A型肉毒毒素通過自噬途徑對大鼠皮瓣缺血再灌注的保護(hù)作用研究

崔 超，張 珊，林 煌

（1.北京懷柔醫(yī)院急診科 北京 100014；2.北京懷柔醫(yī)院腫瘤科 北京 100014；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院整形科 北京 100029）

游離皮瓣越來越多地用于修復(fù)嚴(yán)重外傷和腫瘤術(shù)后的皮膚和軟組織缺損。缺血再灌注損傷是不可避免的，會導(dǎo)致游離皮瓣顯著組織損傷[1]。盡管皮膚缺血再灌注損傷的病因尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明微血管塌陷和血流缺陷是皮瓣缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)[2]。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致血管通透性、微血栓形成和組織炎癥[3]。近年來，許多保護(hù)皮瓣的潛在方法和措施相繼被挖掘出來，如高壓氧、分子氫、缺血后處理等[4-5]，顯示出良好的發(fā)展前景。幾項(xiàng)研究表明，A型肉毒毒素（Botulinum toxin A，BTX-A）可以減輕動物模型上由缺血再灌注損傷引起的皮瓣壞死[6-7]。保護(hù)皮瓣的機(jī)制可能與增加血流量和血管舒張有關(guān)[8]。自噬是缺氧、低循環(huán)組織中細(xì)胞的一種保護(hù)作用，在維持細(xì)胞再灌注損傷等應(yīng)激條件下的存活方面起著重要作用。研究證實(shí)，缺氧和復(fù)氧微環(huán)境導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)而引起自噬基因表達(dá)增加[9]。本研究的主要目的是評估BTX-A對缺血再灌注損傷后大鼠皮瓣的保護(hù)作用是否與自噬有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：本研究經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。均采用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自北京思貝福生物有限公司，體重300～350 g，在22℃～25℃標(biāo)準(zhǔn)條件下將大鼠圈養(yǎng)在12 h的明暗循環(huán)環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與分組：80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組：I/R組（n=20）：缺血8 h后血流再灌注，I/R前7 d注射生理鹽水200 μl；BTX-A+I/R組（n=20）：缺血8 h后再灌注，I/R前7 d注射1 U BTX-A（Allergan，美國)，余操作同I/R組；BTX-A+I/R+3-MA（3-甲基腺嘌呤，自噬拮抗劑，Sigma，美國）組（n=20）：再灌注前20 min注射3-MA（30 mg/kg），其他處理同BTX-A組；假手術(shù)組（n=20）：無缺血/再灌注，前7 d注射生理鹽水200 μl。見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案示意圖

1.3 操作方法：大鼠用1%戊巴比妥鈉（5 ml/kg）麻醉。整個(gè)腹部區(qū)域備皮，并在大鼠身上設(shè)計(jì)了一個(gè)3 cm×6 cm的左側(cè)腹股溝皮瓣（見圖2）。結(jié)扎左股血管的其他分支，皮瓣保留淺表腹壁血管作為血管蒂。用微血管鉗夾住左股血管8 h，夾緊位置靠近左股血管的胯部（見圖3～4）。1 U BTX-A或生理鹽水注射到蒂附近的皮下層。3-MA（30 mg/kg）通過腹腔注射給藥。在缺血期結(jié)束時(shí)，移除夾子（見圖5）。使用5-0尼龍線（Ethilon，Johnson，美國）進(jìn)行連續(xù)縫合。

圖2 皮瓣缺血再灌注設(shè)計(jì)面積

圖3 左腹部股動脈和股靜脈的解剖位置

圖4 腹壁淺血管帶血管蒂皮瓣解剖圖

圖5 5-0尼龍線連續(xù)縫合

1.4 HE染色：從皮瓣存活區(qū)域取出皮瓣組織片（每個(gè)約1 cm2大?。?。將樣品切片并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的4%多聚甲醛固定。然后包埋在石蠟中，固定在載玻片上，進(jìn)行HE染色。檢測皮瓣組織和微血管的病理情況。同時(shí)，計(jì)算血管密度。

1.5 免疫組化（CD34&LC3）染色：切片通過抗體孵育、蘇木精染色、封固，用于觀察血管生成和LC3的表達(dá)。

1.6 Tunel染色：將50 μl POD加入到暗濕箱中帶有蓋玻片或密封膜的標(biāo)本中；進(jìn)行DAB染色、自來水沖洗、蘇木精復(fù)合染料和1%鹽酸分化。安裝后進(jìn)行顯微鏡觀察。凋亡細(xì)胞核呈棕色和黃色。通過選擇含有微血管的切片，計(jì)算在高倍視野（400次）下沿血管分布的凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 皮瓣壞死區(qū)的評估：術(shù)后第7天使用數(shù)碼相機(jī)評估皮瓣存活率。使用Image J軟件（1.51版，美國國立衛(wèi)生研究院）確定皮瓣的存活面積和壞死面積。正常皮膚是柔軟、溫暖和粉紅色的。壞死的皮膚為腫脹、變黑、變硬和變冷。然后計(jì)算壞死面積的百分比。

2 結(jié)果

2.1 BTX-A可防止缺血再灌注引起的皮瓣壞死：本次所有大鼠均存活。圖6顯示了術(shù)后第1天、第3天、第5天和第7天各組皮瓣的存活和壞死狀態(tài)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注處理增加了皮瓣的壞死面積；BTX-A+I/R組的壞死百分比低于I/R組，BTX-A+I/R+3-MA組的壞死百分比高于BTX-A+I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7。

圖6 各組術(shù)區(qū)情況

圖7 各組皮瓣壞死率

2.2 HE染色結(jié)果：假手術(shù)組皮瓣組織結(jié)構(gòu)正常，可見大量血管，組內(nèi)未見炎性浸潤。I/R組皮瓣組織結(jié)構(gòu)疏松，血管數(shù)量明顯減少，分布著大量的炎性細(xì)胞。與I/R組相比，BTX-A+I/R組皮瓣組織正常，血管數(shù)量增多，炎癥浸潤不明顯。與BTX-A+I/R組相比，BTX-A+I/R+3-MA組血管分布減少并顯示出炎癥浸潤。見圖8～9。

圖8 各組皮瓣組織HE染色結(jié)果（100×）

圖9 各組皮瓣組織微血管計(jì)數(shù)

2.3 免疫組化（CD34&LC3）結(jié)果：圖10可知，假手術(shù)組皮瓣組織血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34陽性，細(xì)胞質(zhì)是棕色的，排列成一個(gè)圓圈。與假手術(shù)組相比，I/R組皮瓣組織結(jié)構(gòu)松散，血管明顯縮小。與I/R組相比，BTX-A+I/R組CD34陽性細(xì)胞數(shù)增加。BTX-A+I/R+3-MA組血管組織數(shù)量少于BTX-A+I/R組。圖11可知，LC3陽性表達(dá)為棕黃色。BTX-A+I/R組皮瓣組織中LC3的表達(dá)水平高于I/R組。BTX-A+I/R+3-MA組LC3的表達(dá)水平降低。

圖10 各組CD34免疫組化染色結(jié)果（400×）

圖11 各組LC3 IHC染色結(jié)果（400×）

2.4 Tunel染色結(jié)果：假手術(shù)組凋亡細(xì)胞較少（見圖12），但I(xiàn)/R組凋亡細(xì)胞比例明顯增加。BTX-A+I/R組皮瓣組織凋亡細(xì)胞百分比明顯低于I/R組。BTX-A+I/R組抗凋亡作用被3-MA減弱。見圖13。

圖12 各組TUNEL染色結(jié)果（400×）

圖13 各組TUNEL陽性細(xì)胞比例

3 討論

盡管保護(hù)游離皮瓣的綜合治療措施不斷完善，游離皮瓣的成活率仍為90%～95%[10]。分析抗再灌注損傷的分子機(jī)制，確立皮瓣的靶點(diǎn)，具有現(xiàn)實(shí)的緊迫性。早在1986年，Murry在心肌缺血研究中就提出了預(yù)處理的概念[11]。研究表明，藥物預(yù)處理可以通過增強(qiáng)缺血再灌注中的自噬作用來減弱內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12]。

肉毒毒素是肉毒桿菌在生殖過程中分泌的一種有毒蛋白質(zhì)。肉毒毒素存在多種亞型（A、B、C、D、E、F、G），其中A型研究得最為清楚。目前已經(jīng)揭示了BTX-A對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[13-14]，這與本次結(jié)果一致。在本研究中，BTX-A+I/R組的壞死百分比低于I/R組。與I/R組相比，該組血管存活數(shù)增加，細(xì)胞凋亡數(shù)減少。然而，其機(jī)制尚不清楚。缺血再灌注損傷誘導(dǎo)炎癥，包括白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并導(dǎo)致血管內(nèi)皮、毛細(xì)血管功能障礙，狹窄、血管梗塞和血管痙攣。這些血管損傷導(dǎo)致組織缺氧和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致這些組織的凋亡和壞死[15]。本研究中進(jìn)行HE染色和CD34（一種新血管生成相關(guān)細(xì)胞表面蛋白，作為組織對缺血再灌注損傷的保護(hù)程度的標(biāo)志），以上兩個(gè)結(jié)果表明，I/R組的血管數(shù)少于假手術(shù)組。Tunel染色顯示I/R組細(xì)胞凋亡數(shù)高于假手術(shù)組。

研究表明，自噬與大鼠皮瓣的存活有關(guān)[16]。然而，目前尚沒有證據(jù)表明自噬參與了BTX-A的保護(hù)機(jī)制。足夠的證據(jù)表明，自噬在缺血再灌注過程中在人體重要臟器中起著重要作用[17]。然而，自噬在皮瓣缺血再灌注中的作用尚未得到充分報(bào)道。這些器官的自噬機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究中，由于自噬阻滯劑的應(yīng)用，皮瓣成活面積百分比、皮瓣血管分布均較BTX-A組降低，皮瓣炎癥浸潤和細(xì)胞凋亡增多。同時(shí)，3-MA注射后LC3的表達(dá)水平低于BTX-A+I/R組。說明BTX-A通過增強(qiáng)自噬保護(hù)皮瓣缺血再灌注損傷。本研究為提高皮瓣移植成功率提供了一種新的理論方法。

雖然本次證明BTX-A可以防止缺血再灌注損傷，但該研究有局限性。首先，皮瓣的血管損傷量測量不充分，在未來的研究中，可以通過蛋白質(zhì)印跡或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)確定VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）、iNOS（誘導(dǎo)型一氧化氮合酶）和CD34。此外，可以利用這些方法進(jìn)一步評估相關(guān)的凋亡蛋白（如Caspase-3、Bcl-2）及自噬相關(guān)蛋白?？傊敬窝芯拷Y(jié)果可能有助于制定相關(guān)的轉(zhuǎn)化方案，以提高顯微游離皮瓣術(shù)后組織的存活率，未來需要進(jìn)一步的研究來闡明BTX-A在皮瓣上的確切機(jī)制。