL，將濃縮液于已用乙腈-甲苯溶液（3+1）活化好的Sep-Pak NH2中凈化，并用20 mL乙腈-甲苯溶液（3+1）洗滌Sep-Pak NH2柱，凈化液于40℃氮吹儀濃縮至1 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，供GC-MS/MS分析。

1.2.4 不同溶劑對(duì)各組分響應(yīng)值的影響

由于不同溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果不同，提取過(guò)程選擇合適的溶劑是建立提取方法首要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，盡可能選擇能充分溶解殘留危害物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，不溶解或少溶解樣品基質(zhì)與雜質(zhì)的溶劑作為萃取液。按1.2.2的QuEChERS前處理，考察乙腈、丙酮、乙酸乙酯3種不同提取溶劑對(duì)刺梨中15種待測(cè)物提取效率。

1.2.5 不同凈化劑對(duì)各組分響應(yīng)值的影響

蔬菜水果中的色素、碳水化合物、有機(jī)酸等的凈化程度會(huì)影響樣品的回收率。QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18吸附劑、GCB等，不同類型的凈化劑對(duì)最終待測(cè)物的提取效率有顯著影響，選取PSA、C18吸附劑、GCB作為凈化劑，按1.2.2的QuEChERS前處理，考察不同凈化劑對(duì)刺梨的凈化效果。

1.2.6 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）。升溫程序：初始溫度60℃，恒溫1 min，以25℃/min升溫至180℃，以10℃/min升溫至250℃，以10℃/min升溫至300℃，恒溫10 min。載氣：氦氣，純度≥99.999%。流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度290℃；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣。電離方式為電子電離（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；GC-MS接口溫度280℃；駐留時(shí)間2.5 min；溶劑延遲時(shí)間3 min；采集參數(shù)：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM，參數(shù)見(jiàn)表1）；15種農(nóng)藥混標(biāo)溶液TIC圖、陽(yáng)性樣品中TIC圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

1.2.7 空白樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

取空白刺梨樣品，按1.2.2的方法進(jìn)行提取，得到空白提取液。分別移取50，100，200，500和1 000 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，并用空白提取液定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.05，0.10，0.20，0.50和1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在1.2.6小節(jié)的氣相色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到各組分線性方程及相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，在確定色譜柱及儀器分析條件下試驗(yàn)的15種農(nóng)藥在0.05～1.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.998。

表1 15種農(nóng)藥組分CAS號(hào)、MRM參數(shù)

圖1 15種混合農(nóng)藥TIC圖（1 μg/mL）

圖2 陽(yáng)性樣品中15農(nóng)藥TIC圖（1 μg/mL）

表2 15種農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取結(jié)果

由圖3可知，固相萃取、QuEChERS方法提取各化合物回收率均在80%～110%之間，滿足農(nóng)藥加標(biāo)回收率要求，QuEChERS法是將凈化劑PSA直接加入到提取液中，與傳統(tǒng)固相萃取相比，可節(jié)約大量柱活化和淋洗所需的溶劑，并可節(jié)省裝柱時(shí)間[12]。因此，選擇QuEChERS萃取法作為樣品前處理方法。

2.2 提取溶劑的選擇結(jié)果

由圖4可知，以丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，其平均回收率分別是89.40%，90.07%和85.87%，加標(biāo)回收率均能滿足農(nóng)藥殘留分析要求，丙酮和乙酸乙酯提取雜質(zhì)較多，提取液顏色較深，色譜圖上出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰，背景干擾嚴(yán)重，對(duì)色譜柱、離子源污染較大；乙腈提取可避免基質(zhì)中蠟質(zhì)、脂肪和一些親酯性色素的干擾，大幅減少提取液中雜質(zhì)[13]，且回收率在3種溶劑中平均回收率最高，故選乙腈最為提取溶劑。

圖3 不同提取方法對(duì)回收率的影響

圖4 不同提取溶劑對(duì)回收率的影響

2.3 凈化劑種類的考察結(jié)果

乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（GCB）和十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）是QuEChERS方法中最常用的3種凈化吸附劑。C18凈化劑疏水性極強(qiáng)，能夠有效去除樣品中的脂肪酸和色素，同時(shí)其對(duì)非極性化合物具有較強(qiáng)的吸附作用[10]；PSA對(duì)樣品基質(zhì)中各種色素、有機(jī)酸及一些脂肪酸和糖具有良好凈化效果[14]；GCB可有效凈化基質(zhì)中類甾體、葉綠素等色素，但對(duì)脂肪的凈化能力較差，且具有較強(qiáng)的吸附性，使一些農(nóng)藥不易洗脫，從而影響分析結(jié)果。為了能有效去除刺梨中雜質(zhì)的干擾，分別考察PSA、GCB、C183種凈化劑對(duì)刺梨中15種農(nóng)藥回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。PSA、GCB、C183種凈化劑對(duì)刺梨凈化效果的平均回收率分別是87.93%，84.87%和89.60%，因此選擇C18作為最優(yōu)凈化劑。

圖5 凈化劑的選擇對(duì)回收率的影響

2.4 刺梨中15種農(nóng)藥殘留檢出限、精密度和回收率試驗(yàn)

以空白基質(zhì)產(chǎn)生3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限[15-18]，按1.2.2的方法對(duì)QuEChERS萃取，分別向空白刺梨基質(zhì)中添加0.10，0.40和0.80 mg/kg的3個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，檢出限、回收率和精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，該方法的檢出限、平均回收率、精密度分別在0.004 2～0.021 9 mg/kg，80.0%～110.0%和4.61%～8.72%，檢出限、平均回收率、精密度均滿足日常刺梨農(nóng)藥分析檢測(cè)。

表3 刺梨中15種有機(jī)農(nóng)藥檢出限、回收率和精密度試驗(yàn)（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用此方法檢測(cè)刺梨中15種農(nóng)藥，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。刺梨中檢測(cè)農(nóng)藥有4種呈陽(yáng)性，分別是敵敵畏、二嗪磷、殺螟硫磷、腐霉利、其含量分別為0.015 3，0.025 4，0.016 7和0.021 1 mg/kg。

表4 實(shí)際刺梨樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立刺梨中15種農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)的QuEChERSGC-MS/MS測(cè)定方法，其具有前處理快捷簡(jiǎn)便、回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確、樣品容量高和非氯化溶劑使用少等優(yōu)點(diǎn)。該方法具有良好的線性關(guān)系、加標(biāo)回收率均在80%～110%之間、儀器檢出限（S/N=3）均在0.004 2～ 0.021 9 mg/kg之間，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）均小于10%，其準(zhǔn)確度和精密度可以滿足日常的刺梨農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)，具備節(jié)約經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在實(shí)際刺梨農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，能滿足日常刺梨農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)。