治療血友病的新策略：抑制抗凝系統(tǒng)

李天逸（Li Tian-yi），江淼（Jiang Miao），夏利軍（Xia Li-jun）

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 江蘇省血液研究所，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215006

1 背景

在生理性止血中，凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡至為關(guān)鍵（圖1A）。一旦這種平衡被打破都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出血或血栓形成。血友病患者缺乏促凝血因子FⅧ或FⅨ，止血的平衡向出血傾斜（圖1B）。替代治療主要是通過補(bǔ)充體內(nèi)缺乏的凝血因子（FⅧ或FⅨ）恢復(fù)止血平衡，其主要包括兩種方式：按需治療及預(yù)防治療，按需治療指有明顯出血時(shí)給予的治療，預(yù)防治療則是以維持正常關(guān)節(jié)和肌肉功能為目標(biāo)的規(guī)律性替代治療。目前國(guó)際上血友病的治療已轉(zhuǎn)移到以預(yù)防治療為主［1］。為了解決血漿源性凝血因子制劑和重組凝血因子制劑半衰期較短的問題，融合蛋白類藥物和化學(xué)修飾類長(zhǎng)效人凝血因子藥物已成功上市，它通過減少預(yù)防性給藥次數(shù)來減輕患者負(fù)擔(dān)并提高患者的依從性［2］。但在臨床實(shí)踐中由于受到血管性血友病因子半衰期的影響，該類藥物半衰期延長(zhǎng)效果并不理想。且由于輸注凝血因子而導(dǎo)致抑制物產(chǎn)生的問題仍未得到解決。艾美賽珠單抗是一種新型的非凝血因子藥物，它是一種人源化雙特異性抗體，通過模擬FⅧ輔因子功能，與FⅨa 和FⅩ識(shí)別并結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)凝血酶的生物合成以促進(jìn)機(jī)體凝血功能的恢復(fù)［3］。它與FⅧ在結(jié)構(gòu)上沒有同源性，因此不會(huì)誘導(dǎo)抑制FⅧ的作用，也不會(huì)被現(xiàn)有的FⅧ抑制劑抑制。該藥僅需每周皮下注射1 次，顯著地改善了患者的負(fù)擔(dān)，提高了患者的生存質(zhì)量，是血友病A 治療的重要突破性進(jìn)展［4］。最近的血友病基因治療臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，一種新型的表達(dá)高活性Padua 因子Ⅸ（FⅨ）蛋白的基因工程肝臟靶向腺相關(guān)病毒載體（BBM-H901）已被開發(fā)出來，有望用于血友病B 的基因治療［5］。盡管目前的臨床試驗(yàn)取得了積極的結(jié)果，但基因治療有著倫理和價(jià)格不菲的問題，整合過程中存在基因毒性、脫靶效應(yīng)和致瘤風(fēng)險(xiǎn)，其轉(zhuǎn)染和編輯的效率也有待商榷［6］，這可能會(huì)影響這種方法的廣泛使用。上述這些血友病治療的重點(diǎn)都是基于對(duì)缺失的凝血因子的替代以恢復(fù)止血的平衡。（圖1C）近來，抑制抗凝通路來恢復(fù)止血平衡受到了關(guān)注，已有證據(jù)表明即使不補(bǔ)充缺失的凝血因子，通過抑制／減少體內(nèi)生理性的抗凝物質(zhì)也可以恢復(fù)止血平衡（圖1D）［7］。抑制活化蛋白C（APC）是治療出血性疾病的最新靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)不僅有望改變我們治療血友病的方法，還將改變?cè)S多其他出血性疾病的治療方法。

圖1 血友病治療機(jī)制

2 抑制APC 通路作為血友病治療的新策略

2.1 APC 的生物學(xué)功能

蛋白C（PC）是一種維生素K 依賴的血漿糖蛋白酶，主要在肝臟中產(chǎn)生。在凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白（T-TM）復(fù)合物作用下產(chǎn)生活化蛋白C（APC），內(nèi)皮細(xì)胞蛋白c 受體（EPCR）通過結(jié)合蛋白C 并呈遞T-TM 復(fù)合物進(jìn)一步加快APC 的形成。APC 通過以下方式發(fā)揮其生物學(xué)功能（1）APC 在PS 等輔助因子的幫助下在帶負(fù)電荷的磷脂膜上發(fā)揮其抗凝血活性滅活FⅤa 和FⅧa，從而影響FⅧa-FⅨa 復(fù)合物和FⅤa-FⅩa 復(fù)合物的生成，導(dǎo)致凝血酶的生成減少。（見圖2）（2）抑制纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）的活性和凝血酶激活的纖溶抑制物（TAFI），進(jìn)而誘導(dǎo)t-PA 的釋放，從而激活纖溶系統(tǒng)［8］。除了其關(guān)鍵的抗凝作用外，APC 可以直接抑制炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮直接抗炎作用或通過EPCR 依賴性方式發(fā)揮間接抗炎作用。當(dāng)APC 與EPCR 結(jié)合激活蛋白酶活化受體-1（PAR-1）時(shí)，它還能顯示出抗細(xì)胞凋亡的作用。這些細(xì)胞保護(hù)功能包括抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)活性以及保護(hù)內(nèi)皮屏障功能［9］。

圖2 蛋白C 途徑及抗APC 抗凝活性藥物作用機(jī)制

FⅤLeiden 突變c.1691G＞A（Arg506Gln）是導(dǎo)致血栓形成的最常見原因。激活的FⅤ需要在該Arg 位點(diǎn)被APC 切割才能被有效滅活，因此該位點(diǎn)的突變會(huì)誘使機(jī)體產(chǎn)生APC 抵抗，誘發(fā)血栓的形成［10］。在血友病A 合并FⅤLeiden 雜合突變的患者體內(nèi)，這種促血栓形成突變，可能部分補(bǔ)償血友病患者較低的FⅧ或FⅨ水平，導(dǎo)致更有效的凝血酶生成，從而減輕患者的出血癥狀。此外，有體內(nèi)研究表明FⅤLeiden 突變改善了血友病小鼠模型的出血表型［11］。這為人類抑制活化蛋白C（APC）活性重新平衡止血來治療血友病A 提供了證據(jù)。

2.2 APC 的絲氨酸蛋白酶抑制劑

APC 的內(nèi)源性抑制劑包括蛋白C 抑制劑（PCI）、α1-抗胰蛋白酶（α1AT）等，但是它們對(duì)APC的反應(yīng)性和特異性都較差［12］。為了獲得強(qiáng)效且具有特異性的APC 抑制劑，Polderdijk SG 等人設(shè)計(jì)了一種以α1AT 基因Pittsburgh 突變?yōu)槟０宓摩?ATRCL-Lys 變異體。該突變體用Lys 取代了反應(yīng)中心環(huán)（RCL）裂解位點(diǎn)周圍的氨基酸（P2 位的Pro 和P1’位的Ser）。這種名為serpinPC 的APC 抑制劑被證明能以劑量依賴的方式增加體外凝血酶的生成，在B 型血友病小鼠體內(nèi)注射后，可誘導(dǎo)的損傷后的血凝塊形成，并在夾尾試驗(yàn)中減少失血［13］。SerpinPC 具有潛在的較長(zhǎng)半衰期，可以特異性和快速地抑制APC，并可以皮下給藥。ApcinteX 公司宣布了該藥物在2a 階段的一些研究成果，在每四周皮下注射3 種劑量的SerpinPC（0.3、0.6、1.2 mg／kg）的情況下，隨訪觀察24 周后，結(jié)果顯示最高劑量下所有出血的中位數(shù)減少了88%（從36.0 減少到4.4），自發(fā)關(guān)節(jié)出血的中位數(shù)減少了94%（從21.1 減少到2.2）。未發(fā)現(xiàn)靜脈血栓栓塞癥或其他相關(guān)不良反應(yīng)［14］。

2.3 抑制APC 抗凝活性的特異性抗體

APC 的抗凝和抗細(xì)胞凋亡的活性位點(diǎn)位于其不同部位，且血漿中PC 的濃度是APC 的1700 倍，因此在血友病中針對(duì)APC 通路止血的抗體不僅需要特異性的結(jié)合APC 而不影響循環(huán)PC 水平，而且必須選擇性的抑制APC 的抗凝活性并不影響細(xì)胞保護(hù)活性。HAPC1573 抗體是一種抗人APC 的單抗，其已被證實(shí)除了具有上述功能外，還可增強(qiáng)APC 與EPCR 的結(jié)合，該結(jié)合可能增強(qiáng)了APC 與EPCR 結(jié)合PAR-1 所介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)功能［15］。在一項(xiàng)研究中，Zhao XY 等人［16］發(fā)現(xiàn)HAPC1573 結(jié)合到一個(gè)包含已知的APC-FⅤA 接口的APC 的自溶環(huán)上。HAPC1573 可能通過干擾APC 和FⅤA 之間的相互作用來抑制APC 的抗凝功能。此外，他們?cè)诩毙垣@得性血友病A 的猴子模型中證明了人源化的HAPC1573 止血的有效性和安全性。然而該模型與人類慢性血友病模型有很大的不同，為了證實(shí)HAPC1573 在人類慢性血友病模型中的有效性，Jiang Miao 等人［17］利用基因工程技術(shù)，將小鼠的PROC 基因替換為人類PROC 基因，由此獲得了表達(dá)人蛋白C 的血友病小鼠。他們?cè)谠撔∈蟮募粑渤鲅Ｐ秃歪槾陶T導(dǎo)的膝關(guān)節(jié)出血模型中發(fā)現(xiàn)，HAPC1573 能夠使小鼠尾部的出血時(shí)間正?；?，有效地緩解了膝關(guān)節(jié)腫脹癥狀，且與未經(jīng)處理的小鼠相比，出血顯著減少。此外，他們還發(fā)現(xiàn)在蛋白C激活的情況下HAPC1573 能以劑量依賴的方式改善缺乏Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ和VWF 的人血漿的凝血時(shí)間，HAPC1573 在其最大抑制作用下并不能縮短沒有蛋白C 激活的情況下的由各種凝血因子缺乏所導(dǎo)致的APTT，這些研究結(jié)果表明該療法不僅可以治療FⅧ或FⅨ缺乏的患者，還可以運(yùn)用于其他類型凝血因子缺乏的患者的治療當(dāng)中，且HAPC1573 抑制APC 的抗凝活性幾乎沒有血栓副作用的風(fēng)險(xiǎn)。

早期的研究表明，抗體MPC1609 可能與PC／APC 的GLA 結(jié)構(gòu)域（與EPCR 和磷脂結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域）結(jié)合，抑制APC 的抗凝和細(xì)胞保護(hù)活性，抗體MAPC1591 可能是通過干擾APC 與其底物FⅤa的結(jié)合而不干擾其與內(nèi)皮的結(jié)合，僅表現(xiàn)出抑制APC 的抗凝活性［18］。Jhansi Magisetty 等人［19］利用上述兩種單抗及對(duì)照IgG 注射入FⅧ-／-小鼠體內(nèi)，通過監(jiān)測(cè)關(guān)節(jié)出血及關(guān)節(jié)直徑的變化，以及對(duì)關(guān)節(jié)組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)分析來評(píng)估血友病性關(guān)節(jié)病。與MPC1609 相比，MAPC1591 可以防止關(guān)節(jié)復(fù)發(fā)出血。減少關(guān)節(jié)內(nèi)再出血將阻止關(guān)節(jié)中鐵的積聚、炎癥、肥大和新血管生成的惡性循環(huán)，從而阻止血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)展。

這種利用抑制APC 的抗凝功能的特異性單抗治療血友病的非凝血因子療法，與傳統(tǒng)的替代療法相比，其具有很長(zhǎng)的半衰期，且具有皮下輸注的潛力，可提高患者的生存質(zhì)量。由于其特異性的抑制APC 的抗凝活性，不影響細(xì)胞保護(hù)功能，因此具有一定的安全性。此外，用于治療血友病的因子或非因子替代療法如果使用不當(dāng)，可能會(huì)有血栓副作用的風(fēng)險(xiǎn)。而該抗體已被證明幾乎沒有血栓副作用的風(fēng)險(xiǎn)，也不會(huì)導(dǎo)致抑制物的產(chǎn)生，還可以有效的預(yù)防血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)展。因此該類藥物具有廣泛的治療前景，可被用于血友病的治療。

2.4 EPCR mAb 抑制依賴EPCR 的APC 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和APC 的產(chǎn)生

早期的研究表明FⅦa-EPCR 的相互作用可能有助于FⅦa 在血友病治療中的止血作用［20］。同時(shí)藥理濃度的人rFⅦa 被證明在人內(nèi)皮細(xì)胞模型系統(tǒng)中下調(diào)EPCR 介導(dǎo)的蛋白C 的激活。Keshava S 等人［21］通過給野生型、EPCR 缺陷和EPCR 過表達(dá)的小鼠注射FⅧ單抗（1 mg／kg）構(gòu)建了3 種不同的獲得性血友病小鼠模型。與野生型所構(gòu)建的獲得性血友病小鼠相比EPCR 缺陷的獲得性血友病小鼠的平均止血時(shí)間顯著減少，在此基礎(chǔ)上給予0.25 mg／kg 的rFⅦa 可使EPCR 缺陷的小鼠模型的平均止血時(shí)間恢復(fù)至野生型小鼠水平，而野生型獲得性血友病小鼠則需1 mg／kg 的rFⅦa 才能完全糾正出血表型。此外，在過表達(dá)EPCR 的小鼠，即使給予4 mg／kg的rFⅦa 也不能完全糾正該組的出血表型。此項(xiàng)研究證明，rFⅦa 在血友病治療中的止血作用不僅來自于FⅦa 對(duì)FⅩ的激活，還通過與蛋白C 競(jìng)爭(zhēng)EPCR，從而抑制EPCR 介導(dǎo)的APC 的產(chǎn)生和依賴EPCR 的APC 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。rFⅦa 在過表達(dá)EPCR小鼠中止血效果降低的原因可能是初始凝血酶生成后產(chǎn)生的APC 水平的增加所導(dǎo)致［21］。FⅦ-EPCRPAR1 誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可保護(hù)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的屏障通透性以及細(xì)胞因子和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥且炎癥和血管通透性在血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［22］。因此，阻斷EPCR 除了可以下調(diào)APC 的生成影響血友病的出血外，還可能影響血友病患者的關(guān)節(jié)損害。該觀點(diǎn)在EPCR 缺陷的血友病小鼠模型中得到證實(shí)，EPCR缺陷顯著降低了血友病滑膜炎的嚴(yán)重程度。且單劑量注射阻斷EPCR 的單抗也可達(dá)到類似的效果［23］。除了EPCR 的胚胎外表達(dá)可能是胚胎存活所必需的，沒有其他證據(jù)表明EPCR 對(duì)健康是必要的，在一項(xiàng)脂多糖誘導(dǎo)的體內(nèi)炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，EPCR 缺陷小鼠和WT 小鼠的炎癥程度沒有顯著差異。且在過去對(duì)EPCR 缺陷的小鼠進(jìn)行的觀察中，沒有發(fā)現(xiàn)健康相關(guān)的問題［24］。因此，注射EPCRmAb 來預(yù)防血友病性關(guān)節(jié)病不太可能對(duì)血友病患者的健康產(chǎn)生任何負(fù)面影響，綜合考慮EPCR 抗體在減少關(guān)節(jié)出血和血友病滑膜炎方面的效果，EPCRmAb 抑制依賴EPCR 的APC 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和APC 的產(chǎn)生是治療血友病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

3 抑制其他抗凝通路的最新研究結(jié)果

3.1 TFPI 抑制物（組織因子途徑抑制物抑制劑）

作為機(jī)體重要的生理性抗凝蛋白，TFPI 是組織因子（TF）、FⅦ和FⅩ的抑制物。抑制TFPI 已被證明可以減少多種血友病動(dòng)物模型的出血［25］，在多種抑制TFPI 的策略中，Concizumab 正處于臨床研究的第三階段，它是一種高親和力、人源化的抗組織因子途徑抑制物的單抗。Concizumab 阻止了TFPI 對(duì)FⅩa的抑制和對(duì)TF／FⅦa 的抑制，從而在血友病患者缺乏激活的FⅧa ／ FⅨa 復(fù)合體的情況下產(chǎn)生足夠數(shù)量的FⅩa 以確保有效止血［26］。然而Concizumab 的治療監(jiān)測(cè)難以捉摸，可能是通過凝血酶原時(shí)間或組織因子依賴分析來調(diào)查殘留的TFPI 活性，因此需要對(duì)治療監(jiān)測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在該藥物的第二階段臨床研究中，explorer4 和explorer5 試驗(yàn)評(píng)估了每日一次皮下注射Concizumab 的療效和安全性，結(jié)果表明在至少76 周治療后，以末次劑量水平估計(jì)的年出血率（annualized bleeding rate，ABR）為1.8 和2.1。且Concizumab 預(yù)防通常具有良好的安全性和免疫原性，盡管25%的患者產(chǎn)生抑制性抗體，但大多數(shù)是低滴度和短暫的，未觀察到臨床效應(yīng)。［27］。

3.2 siRNA 靶向沉默抗凝血酶

AT 是一種天然抗凝血?jiǎng)?，是凝血酶和Ⅹa 因子的主要內(nèi)源性抑制物。在一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)嚴(yán)重血友病A（FⅧ＜1%）合并AT 缺乏癥的個(gè)體，其表現(xiàn)為輕度出血表型?；谶@種現(xiàn)象，抗凝血酶抑制劑可作為一種新的治療方式應(yīng)用于血友病的治療［28］。在血友病小鼠中，靶向AT 的SiRNA 可延長(zhǎng)血友病小鼠的生命。Fitusiran 是一種皮下注射siRNA，專門針對(duì)抗凝血酶（AT）的信使RNA 以降低肝臟中AT 的產(chǎn)生，從而增加凝血酶的生成，減少出血頻次。這種藥物僅需每月皮下注射1 次，對(duì)血友病A 和B的患者（包含伴抑制物者）有著相似止血改善［29］。在該藥物的早期臨床試驗(yàn)中，因一名HA 患者在將Fitusiran 與FⅧ聯(lián)合使用后發(fā)生了致命的腦靜脈竇血栓形成而被叫停，重新修改試驗(yàn)方案后才得以繼續(xù)進(jìn)行?？紤]到該藥物同時(shí)也存在突破性出血和血栓并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)，仍需要進(jìn)一步的劑量方案的優(yōu)化［30］。在近期發(fā)布的兩項(xiàng)3 期臨床研究中表明，與按需CFC（凝血因子濃縮物）治療相比，每月一次皮下注射Fitusiran 的血友病患者的ABR（年出血率）顯著降低，且患者的健康相關(guān)生活質(zhì)量得到顯著改善［31］。

3.3 siRNA 靶向沉默蛋白S

蛋白S（PS）是一種抗凝血?jiǎng)?，它不僅在FⅤa 和FⅧa 失活的過程中作為APC 的輔助因子，還在抑制FⅩa 的過程中作為TFPI 的輔助因子。這種雙重作用使PS 成為凝血酶生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Raja Prince 等人［32］利用PROS1 缺陷的血友病小鼠和PS被抑制（注射中和抗體或PS siRNA）的血友病小鼠以評(píng)估抑制PS 對(duì)血友病出血的改善情況，結(jié)果顯示抑制PS 可部分限制鼠尾出血，但不能完全消除。此外，PS 缺陷或抑制PS 還提供了對(duì)血友病性關(guān)節(jié)病的完全保護(hù)。在凝血酶生成試驗(yàn)中，PS 抑制可使血友病A 患者血漿凝血酶的生成能力得到恢復(fù)。由于PS 在人血漿中以游離蛋白和與C4b 結(jié)合蛋白（C4BP）結(jié)合形成復(fù)合體的兩種形式存在，PS 的沉默將會(huì)有影響C4BP 和人類的補(bǔ)體系統(tǒng)的可能性。此外，作為酪氨酸激酶受體（TAM 受體）家族的配體和激活劑，PS 具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并刺激凋亡細(xì)胞吞噬的作用［33］。因此沉默PS 有影響該功能的風(fēng)險(xiǎn)，其可行性仍需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

長(zhǎng)久以來血友病的治療是以替代治療為主，但其存在患者依從性差，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降以及抑制物產(chǎn)生等問題。近些年來，基因治療與新型藥物的開發(fā)成為了治療血友病的熱點(diǎn)，盡管基因治療已經(jīng)產(chǎn)生了令人振奮的結(jié)果但由于其免疫原性和生物安全性問題，仍需進(jìn)一步的研究。因此，新型藥物仍需不斷地開發(fā)。近來，抑制抗凝通路來恢復(fù)止血平衡受到了關(guān)注，其中抑制APC 是治療出血性疾病的最新靶點(diǎn)，該類藥物具有廣泛的治療前景，未來或許是治療血友病和其他凝血因子缺乏疾病的一種新型的、有前途的治療策略。

作者貢獻(xiàn)聲明李天逸負(fù)責(zé)撰寫文章；江淼、夏利軍負(fù)責(zé)修改文章和指導(dǎo)研究

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突