血漿環(huán)狀RNA 在心血管疾病中的研究進展

張萌 高山 饒宏宇 李丹陽

1.佳木斯大學研究生部，黑龍江佳木斯 154000；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)三科，黑龍江佳木斯 154002

近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展及人民生活水平的不斷提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年升高。目前，該病已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民死亡的最主要原因，據(jù)統(tǒng)計農(nóng)村心血管疾病占比總死亡率的46.66%，城市的則占比43.81%。

心血管疾病的早期診斷可以及時發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)功能的異常并給予相應治療，對提高患者的生存率及生活質(zhì)量起到非常重要的作用，但目前缺少一種經(jīng)濟、方便的心血管疾病早期診斷的生物學標志物。circRNA作為一類豐富、穩(wěn)定、保守的非編碼RNA 慢慢地進入了科學研究者的視野。在對人類、小鼠和線蟲RNA進行的測序和計算分析中發(fā)現(xiàn)了豐富表達的circRNA，它不僅非常穩(wěn)定且具有組織及發(fā)育不同階段的特異性表達。目前已有多種研究證實circRNA在高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及心力衰竭及急性心肌梗死等多種心血管疾病中出現(xiàn)差異性表達，證明circRNA 參與到了心血管疾病的發(fā)病過程中，且有潛力成為早期診斷的生物標志物之一。

1 circRNA 的特征及功能

circRNA 是一種反向剪接形成的缺乏游離3’端和5’端共價閉合的環(huán)狀分子，其生物學特征可簡單歸納為具有組織特異性、種類及數(shù)量繁多、性狀穩(wěn)定、物種間高度保守、功能復雜等特點。Memczak等通過高通量測序手段在人、小鼠及線蟲體內(nèi)檢測到數(shù)千個表達良好、穩(wěn)定的環(huán)狀RNA，且通常表現(xiàn)出組織及發(fā)育階段的特異性表達。Jeck等通過全基因組RNA 外切酶富集策略及高通量測序方法得出circRNA 具有物種間高度保守的特征。circRNA 的上述特征在一定程度上決定了circRNA 具有復雜的生物學功能。

circRNA 早期只被認為是在翻譯過程中發(fā)生錯誤剪接形成的沒有功能的產(chǎn)物，并沒有得到廣泛重視，近年來隨著高通量測序技術的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)了circRNA 豐富的生物學功能，且圍繞其功能的研究也逐漸深入。目前circRNA 最廣為人知的功能是作為miRNA 海綿，競爭性與miRNA 結(jié)合，阻止miRNA 與mRNA 的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，進而影響mRNA 的翻譯過程，從而發(fā)揮相應的生物學作用。第一個被發(fā)現(xiàn)具有miRNA 海綿功能的環(huán)狀RNA 是ciRS-7，它能與miR-7 結(jié)合從而降低其生物活性。此外circRNA 還可以調(diào)節(jié)RNA 的轉(zhuǎn)錄，研究發(fā)現(xiàn)circRNA 可以在細胞核內(nèi)與磷酸化的RNA 聚合酶II相互結(jié)合，從而改變其轉(zhuǎn)錄活性。相關研究證明，circRNA 還具有調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性的功能，且可以參與蛋白質(zhì)的翻譯及通過與蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合蛋白的生物活性。

此外，更值得一提的是circRNA 在蛋白質(zhì)翻譯功能方面的新發(fā)現(xiàn)：circRNA 的m6A 修飾。N6 甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物中最豐富的RNA 內(nèi)部修飾，有研究發(fā)現(xiàn)它可以通過起始因子eIF4G2 和m6A 讀取器YTHDF3 的幫助下促進人類細胞中circRNA 蛋白質(zhì)翻譯的有效啟動，開拓了對circRNA 功能的研究，證實了其具在翻譯方面具有很大的潛力。

2 各種心血管疾病患者血漿中circRNA的變化情況

circRNA 在血漿中主要存在于外泌體內(nèi)，以外泌體為載體在體內(nèi)進行運輸并行使各種生物學功能。外泌體是由多種細胞分泌的納米級大小的囊泡，其中含有特定的蛋白質(zhì)、mRNA 和circRNA 等非編碼RNA。它們可以作為細胞間的信使，參與細胞內(nèi)的各種活動、調(diào)節(jié)受體細胞的行為，并可能作為生物標志物用于診斷人類疾病。外泌體中的circRNA 水平與線性RNA 水平之比約為細胞中circRNA 與線性RNA 比值的6 倍，說明circRNA 比線性RNA 更容易被納入外泌體中，且由于外泌體或某些特定的序列特征和蛋白伴侶的保護使得其非常穩(wěn)定。血漿的采取具有方便、快捷、經(jīng)濟等突出優(yōu)點，且已經(jīng)成為經(jīng)典的臨床檢驗標本，但目前血漿circRNA在心血管疾病中的研究仍有較大的發(fā)展空間，本文從不同疾病角度列舉了血漿circRNA 方面的研究進展。

2.1 外周血circRNA 與冠狀動脈疾病

冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）又稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD），其是一種由冠狀動脈結(jié)構(gòu)或功能異常引起的心臟病，包括穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、非ST 段抬高型心肌梗死、ST 段抬高型心肌梗死，以及心源性猝死、缺血性心肌病等。近年來CAD 的發(fā)病率及死亡率日漸上升。丁汀等建立冠心病組及健康對照組共6 例，采集外周血通過circRNA 芯片技術進行差異性表達分析發(fā)現(xiàn)冠心病組外周血中差異性表達的circRNA 共有116 個，其中上調(diào)74 個，下調(diào)42 個，通過變化倍數(shù)及P 值篩選及生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0007059 對冠心病的發(fā)生及發(fā)展過程中可能產(chǎn)生一定影響。張帥等研究者同樣建立CAD 組58 例及健康對照組47 例，分別采取外周血并進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR，qPCR）檢測后發(fā)現(xiàn)CAD組的患者外周血內(nèi)的circMICRA 表達較健康對照組降低，且發(fā)現(xiàn)circMICRA 的升高及降低與冠脈動脈粥樣硬化的程度有一定關系，冠脈動脈粥樣硬化程度越重circMICRA 越低，且circMICRA 能夠與不同種類miRNA 結(jié)合在CAD 的病理過程的炎癥途經(jīng)發(fā)揮一定的保護作用。李夢蘭等同樣采用RT-qPCR方法檢測CAD 患者和健康人群外周血circDLGAP4的表達水平，并進行統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的外周血中的單核巨噬細胞及白細胞在泡沫化進程中circDLGAP 4 的表達水平有明顯降低的趨勢。同時，其可能在CAD 病理生理發(fā)展進程中起到一定保護作用。還有研究通過生物信息分析，并進行性數(shù)據(jù)整合最后構(gòu)建一個circRNA 調(diào)控網(wǎng)絡，確定了hsa_circ_002075、hsa_circ_0020387 等9 個可能參與到CAD 發(fā)病機制中的circRNA。

2.2 血漿circRNA 與心肌梗死

心肌梗死是目前全球范圍內(nèi)人類發(fā)病和死亡的主要原因。心肌梗死發(fā)生后，心肌細胞由于缺血缺氧而發(fā)生損傷、壞死激活炎癥級聯(lián)反應，纖維細胞過度增生發(fā)生心肌重構(gòu)，從而使心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生一定程度的改變。目前已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在心肌梗死發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程中扮演了重要的角色。熊瑋等通過收集急性前壁心肌梗死患者外周血進行circRNA 芯片篩選差異表達的circRNA 發(fā)現(xiàn)，急性前壁心肌梗死的患者與健康對照組相比外周血中，circRNA 發(fā)生了明顯的差異表達，其中上調(diào)的circRNA 占總差異表達的52.2%，下調(diào)占47.8%，通過變化倍數(shù)及值篩選及生物信息學分析后，發(fā)現(xiàn)circRNA 30741 可能會通過與miRNA-21結(jié)合從而參與到急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過程中。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，MTP18 缺乏可抑制線粒體分裂，抑制心肌細胞凋亡和心肌梗死的發(fā)生。而一種與線粒體分裂和凋亡相關的circRNA：MFACR，可以通過海綿結(jié)合miR-652-3p 抑制其活性，使miR-652-3p 對MTP18 的抑制作用減弱，從而在一定程度上增加了心肌細胞的凋亡，然而通過對小鼠心肌細胞MFACR 基因的敲除可減弱線粒體分裂和心肌細胞的凋亡，揭示了circRNA 在調(diào)節(jié)心肌細胞線粒體動力學和凋亡中的關鍵作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，預測circRNA 可能成為心血管疾病的一種的潛在治療靶點。朱舟洋等在研究中發(fā)現(xiàn)一種名為circRNA-0007478 的circRNA 在急性心肌梗死患者外周血中的表達量較健康患者明顯升高，且發(fā)現(xiàn)circRNA-0007478 或許可以達到預測患者冠脈病變的嚴重程度，使其具有很大潛力可以作為早期預測心肌梗死發(fā)生發(fā)展的生物學標志物。

2.3 外周血circRNA 與心力衰竭

心力衰竭的特征是復雜的組織重構(gòu)，包括心肌細胞死亡的增加、血管內(nèi)皮和功能受損，以及炎癥和間質(zhì)纖維化增加。這些因素使得心臟的收縮及舒張功能受損，所以改善心肌組織重構(gòu)成為治療心力衰竭的重要手段。已有研究表明，circRNA 在心臟重塑的過程中起到了一定的調(diào)節(jié)作用。Si等通過實驗發(fā)現(xiàn)心肌細胞（cardiomyocytes，CM）在體外和體內(nèi)的增殖被一種名為circHipk3 的circRNA 的敲除所抑制，而隨著circHipk3 過表達可使心肌細胞的增殖增加。此外，circHipk3 的過表達還促進了冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移能力以及隨后的血管生成。更為重要的是，circHipk3 的過量表達減輕了心肌梗死后的心臟功能的改變并減少了纖維化面積。從機制上講，circHipk3 通過增加Notch1 細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch1 intracellular structural domain，N1ICD）的乙?；?，從而增加N1ICD 的穩(wěn)定性并阻止其降解，促進了CM 的增殖。此外，circHipk3作為miR-133a 的海綿，促進結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達，從而激活內(nèi)皮細胞。Si等通過以上發(fā)現(xiàn)推測，circHipk3 可能是預防心肌梗死后心力衰竭的一個新的治療目標。

Sun等調(diào)查了心力衰竭患者血漿中差異表達的circRNA，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比慢性穩(wěn)定型心力衰竭患者組有696 個顯著差異表達的circRNA，包括477 個上調(diào)和219 個下調(diào)的circRNA。通過qRT-PCR驗證了其中5個circRNA，發(fā)現(xiàn)其中hsa_circ_0062960在心力衰竭患者中的表達差異最大，診斷價值最高。此外，hsa_circ0062960 還顯示出與血清腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平的強相關性，后者是公認的心力衰竭（heart failure，HF）生物標志物。

2.4 血漿circRNA 與心律失常

最近Zhang等研究者通過對769 例非體外循環(huán)冠狀動脈旁路移植術后伴或不伴房顫患者的血漿circRNA 表達譜進行分析研究，發(fā)現(xiàn)與非房顫患者相比，新發(fā)房顫患者的血漿中hsa_circRNA025016 的表達明顯上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)其具有較高的診斷準確性，從而推斷hsa_circ_025016 可能是預測非體外循環(huán)冠狀動脈旁路移植術后新發(fā)房顫的潛在生物標志物，有提高預防性治療的效果。Yang等發(fā)現(xiàn)心律失常中一些miRNA 如miR-1 發(fā)揮了重要的作用。miR-1 在冠狀動脈疾病患者中過度表達，且在正常或梗死的大鼠心臟中過度表達時，會加劇心律失常。在梗死的大鼠心臟中通過反義抑制劑消除miR-1 可緩解心律失常。而李根等通過starBase 進行了進一步的分析預測后發(fā)現(xiàn)了454 個與miR-1 結(jié)合的circRNA，這樣就證明可能有大量的circRNA 也參與到了心律失常的發(fā)生和發(fā)展過程中。然而目前對于circRNA在心律失常的領域研究的尚且不夠深入，circRNA 在心律失常中扮演的角色還有非常寬廣的空間有待更深入的研究發(fā)現(xiàn)。

3 思考與展望

近年來，隨著生物信息學的快速發(fā)展和高通量測序技術的廣泛應用，使得circRNA 逐漸走進科學研究者的視線，越來越多圍繞circRNA 結(jié)構(gòu)功能及其在疾病發(fā)展進程中發(fā)揮的作用的研究已經(jīng)開展。由于circRNA 不易被核酸外切酶降解的特性使其半衰期顯著長于線性RNA 分子，在血漿中豐富、穩(wěn)定的存在，且目前已經(jīng)在心血管疾病患者血漿中檢測到它們的差異表達，這些意味著circRNA 可能是一種有前途的疾病生物標志物。但目前對于circRNA 的研究尚仍不夠深入，對于血漿circRNA 在心血管疾病中的作用機制探討也尚在起步階段，且多數(shù)研究的樣本量較小，缺乏代表性，所以還需要更豐富的研究來充分的挖掘circRNA 的潛力，為各種心血管疾病的治療提供新的方法和思路。