siRNA干擾LOXL2基因在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的相關(guān)性研究

王 猛，王 品，黃 謙，沈 劍，曾佳佳，蔣濤濤

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 1.燒傷整形外科；2.超聲影像科；3.產(chǎn)科 廣東 深圳 518109）

瘢痕疙瘩（Keloid）是整形外科研究的難題之一，它是一種皮膚纖維化疾病，被認(rèn)為是皮膚的良性腫瘤[1]。該病的特征是瘢痕超出最初損傷邊緣呈浸潤性生長[2]，且無自行消退傾向。瘢痕疙瘩不僅影響美觀，還能引起疼痛、瘙癢等伴隨癥狀，若發(fā)生在關(guān)節(jié)部位還有可能影響關(guān)節(jié)功能，造成患者終生的痛苦。瘢痕疙瘩目前多采用瘢痕疙瘩內(nèi)藥物注射、外科手術(shù)、局部放療、加壓療法等多種治療方案相結(jié)合來治療，但療效大都不盡如人意，因此該疾病的治療仍是一個世界性難題[3-8]。賴氨酰氧化酶樣蛋白2（Lysyl oxidase like 2，LOXL2）屬于賴氨酸氧化酶（LOX）家族，LOXL2基因定位于人類染色體8p21.3，編碼蛋白質(zhì)含744個氨基酸殘基，分子質(zhì)量約87kD，可激活膠原蛋白和彈力蛋白的賴氨酸殘基，引起膠原蛋白和彈力蛋白的交聯(lián)，還可通過細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長增殖。此外，張浩[9]等研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2可能在增生性瘢痕發(fā)病中發(fā)揮重要作用，是一個新的潛在的治療靶點(diǎn)。因此，本研究欲探索抑制LOXL2表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFs）增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響，以期為防治病理性瘢痕提供科學(xué)的理論導(dǎo)向。

1 資料和方法

1.1 正常皮膚離體標(biāo)本10例：取皮膚外科修整“貓耳”切除術(shù)中切除的正常皮膚組織作為立體標(biāo)本。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①性別不限；②年齡18～60歲；③排除重大系統(tǒng)疾患；④組織標(biāo)本采集前獲得所有患者的知情同意，患者在手術(shù)協(xié)議書上簽字同意手術(shù)；⑤研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 瘢痕疙瘩標(biāo)本10例：取自2017年01月-2020年01月深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院整形外科門診及住院手術(shù)患者經(jīng)手術(shù)切除的瘢痕組織作為離體標(biāo)本。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①參考2018年的《中國瘢痕疙瘩臨床治療推薦指南》，符合瘢痕疙瘩的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②瘢痕邊緣呈“蟹足狀”樣突起，質(zhì)地堅硬；病理組織學(xué)檢查證實所取瘢痕疙瘩組織內(nèi)有膠原及基質(zhì)成分的大量沉積，成纖維細(xì)胞很多，并有分裂像；皮損處無感染病灶；病程大于1年且無自愈傾向、無自行消退；③皮損處未接受過任何藥物、放射、激光等治療；④排除其他重大系統(tǒng)性疾??；⑤年齡18～60歲，性別不限；⑥研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。瘢痕疙瘩基線資料見表1。

表1 基線資料表

1.3 試劑：DEME培養(yǎng)基、胎牛血清和PBS(美國Gibco公司)；CCK-8試劑(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(大連 Meilunbio生物技術(shù)有限公司)；DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen 公司)；PCR引物、小干擾RNA（Small interfering RNA,siRNA）由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFs）及正常皮膚成纖維細(xì)胞（NFs）的獲取和培養(yǎng)：將收集的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中，用含青、鏈霉素（1 000 U/ml）的無菌PBS反復(fù)漂洗至無血色；無菌眼科剪去除表皮、結(jié)締組織和血管，用眼科剪反復(fù)剪切成1～3 mm2的小碎塊，并分散接種于經(jīng)FBS潤濕的5 cm×5 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；倒置培養(yǎng)瓶并加1 ml 50% FBS完全培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；8～12 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)至鏡下可見長梭形的細(xì)胞爬出（約3～5 d），每隔2～3 d更換一次50% FBS完全培養(yǎng)基；待原代細(xì)胞爬滿大部分培養(yǎng)瓶底時，敲除組織塊；PBS洗滌2遍，更換一次50% FBS完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。待原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至單層時加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。選取第4～6代的成纖維細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 qRT-PCR檢測KFs及NFs中的LOXL2 mRNA的表達(dá)：取凍存正常皮膚和瘢痕疙瘩組織置于預(yù)冷研缽，加液氮后研磨至粉末，移入勻漿器中。Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。LOXL2引物序列：上游（F），5’-GTGGATCTGGCACGACTGTCA-3’；下游（R），5’-TTGAGCTTCAGCAGGTCATAGTGG-3’。GAPDH引物序列：上游（F），CCCTTCATTGACCTCAACTACAR；下游（R），5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。根據(jù)試劑盒及儀器使用說明書，設(shè)置實驗程序反應(yīng)溫度及時間。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2 min，95℃ 10 s，退火60℃ 1 min，延伸70℃，40個循環(huán)，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)qPCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，并按照2-△△t方法進(jìn)行運(yùn)算，從而得出相應(yīng)的結(jié)論。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取第4～6代的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，分為3組（KF組、si-NC、si-LOXL2），使用Primer Premier 6.0設(shè)計LOXL2特異性小的干擾RNA。si-LOXL2組RNA序列，5'-CAGUCUAUUAUAGUCACAU-3'；si-NC組（陰性對照組）RNA序列，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法合成，使用LipofectamineTM2000按照說明書將脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染三組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，詳細(xì)步驟見說明書。

1.7 Western Blot檢測3組相關(guān)蛋白表達(dá)情況：提取樣本總蛋白，進(jìn)行蛋白定量后，各取50μg蛋白樣本上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將其放入TBST配制的5%脫脂奶粉中封閉1 h。一抗孵育：取下PVDF膜用PBST漂洗1次，再小心把一抗稀釋（按說明書配制通常為，抗體:稀釋液=1:5 000）滴入孵育膜中，4℃搖床過夜。二抗孵育：使用二抗稀釋液（按說明書配制通常為，抗體:稀釋液=1:5 000），滴入PBST洗滌3次的PVDF，孵育，室溫?fù)u床1 h，取膜置于PBST洗滌3次，每次10 min，再轉(zhuǎn)入干凈PBST中。顯影：在暗室中，使用ECL化學(xué)發(fā)光法，按照試劑盒說明書進(jìn)行顯影，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀采集，顯影所得條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。

1.8 CCK-8檢測KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達(dá)組（si-LOXL2）的細(xì)胞增殖能力：分別取轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h的3組實驗細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個/毫升，接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)48 h后，加入10μL的CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測測定450 nm波長各孔的吸光度值，取均值繪制生長曲線。

1.9 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測3組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡情況：取對數(shù)生長周期的3組細(xì)胞培養(yǎng)24 h。調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×105，PBS洗滌2次，加入100 μl Binding Buffer和10 μl FITC標(biāo)記的Annexin-V，室溫避光30 min，再加入5 μl PI，避光反映5 min后，加入400 μl Binding Buffer，試劑分別加入離心管中重懸細(xì)胞，要求細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106細(xì)胞/毫升；上機(jī)定量檢測。結(jié)果計算方法：細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/正常細(xì)胞數(shù)量)×100%。

1.10 TransweⅡ細(xì)胞侵襲實驗：在無菌條件下冰浴融化Matrigel，用PBS稀釋成1 mg/ml，-20℃凍存?zhèn)溆?。取出已?jīng)稀釋好的Matrigel，冰浴融化，以50 ml的體積鋪于TramweⅡ小室（24孔板），37℃放置1 h，使Matrigel聚合成凝膠。每孔加入200 μl 1640培養(yǎng)基使凝膠重構(gòu)。在Transwell下室中加入趨化因子。在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞1×105個/孔，KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達(dá)組（si-LOXL2）后，對數(shù)生長期細(xì)胞制備懸液后取200 μl，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)時間結(jié)束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上微穿過膜的細(xì)胞。4%中性甲醛固定10 min，Giemsa染色10 min，PBS洗滌3次，干燥，取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下直接觀察穿過膜的細(xì)胞

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 26.0分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，多組采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表達(dá)：運(yùn)用qRT-PCR檢測兩組組織中LOXL2 mRNA相對表達(dá)水平，分別為1.002±0.158 vs 0.465±0.104，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表達(dá)

2.2 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達(dá)組（si-LOXL2）成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況：運(yùn)用Western Blot檢測三組LOXL2蛋白含量，si-LOXL2組對比其他兩組，LOXL2蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 三組瘢痕成纖維細(xì)胞的LOXL2蛋白含量

2.3 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達(dá)組（si-LOXL2）細(xì)胞增殖情況：通過CCK-8實驗結(jié)果顯示，接種24 h后各組成纖維細(xì)胞增殖能力無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；48 h時后KFs組與si-NC組成纖維細(xì)胞增殖活性逐漸增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；si-LOXL2組在48 h及72 h時生長速度低于其他組，降低程度與si-NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示抑制LOXL2基因表達(dá)能抑制成纖維細(xì)胞增殖，見表2，圖3。

表2 三組瘢痕成纖維細(xì)胞不同時段的OD值 （±s）

表2 三組瘢痕成纖維細(xì)胞不同時段的OD值 （±s）

組別 時間 0 h 24 h 48 h 72 h KFs組 0.490±0.021 0.530±0.014 0.791±0.020 1.130±0.125 si-NC組 0.496±0.023 0.535±0.024 0.790±0.030 1.248±0.015 si-LOXL2組 0.493±0.025 0.550±0.023 0.520±0.021 0.435±0.016

圖3 三組瘢痕成纖維細(xì)胞不同時段OD值

2.4 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達(dá)組（si-LOXL2）細(xì)胞凋亡情況：運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測，KFs組與si-NC組細(xì)胞凋亡未見明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。si-LOXL2組相對其他兩組細(xì)胞凋亡明顯增加，發(fā)現(xiàn)凋亡程度與si-NC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），特別是細(xì)胞早期凋亡，提示抑制LOXL2可以促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖4 三組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡情況

2.5 si-RNA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲的影響：通過TransweⅡ小室檢測三實驗組細(xì)胞，si-NC組與KFs組細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小室下壁的細(xì)胞數(shù)目無明顯差別，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而si-LOXL2組細(xì)胞數(shù)明顯減少，抑制LOXL2可明顯降低KF細(xì)胞侵襲性，與si-NC組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 三組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲性情況

3 討論

瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維增生性疾病，其病理特征主要是皮膚受損后成纖維細(xì)胞大量增殖，以及以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度增生和沉積[11-12]，較少自行消退，多數(shù)將伴隨著患者的一生。學(xué)者認(rèn)為瘢痕疙瘩形成與腫瘤相關(guān)基因的遺傳和表觀遺傳改變有關(guān)。因此尋找瘢痕疙瘩的相關(guān)調(diào)控基因已成為當(dāng)前瘢痕研究的熱點(diǎn)之一。然而，瘢痕疙瘩的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全了解[13]。近些年來，研究者發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的過度增殖和膠原的堆積沉淀可能與某些原癌基因和抑癌基因的突變有關(guān)[14-15]。

賴氨酰氧化酶樣2（LOXL2），一種促進(jìn)細(xì)胞外間質(zhì)膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的酶。通過細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長增殖，在多種腫瘤中高表達(dá)[16-20]，抑制LOXL2可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制侵襲等相關(guān)生物特性。Puente[21]等人發(fā)現(xiàn)LOXL2抑制劑能減少瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞數(shù)量、增殖、集落形成和細(xì)胞生長，并能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和增加細(xì)胞凋亡。Matsuo[22]等人發(fā)現(xiàn)抑制LOXL2表達(dá)可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞前體標(biāo)志物的表達(dá)、原肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)以及肺成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞的進(jìn)化.Mohseni[23]通過靶向賴氨酰氧化酶（LOX）發(fā)現(xiàn)可以減緩肝纖維化進(jìn)程，考慮其抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1通路從而抑制成纖維細(xì)胞增值及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。另有研究者發(fā)現(xiàn)抑制LOXL2不僅僅能抑制細(xì)胞纖維化，還能作用于加速膠原降解，促進(jìn)MMPs分泌[24]。Wu[25]在肝細(xì)胞癌體外實驗中發(fā)現(xiàn)上調(diào)LOXL2表達(dá)能激活了JNK/c-JUN信號通路影響纖連蛋白產(chǎn)生、MMP9的表達(dá)、細(xì)胞粘附等，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)合成。因此，LOXL2在創(chuàng)傷愈合[26]、器官纖維化[27]、腫瘤侵襲[28]等過程中發(fā)揮重要作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)LOXL2基因在瘢痕疙瘩中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)其一方面可能通過激活了JNK/c-JUN信號通路影響纖連蛋白生成、MMP、細(xì)胞黏附等，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展，而另一方面可能間接激活TGF-β通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)合成以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，形成瘢痕疙瘩[29]。此次研究通過抑制LOXL2轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡等相關(guān)生物特性。提示LOXL2可能是一個新的潛在的治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于LOXL2在瘢痕成纖維細(xì)胞中具體介導(dǎo)了哪些信號通路還有待深入研究。