復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者抗磷脂抗體分布分析

董雪梅，張翀，馬寧霞，趙盼，李亞嬌，米樂(lè)園，尹姣姣

（甘肅省婦幼保健院臨床檢驗(yàn)中心，蘭州 730050）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）通常指連續(xù)兩次及以上的妊娠丟失，是臨床經(jīng)常遇到極為復(fù)雜而棘手的問(wèn)題［1］。研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾病在復(fù)發(fā)性妊娠丟失中起重要作用，免疫特性可能是導(dǎo)致不明原因反復(fù)流產(chǎn)的主要原因［2］?？沽字C合征（APS）是指一種由抗磷脂抗體為繼發(fā)條件的綜合征，是一種非炎癥性的自身免疫性疾病，以體內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)循環(huán)的抗磷脂抗體（APL），包括狼瘡抗凝物抗體（LA）、抗心磷脂抗體（ACA）及抗β2 糖蛋白1（β2-GP1）抗體為特征，臨床上以反復(fù)的動(dòng)、靜脈血栓形成為表現(xiàn)［3-4］。在妊娠期蛻膜血管內(nèi)的血栓形成，可導(dǎo)致胚胎、胎兒發(fā)育不良及胎盤(pán)相關(guān)性疾病的發(fā)生，目前被認(rèn)為是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素［3］。本研究旨在回顧性分析抗磷脂抗體在不明原因反復(fù)流產(chǎn)中的表達(dá)，評(píng)估反復(fù)流產(chǎn)病例中抗磷脂綜合征（APS）的陽(yáng)性率，以及對(duì)陽(yáng)性患者各抗體進(jìn)行占比分析。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選取2020年在甘肅省婦幼保健院診斷為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的1914 例患者作為研究對(duì)象，年齡20 ～41歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：a.無(wú)生殖道感染及畸形，不存在染色體異常；b.不明原因流產(chǎn)≥2 次，沒(méi)有正常產(chǎn)嬰史；c.基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，包括性激素六項(xiàng)、甲狀腺功能系列等；d.配偶精子質(zhì)量正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：a.糖尿病史；b.動(dòng)靜脈血栓史；c.肝功能異常；d.自身免疫疾病史，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等；e.子宮內(nèi)膜異位癥等影響正常妊娠的相關(guān)疾病。根據(jù)2006年修訂的悉尼國(guó)際APS 診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，診斷APS 必須具備下列至少1 項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)和1 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。臨床標(biāo)準(zhǔn)：a.血管栓塞：任何器官或組織發(fā)生≥1 次動(dòng)脈、靜脈或小血管栓塞；b.病理妊娠：發(fā)生≥1 次10 周以上不明原因的形態(tài)學(xué)正常的死胎，或在妊娠34 周之前因嚴(yán)重的子癇或先兆子癇或嚴(yán)重的胎盤(pán)功能不全所致≥1 次的形態(tài)學(xué)正常的新生兒早產(chǎn)，或發(fā)生≥3 次妊娠10 周之前不明原因的自然流產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)：間隔12 周至少2 次檢測(cè)到APA 中的任何一項(xiàng)抗體陽(yáng)性。本研究技術(shù)經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)［2017］院倫審研第（16）號(hào)。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 ACA 檢測(cè) 儀器為CRED-HB600c 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，試劑盒購(gòu)自北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.2.2 抗β2-GP1 抗體檢測(cè) 儀器為Rayto RT-6500酶標(biāo)分析儀，試劑盒由德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司提供。

1.2.3 LA 檢測(cè) 儀器為日本Sysmex CS-5100 全自動(dòng)血凝分析儀，試劑盒由德國(guó)西門(mén)子公司生產(chǎn)購(gòu)于希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司。

1.3 檢測(cè)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)

所有對(duì)象清晨空腹抽取靜脈血兩管：枸櫞酸鈉抗凝1 ∶9 采血2 mL，用于LA 檢測(cè)；無(wú)抗凝劑采血2 mL，用于ACA 及抗β2-GP1 抗體檢測(cè)，以3 500 r／min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心15 min，獲取實(shí)驗(yàn)所需的血漿和血清。

1.3.1 ACA 檢測(cè)原理為化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)IgG，IgM兩種亞型，IgG 以陰性對(duì)照品的平均RLU 的2.1 倍為Cut off 值；用每個(gè)樣本的RLU 與Cut off 值的比值（S／CO）來(lái)判斷，S／CO≤1.0 為陰性，S／CO＞1.0為陽(yáng)性；IgM 以血清RLU 與陰性對(duì)照平均RLU 的比值2.1 為Cut off 值，比值≥2.1 為 陽(yáng)性，比值＜2.1為陰性。

1.3.2 抗β2-GP1 抗體檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，結(jié)果以20 RU／mL 為Cut off 值；≥20 RU／mL 為陽(yáng)性，＜20 RU／mL 值為陰性。

1.3.3 LA 檢測(cè)采用改良蝰蛇毒磷脂時(shí)間（dRVVT）法，結(jié)果取LA 比值，LA 比值＝LA 篩查實(shí)驗(yàn)值／LA確證實(shí)驗(yàn)值，LA 比值＞1.2 為陽(yáng)性，≤1.2 為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及百分率［n（%）］表示，各參數(shù)陽(yáng)性率屬于計(jì)數(shù)資料，比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用Pearson 檢驗(yàn)分析不同年齡段與各抗體的相關(guān)性，P＜0.05 表示具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 RSA 患者臨床基線特征

本研究納入的1914 例患者中，平均年齡29.9±4.3 歲，孕周＜12 周者1087 例，占56.8%；孕周≥12周者827 例占43.2%，流產(chǎn)次數(shù)2 次者共972 例占50.8%，流產(chǎn)次數(shù)3 次者605 例占31.6%；流產(chǎn)次數(shù)≥4 次者337 例占17.6%。相關(guān)基線數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 RSA 患者臨床基線資料［n（%）］

2.2 研究組中抗磷脂抗體的陽(yáng)性率

1914 例反復(fù)流產(chǎn)患者中，LA 陽(yáng)性患者467 例占24.4%。ACA-IgG 陽(yáng)性患者25 例占1.3%，ACAIgM 陽(yáng)性患者50 例占2.6%，抗β2-GP1 抗體陽(yáng)性患者185 例占9.7%，以上任何一項(xiàng)抗體陽(yáng)性患者間隔12 周至少2 次檢測(cè)到抗體陽(yáng)性，并具備至少1 項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)，診斷為患有抗磷脂綜合癥（APS），診斷出APS 的病例共623 例，陽(yáng)性率32.55%，見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中相關(guān)抗體陽(yáng)性率［例（%）］

其中LA 合并ACA-IgG 陽(yáng)性7 例占0.37%；LA 合并ACA-IgM 陽(yáng)性16 例占0.84%；LA 合并抗β2-GP1 抗體陽(yáng)性64 例占3.34%；ACA 合并抗β2-GP1 抗體陽(yáng)性15 例占0.78%；LA 合并ACA 合并抗β2-GP1 抗體陽(yáng)性1 例占0.052%，見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中相關(guān)抗體聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率［例（%）］

2.3 不同年齡段相關(guān)抗體陽(yáng)性率及年齡與ACA、LA 及抗β2-GP1 抗體相關(guān)性

將病例組患者按年齡劃分為＜30 歲、30-35 歲和＞35 歲3 個(gè)年齡段，LA 陽(yáng)性率分別為27.4%、22.2%、19.2%；ACA-IgG 陽(yáng)性率分別為1.6%、1.0%、1.2%；ACA-IgM 陽(yáng)性率分別為3.0%、2.4%、1.5%；抗β2-GP1 抗體陽(yáng)性率分別為10.7%、9.2%、6.9%，見(jiàn)圖3；通過(guò)Pearson 檢驗(yàn)分析年齡與ACA、LA 及抗β2-GP1 抗體相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LA 及ACA-IgM 與年齡具有一定的相關(guān)性（P＜0.05），并成負(fù)相關(guān)；而ACAIgG 及抗β2-GP1 抗體與年齡無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 年齡與各抗體陽(yáng)性率的Pearson 相關(guān)分析

圖3 病例組患者不同年齡段相關(guān)抗體陽(yáng)性率［例（%）］

3 討論

磷脂抗體（APL）被認(rèn)為是最常見(jiàn)的獲得性血栓形成的危險(xiǎn)因素，因?yàn)樗鼈兛蓪?dǎo)致胎盤(pán)血管中的凝塊產(chǎn)生胎兒生長(zhǎng)遲緩，許多流行病學(xué)研究將APS 作為RSA 的原因［6］。

關(guān)于APS 的發(fā)病機(jī)制，已知的研究證明與APL的致病作用有關(guān)，在妊娠期，胎盤(pán)是APS 的靶器官，各種類型的抗磷脂抗體被認(rèn)為與滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)融合植入胚胎的免疫反應(yīng)有關(guān)，APL 可通過(guò)精確抑制滋養(yǎng)層的激素分泌和侵襲，導(dǎo)致胎盤(pán)和胚胎著床共濟(jì)失調(diào)，從而發(fā)生妊娠丟失［7-9］。一旦胎盤(pán)固定，APL存在于胎盤(pán)中時(shí)，會(huì)影響花生四烯酸代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，比如前列環(huán)素在機(jī)體中通過(guò)幫助血管擴(kuò)張和阻止血小板聚集發(fā)揮重要的抗凝作用，而APL 會(huì)破壞前列環(huán)素的產(chǎn)生，另一方面，APL 與胎盤(pán)抗凝蛋白結(jié)合后，抑制了天然抗凝劑的作用［10-11］。隨著子宮內(nèi)膜增生、同時(shí)合并孕期體內(nèi)本身的高凝狀態(tài)變化、纖維蛋白樣壞死和螺旋動(dòng)脈腔內(nèi)血栓形成，最終導(dǎo)致胎盤(pán)灌注減少和隨后的缺血性梗死而發(fā)生流產(chǎn)。

本研究通過(guò)回顧性分析1914 例RAS 患者，發(fā)現(xiàn)診斷為APS 的病例共623 例，陽(yáng)性率32.55%，該結(jié)果與國(guó)外報(bào)道的8%～42%的復(fù)發(fā)妊娠流產(chǎn)是由于陽(yáng)性APL 一致［2，12-14］。此外，我們的結(jié)果還表明24.4%RAS 患者LA 陽(yáng)性。這一結(jié)果與Noura 和Velayuthaprabhu 等［2，15］研究結(jié)果一致。但是，CLark等［16］在2257 例早期RAS 患者中發(fā)現(xiàn)只有5 例LA陽(yáng)性（0.2%）；Naga 調(diào)查了日本不明原因流產(chǎn)婦女263 例，發(fā)現(xiàn)17.9%RAS 患者的LA 陽(yáng)性［17］；國(guó)內(nèi)研究報(bào)道為8.5%～13.7%［18］。關(guān)于RAS 患者LA 陽(yáng)性的結(jié)果存在一定差異，該差異可能由于這些研究中LA 檢測(cè)方法學(xué)的多樣性（如改良蝰蛇毒磷脂法（dRVVT）、硅凝固時(shí)間法（SCT）、部分活化部分凝血活酶時(shí)間法APTT-Actin、 APTT-Actin FSL 和APTT-SS 等），不同方法臨床診斷效能有差異，5 種方法中，因?yàn)閐RVVT 法的敏感度最高而成為首選方法，SCT 法的敏感度次之［19-20］。而許多研究使用的檢測(cè)方法在更新后的指南中已不再被推薦或者未按照推薦合適地解釋檢測(cè)結(jié)果。本研究中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者三種磷脂抗體中LA 陽(yáng)性率最高，占比24.4%，其次為抗β2-GP1 抗體患者185 例占比9.7%，ACAIgM 患者50 例占比3.9%，顯示LA 陽(yáng)性是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的高風(fēng)險(xiǎn)因素。基于許多研究和綜述，LA 陽(yáng)性發(fā)生血栓事件的危險(xiǎn)度要大于ACA 陽(yáng)性，LA 被視為血栓形成的最強(qiáng)的危險(xiǎn)因素［21-22］。國(guó)內(nèi)張蜀瀾等［23］研究發(fā)現(xiàn)LA 陽(yáng)性患者深靜脈血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于ACA 陽(yáng)性患者，Michanel 等［24］研究發(fā)現(xiàn)在抗磷脂抗體陽(yáng)性的患者中，LA 相比ACA 和抗β2-GP1 抗體，能更好地預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局。

按照APS 診斷標(biāo)準(zhǔn)，凡是任意一項(xiàng)抗體陽(yáng)性者均應(yīng)間隔12 周后復(fù)查APA，本研究對(duì)入組患者進(jìn)行篩選時(shí)，雖排除了包括凝血缺陷病在內(nèi)的多種影響因素，但仍有部分患者因?yàn)樾枰?2 周內(nèi)進(jìn)行臨床干預(yù)，因此，在第二次復(fù)檢時(shí)已進(jìn)行抗凝治療，這可能會(huì)對(duì)LA 篩選實(shí)驗(yàn)、確認(rèn)實(shí)驗(yàn)均產(chǎn)生不同程度的影響，可能會(huì)導(dǎo)致LA 陽(yáng)性率的增高。這也是本研究存在的局限性，因此，在今后的研究中，要依據(jù)相關(guān)指南，在患者服藥后一定時(shí)間點(diǎn)（藥物谷值濃度）進(jìn)行采血復(fù)檢，同時(shí)以凝血試驗(yàn)驗(yàn)證藥物殘留效果［25］。此外，要充分了解患者的用藥情況，必要時(shí)選擇適合的采血時(shí)間進(jìn)行復(fù)檢。

本研究三項(xiàng)抗體同時(shí)陽(yáng)性患者占0.052%，兩項(xiàng)抗體同時(shí)陽(yáng)性占5.33%，雖然陽(yáng)性率均較低，但多項(xiàng)研究［26-27］認(rèn)定兩項(xiàng)（即LA 和ACA、LA 和抗β2-GP1抗體、或ACA 和抗β2-GP1 抗體）或者三項(xiàng)（LA、ACA 和抗β2-GP1 抗體）抗磷脂抗體陽(yáng)性使得APS患者的血栓風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，三項(xiàng)抗磷脂抗體陽(yáng)性患者發(fā)生不良妊娠的幾率是非三項(xiàng)抗體陽(yáng)性的4.1倍［28］。本研究未進(jìn)一步評(píng)估兩項(xiàng)或三項(xiàng)陽(yáng)性患者血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，但證實(shí)雙陽(yáng)及三陽(yáng)患者在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中占有一定的比例，因此，在易發(fā)生妊娠不良反應(yīng)的患者中應(yīng)對(duì)抗磷脂抗體進(jìn)行全面的檢測(cè)，對(duì)于雙陽(yáng)及三陽(yáng)患者我們更應(yīng)該提醒臨床及時(shí)關(guān)注，做到早干預(yù)早治療，從而減少妊娠不良事件的發(fā)生。

本研究分析不同年齡段ACA、LA 及抗β2-GP1抗體陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)20 ～35 歲年齡階段LA 陽(yáng)性率較35 歲以上年齡階段LA 陽(yáng)性率明顯增高，通過(guò)Pearson 檢驗(yàn)分析年齡與ACA、LA 及抗β2-GP1 抗體相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LA 及ACA-IgM 與年齡具有一定的相關(guān)性，并成負(fù)相關(guān)；ACA-IgG 及抗β2-GP1 抗體與年齡無(wú)相關(guān)性。因此對(duì)于育齡女性，應(yīng)加強(qiáng)APL 方面的篩查，重視APL 在20～35 歲RSA 中的重要作用［29］。

當(dāng)前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，LA 和ACA 這兩種最典型的抗磷脂抗體與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)［30-31］，國(guó)內(nèi)鄭建瓊等［32］研究發(fā)現(xiàn)ACA 和抗β2-GP1 抗體聯(lián)合檢測(cè)可提高RSA 患者抗磷脂綜合癥檢出率。

綜上所述，LA、抗β2-GP1 抗體、ACA 抗體檢測(cè)是診治復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要技術(shù)手段，臨床工作中應(yīng)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)應(yīng)患者做到積極全面的抗磷脂抗體檢測(cè)，提高復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診治率，從而減少妊娠不良事件的發(fā)生，提高患者妊娠成功率。

作者貢獻(xiàn)聲明董雪梅：論文撰寫(xiě)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；張翀：技術(shù)支持；馬寧霞：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；趙盼：實(shí)驗(yàn)操作、采集數(shù)據(jù)；李亞嬌：實(shí)驗(yàn)操作、采集數(shù)據(jù)；米樂(lè)園：實(shí)驗(yàn)操作；尹姣姣：數(shù)據(jù)分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突