以程序性壞死為靶點(diǎn)的動脈粥樣硬化研究進(jìn)展

遲俊鵬 蔣峻宇 廖俊進(jìn) 劉涵睿 趙輝

安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種累及動脈壁損傷并形成纖維脂肪斑塊的一種病變，近年來發(fā)病率逐年增多且呈日趨年輕化。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死、卒中等為引起動脈粥樣硬化患者死亡的主要原因。細(xì)胞程序性壞死是一種受精密調(diào)控的非凋亡性細(xì)胞死亡方式，其參與了炎癥性反應(yīng)、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生。細(xì)胞程序性壞死受細(xì)胞自噬、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換等多因素共同調(diào)節(jié)。有研究證實(shí)，在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中，細(xì)胞程序性壞死也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。因此，深入了解程序性壞死在動脈粥樣硬化中的作用和分子調(diào)節(jié)機(jī)制，有望為動脈粥樣硬化提供有效的臨床治療靶點(diǎn)。

1 程序性壞死

細(xì)胞死亡的三大經(jīng)典類型：凋亡、自噬和壞死。細(xì)胞的凋亡和自噬是高度調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，壞死是一種不受控制的細(xì)胞死亡。細(xì)胞程序性壞死，通常也被稱作“壞死性凋亡”，是有別于傳統(tǒng)壞死的可調(diào)控的一種新的細(xì)胞死亡方式。

壞死是一種細(xì)胞死亡形式，其通常的特征是組織、細(xì)胞的自溶性變化，涉及多種促炎因子和化合物蛋白的上調(diào)。而程序性壞死一旦發(fā)生，壞死細(xì)胞將迅速喪失胞質(zhì)膜的完整性并釋放胞內(nèi)的促炎因子，引起顯著的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為大量的炎性細(xì)胞浸潤和激活。程序性壞死的發(fā)生是由受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）和受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain like protein，MLKL）作為其執(zhí)行分子導(dǎo)致胞膜裂解，執(zhí)行程序性壞死。

程序性壞死可以分成三類：由腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）引起的外始式程序性壞死；由缺血誘導(dǎo)的內(nèi)始式程序性壞死；以及由活性氧類引起的內(nèi)始式程序性壞死。目前研究表明，凋亡由內(nèi)源性的線粒體參與啟動，而程序性壞死不需要線粒體參與，也不依賴于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的活化和隨后的級聯(lián)反應(yīng)，其調(diào)控有自己特有的機(jī)制和體系。另外，程序性壞死也可以通過釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）來啟動炎癥反應(yīng)，盡管早期程序性壞死的發(fā)生是用來保護(hù)細(xì)胞或組織免受病原體的入侵，但是晚期發(fā)生的氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老，進(jìn)而促發(fā)的慢性炎癥等都將對機(jī)體產(chǎn)生不利的信號。

2 程序性壞死分子調(diào)控機(jī)制

程序性壞死的分子調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜多樣，它與細(xì)胞的壞死和凋亡有著密切的聯(lián)系和區(qū)別。目前已知的較經(jīng)典的調(diào)控機(jī)制是TNF-α 介導(dǎo)的程序性壞死，即TNF-α-RIP1/3-MLKL 通路。TNF-α 是一種重要的促炎因子，與細(xì)胞膜上的受體TNFR 結(jié)合，受體招募TRDD、RIPK1 等形成復(fù)合體Ⅰ，接著復(fù)合體Ⅰ脫離TNFR，由RIPK1、RIPK3、FADD、TRADD、caspase-8形成復(fù)合體Ⅱ，如果caspase-8 失活，則RIPK1 和RIPK3 將能夠相互磷酸化，從而成為壞死小體。RIPK1 和RIPK3 磷酸化后獲得激酶活性，將MLKL磷酸化，使其獲得活性進(jìn)行調(diào)控。Hu等通過建立大鼠心肌缺血/再灌注模型和缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型并研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制H9c2 細(xì)胞的壞死，可能是通過抑制TNF-α-RIP1/3-MLKL 信號通路，進(jìn)一步保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的損傷。

而當(dāng)病原體（病毒）釋放核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，就會激活內(nèi)源性的程序性壞死通路。Z-DNA 結(jié)合蛋白1（Z-DNA binding protein 1,ZBP1）能夠識別并結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA 分子，同時(shí)激活RIPK3，使其磷酸化，獲得激酶活性。激活的RIPK3 磷酸化MLKL，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死。該通路不需要RIPK1 的參與，TOLL 樣受體3（toll-like receptor，TLR3）能夠識別并結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA 分子，并通過結(jié)合的TOLL樣受體銜接分子招募并磷酸化RIPK1 和RIPK3，從而促進(jìn)壞死小體的生成，誘發(fā)程序性壞死。

3 動脈粥樣硬化中的程序性壞死

動脈粥樣硬化是一種發(fā)生在大中動脈管壁上的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病。動脈粥樣硬化發(fā)展至晚期，不穩(wěn)定斑塊破裂導(dǎo)致的急性血栓和心肌梗死是嚴(yán)重威脅人類健康的主要原因。

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是一種具有血管活性和細(xì)胞保護(hù)作用的神經(jīng)肽，其主要通過PAC1受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮作用，于是有學(xué)者利用PAC1（-/-）小鼠測定動脈粥樣硬化斑塊中的程序性壞死和炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)程序性壞死的標(biāo)志物和免疫反應(yīng)信號有所增加，表明在動脈粥樣硬化的小鼠中的確有細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。已經(jīng)有研究表明：參與程序性壞死的RIPK1、RIPK3 和MLKL 在動脈粥樣硬化形成中具有重要作用。Zhao等和Colijn等的研究表明，敲除RIPK3 并誘導(dǎo)小鼠動脈粥樣硬化，能夠增強(qiáng)動脈粥樣硬化小鼠斑塊的穩(wěn)定性，甚至在發(fā)生動脈粥樣硬化的主動脈處幾乎檢測不到程序性壞死的標(biāo)記物，也表明RIPK3 參與的程序性壞死在動脈粥樣硬化中起著關(guān)鍵性作用。

然而，也有研究表明，程序性壞死在動脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展過程中起到加速作用，程序性壞死可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化的發(fā)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞中RIPK3等相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)，能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞程序性壞死，引發(fā)炎癥，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。在動脈粥樣硬化疾病的發(fā)展過程中，一些炎癥因子如白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、TNF-α和一些單核細(xì)胞、多核細(xì)胞在病變中的積累都能夠引起促炎反應(yīng)，加劇炎癥在動脈粥樣硬化中的發(fā)展，而程序性壞死又導(dǎo)致泡沫細(xì)胞死亡，更加加速了動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

值得注意的是，作為程序性壞死執(zhí)行者的MLKL，在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但其磷酸化也決定著細(xì)胞壞死的路徑。目前最新的研究表明：如果只敲除或低表達(dá)MLKL，將導(dǎo)致脂質(zhì)運(yùn)輸缺陷，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)沉積。低表達(dá)MLKL 能減少動脈粥樣硬化的壞死核心，卻增加了巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。Zhao等通過鎘暴露增加MLKL 基因的表達(dá)，證明了FPR2/ TGF-β/NF-κB 通路能夠引起豬心肌壞死，也表明動脈粥樣硬化中程序性壞死的執(zhí)行分子MLKL 也在細(xì)胞壞死中發(fā)揮著重要作用。

4 以程序性壞死為靶點(diǎn)的AS 治療

在過去的幾十年里，動脈粥樣硬化的治療主要集中在降脂層面，主要是通過使用他汀類藥物來實(shí)現(xiàn)，然而此類藥物需長期服用，且對部分患者療效不佳，不能有效延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程。

近年來隨著對程序性壞死的深入研究，研究發(fā)現(xiàn)了一些能特異性抑制程序性壞死相關(guān)靶點(diǎn)蛋白的小分子物質(zhì)，使人為地調(diào)控程序性壞死的發(fā)生和發(fā)展成為可能。其中最先發(fā)現(xiàn)的是特異性的小分子抑制劑（necrostatin-1，Nec-1），后來通過研究陸續(xù)出現(xiàn)了necrostatins 家族的Nec-3、Nec-5 和GSK963等特異性藥物，這些藥物能夠強(qiáng)效地、選擇性作用于RIPK1，從而實(shí)現(xiàn)抑制動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的程序性壞死。以Nec-1 為例，通過抑制RIPK1 的活性，進(jìn)而抑制了RIPK1-RIPK3 復(fù)合體的形成，阻斷了下游的程序性壞死。此外有最新的研究采用Nec-1 類似物（Z）-5-（3,5-dimethoxybenzyl）-2-imine-1-methylimidazolin-4-1（DIMO）通過其自噬途徑來抑制程序性壞死，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIMO 能夠減少心肌細(xì)胞的死亡、抑制RIPK1 的表達(dá)，具有心血管方面的保護(hù)作用。因此，本研究認(rèn)為，necrostatins家族的藥物及其類似物將來會成為研究程序性壞死抑制劑的新熱點(diǎn)。

目前RIPK1 抑制劑已被成功應(yīng)用于動脈粥樣硬化小鼠模型，以抑制程序性壞死，其不僅可以抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生還能調(diào)控粥樣斑塊的穩(wěn)定性。因此，靶向抑制程序性壞死可能是一種新的治療干預(yù)策略。最新研究結(jié)果表明，TLR4/NFκB p65 通路抑制劑Klotho 蛋白，可以減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的程序性壞死，提示Klotho 蛋白也可能是一種潛在的程序性壞死的抑制劑。Sohrabi等在RIPK1 缺陷樣本中發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力顯著降低，還發(fā)現(xiàn)RIPK1 敲除的小鼠的動脈粥樣硬化病變程度明顯下降，因此該團(tuán)隊(duì)也認(rèn)為靶向抑制RIPK1 能夠延緩慢性代謝性疾病的進(jìn)展，可能具有一定的治療作用。

但需要認(rèn)識到，程序性壞死是由多種分子機(jī)制共同參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，因此單一作用的抑制劑可能達(dá)不到最佳治療效果。而且一些程序性壞死的發(fā)生?？梢圆灰蕾囉赗IPK1，因此其下游的RIPK3和MLKL 也可能是動脈粥樣硬化程序性壞死的潛在治療靶點(diǎn)。當(dāng)前，已經(jīng)有學(xué)者設(shè)計(jì)出了RIPK3 的Ⅱ型DFG-out 抑制劑，也有學(xué)者分析比較了MLKL 抑制劑NSA 與化合物TC13172 的療效差異，為靶向MLKL 的藥物也提供了新思路。

綜上所述，他汀類藥物和程序性壞死抑制劑聯(lián)合治療，或利用RIPK1、RIPK3 和MLKL 等靶點(diǎn)進(jìn)行單一或聯(lián)合多靶點(diǎn)的藥物開發(fā)和研究，將成為進(jìn)一步推動動脈粥樣硬化治療進(jìn)展的新方向。

5 小結(jié)與展望

動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全過程，有多種不同的細(xì)胞死亡方式參與，其中細(xì)胞凋亡和程序性壞死是破壞病變部位血管、導(dǎo)致易損斑塊形成最重要的影響因素。近年來的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證明，在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，程序性壞死被顯著激活，從而導(dǎo)致斑塊內(nèi)RIPK3 和MLKL 的mRNA 表達(dá)量顯著增加，因此，近年來，隨著研究的進(jìn)一步深入，程序性壞死與動脈粥樣硬化之間的聯(lián)系更加緊密，程序性壞死在動脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮的作用逐漸明晰，但相關(guān)機(jī)制仍需大量研究進(jìn)一步明確。

當(dāng)前，調(diào)節(jié)程序性壞死的信號通路的相關(guān)研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，為對治療心腦血管疾病指明了新的方向。抑制動脈粥樣斑塊內(nèi)細(xì)胞的程序性壞死，阻斷其信號通路很可能成為未來治療動脈粥樣硬化的一個新熱點(diǎn)。靶向抑制RIPK3 和MLKL 可能是一種新的治療策略，為相關(guān)藥物的開發(fā)和研制提供新的思路。在他汀類藥物治療的基礎(chǔ)上加用程序性壞死的抑制劑可能是心血管疾病預(yù)防和治療的前沿性用藥策略。

需要明確的是，程序性壞死抑制劑不能阻斷動脈粥樣硬化斑塊中所有介導(dǎo)壞死的信號通路，對程序性壞死的相關(guān)靶點(diǎn)，如RIPK1、RIPK3 和MLKL之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步深入研究。因此，開發(fā)安全有效的抑制劑將成為未來對動脈粥樣硬化治療的研究重點(diǎn)。