去鐵胺:促進(jìn)骨組織再生的潛在因子

曹長(zhǎng)紅 綜述，姚姝博 張圣敏 審校

（滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？谇幌?河北 滄州 061001）

骨骼是一種血供豐富的硬組織結(jié)構(gòu)，許多涉及骨組織再生的骨骼組織疾病，如骨壞死、骨缺損和骨質(zhì)疏松癥等，都可能存在著受損或功能異常的血管，而骨骼組織疾病本身也可能干擾骨組織周圍的正常血液循環(huán)。因此，充分的血流量恢復(fù)和骨誘導(dǎo)對(duì)骨組織再生的治療至關(guān)重要。去鐵胺(Deferoxamine, DFO)作為一種鐵螯合劑，常應(yīng)用于地中海貧血等需要依靠輸血治療的疾病，通過廣泛的基礎(chǔ)研究和臨床觀察，其在血管再生方面的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被普遍認(rèn)可，它可以激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)通路[1-4]，從而上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管生成，此外DFO也被證實(shí)可以通過Wnt-β信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[5-6]。DFO已在很多研究中顯示出促進(jìn)骨再生修復(fù)的前景。

1 DFO的一般特征

鐵是人體重要的微量元素，在氧運(yùn)輸、能量代謝和DNA合成等方面具有重要作用。然而，過多的鐵會(huì)導(dǎo)致未連接或不完全連接的鐵離子與過氧化物反應(yīng)形成活性氧物種(Reactive oxygen species,ROS)，并會(huì)對(duì)機(jī)體造成很大損害[7]。DFO是一種鐵螯合劑，已獲得食品和藥物管理局的批準(zhǔn)，并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中治療與鐵超載相關(guān)的疾病[8-9]。DFO通過與Fe3+和含鐵血黃素結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，可阻止Fe3+進(jìn)入到 Haber-Weiss反應(yīng)體系中，從而避免鐵中毒帶來的機(jī)體損害。DFO的使用通常需要長(zhǎng)期口服或輸注，臨床數(shù)據(jù)證明DFO的使用無明顯毒副作用，具有較高的臨床應(yīng)用安全性[10]，偶有嚴(yán)重過敏，僅在大劑量、快速靜脈輸注時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致低血壓與休克的發(fā)生。

2 DFO發(fā)揮成骨作用的可能原因及機(jī)制

2.1 成血管：血管系統(tǒng)在胚胎骨骼發(fā)育和骨骼生長(zhǎng)中具有不可替代的作用[11]，而且豐富的血液供應(yīng)可以為骨組織缺損提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子和趨化因子[12]，在骨組織修復(fù)過程中同樣起著至關(guān)重要的作用。血液供應(yīng)不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散、細(xì)胞增殖和新骨組織生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)遞送器官，而且在調(diào)控參與骨再生的細(xì)胞和信號(hào)分子中起著關(guān)鍵作用[13]。組織移植物缺乏血管供應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響組織器官的再生，血管生成缺乏或抑制已被報(bào)道是骨再生障礙的主要原因之一[14]。因此，誘導(dǎo)血管形成的能力在骨再生領(lǐng)域具有重要作用。

DFO具有上調(diào)HIF-1a和其他關(guān)鍵下游血管生成因子的能力，近年來，人們?cè)谠S多動(dòng)物模型中研究了DFO對(duì)血管生成的作用。已經(jīng)證實(shí)了DFO在缺血[15-16]、皮瓣成活[17]以及組織血管化[18-19]等方面發(fā)揮作用。以上這些研究闡明了DFO在血管化方面可能具有的臨床益處，介于血管化與成骨之間的協(xié)同作用，因此,推測(cè)DFO促進(jìn)血管化的基礎(chǔ)會(huì)為復(fù)雜的骨組織再生提供可能。

2.2 免疫調(diào)節(jié)：骨損傷后的修復(fù)過程是一個(gè)涉及各種細(xì)胞類型和細(xì)胞外環(huán)境之間相互作用的高度有序過程。以巨噬細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞不僅集中參與在創(chuàng)傷早期，也存在于整個(gè)骨修復(fù)過程中。巨噬細(xì)胞在成骨分化中的作用已被廣泛證實(shí)，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究表明，沒有巨噬細(xì)胞的直接參與，骨折將不會(huì)愈合[20]。

Gong L[21]研究了鼠骨髓巨噬細(xì)胞對(duì)transwell共培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響，該培養(yǎng)環(huán)境中顯示出M1巨噬細(xì)胞抑制和M2巨噬細(xì)胞增強(qiáng)，并促進(jìn)了小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成。在M1巨噬細(xì)胞中觀察到促炎細(xì)胞因子的顯著下調(diào)，而在M2巨噬細(xì)胞中觀察到轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，VEGF和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的上調(diào)。作者推測(cè)M1巨噬細(xì)胞的促炎作用被破壞，并且M2巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)因子的上調(diào)（M2極化）促進(jìn)了骨形成的增強(qiáng)。Park SM[22]發(fā)現(xiàn)經(jīng)DFO預(yù)處理的犬脂肪干細(xì)胞可促進(jìn)前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α刺激基因-6等抗炎因子的分泌，并可以更有效地引導(dǎo)RAW-264.7細(xì)胞M2極化。Oses C[23]等觀察了人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AD-MSCs)在不同劑量DFO作用后各種細(xì)胞分泌因子的變化，并發(fā)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行DFO預(yù)處理可以促進(jìn)抗炎因子如白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-5的分泌。白細(xì)胞介素-4是已知的巨噬細(xì)胞M2極化的誘導(dǎo)劑，這也表明被DFO預(yù)處理可能在巨噬細(xì)胞M2極化發(fā)揮作用。周穎等[24]利用DFO干擾素γ處理人牙髓干細(xì)胞，并在體外研究中證實(shí)預(yù)處理的細(xì)胞可以增強(qiáng)抑炎因子的分泌，在體內(nèi)研究中預(yù)處理的細(xì)胞可以更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。介于DFO可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，而巨噬細(xì)胞M2極化可以促進(jìn)成骨的發(fā)生，筆者推測(cè)DFO促進(jìn)成骨的因素可能與此有關(guān)。

2.3 高鐵環(huán)境調(diào)節(jié)：正常人體內(nèi)鐵元素的含量在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，過量鐵和過氧化氫結(jié)合會(huì)產(chǎn)生鐵離子(Fe3+)和活性氧物種(ROS)，它們的持續(xù)產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響組織再生。在近來的一些研究中[25-26]，已經(jīng)證實(shí)在骨質(zhì)疏松類骨折患者中存在血清鐵含量過高問題。而體內(nèi)過高的鐵含量同時(shí)被證實(shí)會(huì)抑制成骨細(xì)胞的活性，不利于骨創(chuàng)面的愈合。改善高鐵環(huán)境在此類型的骨折愈合中可能具有重要作用。張鵬[27]的研究證實(shí)了成骨細(xì)胞分化在高鐵環(huán)境中會(huì)受到抑制，通過DFO的干預(yù)能夠較為有效地恢復(fù)高鐵環(huán)境下的成骨細(xì)胞分化效果，這提示DFO在高鐵環(huán)境下能有效促進(jìn)成骨作用。汪升[28]的研究也證實(shí)DFO可以改善骨質(zhì)疏松后的鐵過量，并恢復(fù)成骨的相關(guān)指標(biāo)。通過以上研究，筆者推測(cè)局部應(yīng)用DFO可以逆轉(zhuǎn)鐵蓄積導(dǎo)致的骨損傷表面的鐵過量問題，進(jìn)而恢復(fù)有效的成骨效果。

2.4 可能參與的信號(hào)通路

2.4.1 HIF-α信號(hào)通路：誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵信號(hào)分子包括缺氧誘導(dǎo)因子-1 α (HIF-1α)、人重組Nell-1蛋白（Nell-1）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞衍生因子（bFGF）和VEGF等。HIF-1α信號(hào)通路被證實(shí)可通過提高成骨細(xì)胞中VEGF水平來促進(jìn)血管生成和成骨，在骨發(fā)育過程中激活HIF-1α通路可以協(xié)調(diào)骨中新血管形成的時(shí)間、方向和程度，從而增加骨重建過程，HIF-1α信號(hào)通路在正常骨骼發(fā)育中必不可少[29-30]。DFO已被證實(shí)能夠上調(diào)HIF-1α信號(hào)通路，這可能是DFO在成骨和成血管中發(fā)揮作用的重要原因。

2.4.2 PI3K/AKT信號(hào)通路：鄭勝武[31]的研究證實(shí)DFO可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)缺血下肢血管化。Ding J[32]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論認(rèn)為，低劑量DFO刺激的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)外泌體，可通過PI3K/AKT途徑促進(jìn)新生血管的形成。而PI3K/AKT信號(hào)通路的激活也被認(rèn)為可以直接促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化[33]，可以推測(cè)DFO成骨作用的促進(jìn)可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有一定關(guān)系。

2.4.3 β-catenin信號(hào)通路：Qu ZH[34]將DFO和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)同時(shí)作用于多能人間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠間充質(zhì)C3H10T1/2細(xì)胞，DFO促進(jìn)了多能人間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠間充質(zhì)C3H10T1/2細(xì)胞的堿性磷酸酶活性和鈣沉積。另一方面，DFO增強(qiáng)C3H10T1/2細(xì)胞中糖原合成酶激酶-3(GSK-3 b)的磷酸化，激活β-catenin信號(hào)通路，這些數(shù)據(jù)表明DFO可能通過激活β-catenin信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中起直接作用。Genetos DS[35]的研究結(jié)果顯示缺氧和模擬缺氧DFO增加β-catenin基因活性，增加BMP拮抗劑gremlin和noggin的表達(dá)，并降低Smad-1/5/8磷酸化。

3 DFO在骨再生中的應(yīng)用

研究結(jié)果表明，DFO在骨折、牽張成骨、骨質(zhì)疏松及骨缺損中都能發(fā)揮顯著的成骨作用。按DFO在骨再生中發(fā)揮作用的方式，將其分為體內(nèi)注射法和組織工程載藥支架。

3.1 注射法：將DFO注射到創(chuàng)面周圍是發(fā)揮DFO作用最直接的方式，這種方式已經(jīng)在骨折、骨缺損、牽張成骨及骨質(zhì)疏松中應(yīng)用，并促進(jìn)了相應(yīng)疾病的骨創(chuàng)面愈合。但這種方式也面臨著需要反復(fù)多次注射，以及最佳注射劑量及療程沒有定論等問題。

3.1.1 骨折：骨折是最常見的骨創(chuàng)傷疾病之一，Donneys A[36]等證實(shí)了DFO在骨折愈合方面可能發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用。研究者利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行體外研究，證實(shí)高劑量的DFO(50μM)處理的細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)就能獲得顯著優(yōu)于對(duì)照組的良好血管網(wǎng)絡(luò)。SD大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，DFO可顯著改善血管形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)治療的骨折相比，DFO治療組的骨愈合發(fā)生率更高。Shen X[37]建立小鼠股骨骨折模型，通過直接在骨折處注射DFO，證實(shí)DFO可通過激活HIF增加骨折后血管新生和骨形成。

3.1.2 牽張成骨：牽張成骨是促進(jìn)骨再生的一種技術(shù)。Farberg AS[38]的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證了DFO在牽張成骨中的應(yīng)用前途，研究者選用兩組大鼠(n=12)接受牽張成骨手術(shù)。在牽張階段，實(shí)驗(yàn)DFO組(n=5)在牽張間隙內(nèi)注射DFO。結(jié)果證實(shí)與對(duì)照組的再生骨相比，DFO處理組有明顯骨細(xì)胞增殖。證實(shí)DFO可有效使骨細(xì)胞和骨體積分?jǐn)?shù)顯著增加。Wan C[39]的實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了DFO對(duì)牽張成骨可能發(fā)揮的作用，通過將DFO注入在小鼠的牽張間隙，發(fā)現(xiàn)DFO可促進(jìn)血管生成并顯著改善骨再生。

3.1.3 骨質(zhì)疏松：DFO在骨質(zhì)疏松中可能發(fā)揮的優(yōu)勢(shì)作用也已被很多研究者所證實(shí)。Wang L[40]課題組認(rèn)為促進(jìn)骨中血管的形成是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在的臨床治療方法。其研究團(tuán)隊(duì)對(duì)DFO在去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中的作用進(jìn)行了深入研究，結(jié)果證實(shí)DFO治療不僅部分阻止了骨丟失并維持了骨小梁的微結(jié)構(gòu)，而且在去卵巢后的第1周還增加了H型血管的數(shù)量。DFO可能通過促進(jìn)H型血管的形成為改善骨質(zhì)疏松癥提供新的靶點(diǎn)，但作者并沒有對(duì)DFO影響H型血管調(diào)節(jié)骨代謝的分子機(jī)制進(jìn)一步展開研究。鄭妮娜[41]利用雷洛昔芬聯(lián)合甲磺酸去鐵胺治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，經(jīng)過為期6個(gè)月的觀察，發(fā)現(xiàn)治療總有效率為100%，骨密度及骨代謝指標(biāo)均有所改善。筆者認(rèn)為這可能與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者會(huì)出現(xiàn)血清鐵水平升高有關(guān)，血清鐵水平升高會(huì)造成機(jī)體鐵超負(fù)荷，鐵超負(fù)荷會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生不利影響，而甲磺酸去鐵胺的應(yīng)用逆轉(zhuǎn)了這一過程。

3.1.4 臨界骨缺損：杜文瑜[42]等在大鼠顱骨制備臨界骨缺損，并于手術(shù)后第4天在骨創(chuàng)面皮膚注射DFO，研究結(jié)果表明，通過梯度時(shí)間提取標(biāo)本并通過免疫組化等染色證實(shí)DFO可以有效促進(jìn)臨界骨缺損的血管新生和骨生成。以上研究結(jié)果均證實(shí)了DFO可能在優(yōu)化骨折、牽張成骨、骨質(zhì)疏松、骨缺損的骨形成方面有實(shí)用價(jià)值，并為未來的骨損傷治療帶來更好的選擇。由于藥物普遍存在的半衰期問題，單純注射可能存在局部釋放濃度不能長(zhǎng)久有效維持，并且注射DFO可能會(huì)導(dǎo)致不能準(zhǔn)確將足夠的藥物輸送到期望部位的問題。因此，對(duì)骨缺損的治療更多的研究通過設(shè)計(jì)組織工程骨支架來實(shí)現(xiàn)。

3.2 組織工程載藥支架：為了解決局部注射DFO血管滯留半衰期短，藥物可利用性差的問題，組織工程DFO載藥支架被研發(fā)。一個(gè)理想的載藥材料應(yīng)該在生物相容性，與骨再生相匹配的可降解性及緩慢持續(xù)有效釋放方面符合骨缺損對(duì)載藥支架的需求。眾多研究者利用不同的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DFO在支架的裝載。

Jia P[43]將DFO滴加到多孔聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架表面，冷凍干燥后合成PLGA/DFO載藥支架，DFO在7 d內(nèi)釋放80%左右，28 d基本釋放完全。研究結(jié)果證實(shí)DFO可促進(jìn)體外成骨分化和血管生成。體內(nèi)結(jié)果證實(shí)PLGA釋放的DFO促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨缺損的愈合。Yan Y[44]將DFO應(yīng)用于骨組織工程實(shí)驗(yàn)研究以驗(yàn)證其對(duì)骨缺損的治療價(jià)值，研究者通過表面氨解和層層組裝技術(shù)制備了一種3D打印的可生物降解支架，它可以控制DFO的有效釋放。DFO負(fù)載支架在前20 h之內(nèi)具有快速釋放特性，之后釋放相對(duì)較慢，120 h釋放接近90%。通過體外研究表明，該支架促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和成骨基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形態(tài)的形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DFO可促進(jìn)大鼠骨缺損模型中缺損部位的血管生長(zhǎng)和骨再生，證實(shí)了緩釋DFO的可降解支架對(duì)骨缺損發(fā)揮的作用。Yao Q[45]開發(fā)了一種新型的介孔硅酸鹽納米顆粒(MSNs)聯(lián)合納米纖維明膠(GF)組成的3D復(fù)合支架，用于裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)和DFO形成新式雙重給藥系統(tǒng)，DFO可在支架持續(xù)釋放10 d，結(jié)果顯示DFO的釋放顯著促進(jìn)了BMP2誘導(dǎo)的成骨分化，表明DFO的添加對(duì)成骨具有加強(qiáng)作用。Li H[46]基于多巴胺(DOPA)的自聚反應(yīng)，將DFO修飾到聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)膜表面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由DFO修飾的膜更有利于MC3T3-E1細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的附著、增殖和鋪展，PDLLA/PDOPA-DFO復(fù)合膜不僅有利于成骨，而且能顯著促進(jìn)血管生成。Ran Q[47]采用二氧化鈦納米管(TNT)作為藥物納米儲(chǔ)存器負(fù)載DFO，然后通過逐層組裝(LBL)技術(shù)沉積殼聚糖(CHI)和明膠(Gel)多層覆蓋結(jié)構(gòu)，得到TNT-DFO-LBL支架，其所構(gòu)建的支架TNT-DFOLBL在12 h DFO釋放率相對(duì)較低，約為47.6%，后期釋放穩(wěn)定、適度，7 d釋放90%左右。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNT-DFO-LBL支架可通過激活HIF-1a信號(hào)通路上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管分化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)了成骨和成血管。以上研究均利用DFO構(gòu)建了支架材料，并驗(yàn)證了DFO可在成骨和成血管方面發(fā)揮雙重作用。

目前，DFO載藥組織工程支架對(duì)成骨和成血管效果已經(jīng)得到了普遍的公認(rèn)，且其設(shè)計(jì)在生物相容性、可降解性及釋放時(shí)間方面都取得了一定進(jìn)展，然而DFO在載藥支架中的釋放依然普遍存在早期快速釋放，后期緩慢釋放的特征。使載藥支架同時(shí)滿足與骨新生相匹配的降解和在藥物釋放量上得到長(zhǎng)期穩(wěn)定緩慢的釋放依然是未來支架設(shè)計(jì)研究的重點(diǎn)。

4 展望

DFO是一種鐵螯合劑，已獲得食品和藥物管理局的批準(zhǔn)，并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中治療與鐵超載相關(guān)的疾病。其在血管再生方面的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，目前很多研究者開始將去鐵胺的研究范圍擴(kuò)大到了骨組織再生領(lǐng)域。DFO在體內(nèi)發(fā)揮作用的方式主要有局部注射和載藥組織工程支架兩種，局部注射和載藥組織工程支架都已經(jīng)展現(xiàn)出了良好的骨再生效果，但DFO最理想的劑量，臨床可能存在的副作用和最合理的用藥方式如支架設(shè)計(jì)方案和注射療程也還有待進(jìn)一步深入研究。