橙皮苷調(diào)控Jagged1/Notch1通路對巨噬細胞極化及細支氣管炎小鼠肺損傷的影響

趙興艷，湯正珍，岳 春，譚宗蘋，黃 波

遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 遵義市第一人民醫(yī)院兒科，貴州遵義 563000

細支氣管炎是一種常見且較嚴重的小兒急性下呼吸道感染性疾病，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是其主要病原體，該疾病的特點是氣道炎癥、黏液分泌增多，有時還會出現(xiàn)氣道上皮細胞壞死[1]。據(jù)估計，有RSV細支氣管炎病史的個體患哮喘的風險要高2～12倍[2]。肺泡巨噬細胞在RSV感染引起的肺損傷疾病進展中起到關鍵作用[3]。有研究顯示，細支氣管炎患兒血清巨噬細胞炎性蛋白1α、單核細胞趨化蛋白1和白細胞介素(interleukin，IL)4水平升高，且與疾病的嚴重程度密切相關[4-5]。RSV感染呼吸道上皮細胞可引起細胞因子和趨化因子如單核細胞趨化蛋白1、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-1β水平的上調(diào)以及炎癥細胞聚集到肺部，而巨噬細胞向M2亞型極化會減輕Th2炎癥反應[6]，其機制可能與激活Jagged1/Notch1通路促進氣道微環(huán)境中Th2淋巴細胞的分化有關[7]。Notch信號通路是介導巨噬細胞極化的關鍵通路，激活Notch信號通路促進巨噬細胞向M1型極化，并阻礙其向M2型極化[8]。Zeng等[9]研究顯示抑制Notch信號通路可明顯改善氣道炎癥。橙皮苷是一種具有廣泛生物學活性的天然酚類化合物[10-12]。研究表明，橙皮苷作為潛在的Th2細胞因子拮抗劑，具有抗哮喘作用，可降低炎癥細胞和Th2細胞因子的數(shù)量，抑制卵清蛋白誘導的氣道炎癥[13-14]。然而，橙皮苷對RSV引起的細支氣管炎是否具有保護作用尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建RSV細支氣管炎小鼠模型，探究橙皮苷對細支氣管炎小鼠肺損傷的影響及可能的作用機制。

材料和方法

主要試劑與儀器橙皮苷(純度>95%，貨號：C-006)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；RSV購自山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心；人宮頸癌HeLa細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；重組小鼠Jagged1蛋白(貨號：ab109346)購自英國Abcam公司；BCA試劑盒(貨號：P0012S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-6(貨號：ml002293)、TNF-α(貨號：ml002095)、IL-10(貨號：ml002285)、IL-4(貨號：ml063156)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗CD11b-FITC抗體(貨號：561688)、F4/80-PerCP-Cy5.5抗體(貨號：567202)、CD86-PE抗體(貨號：561963)均購自美國BD Bioscience公司；CD206-APC抗體(貨號：PA5-46879)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(貨號：PA3-030A)、精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)抗體(貨號：PA5-85267)、Jagged1抗體(貨號：PA5-86057)、Notch1抗體(貨號：MA5-32080)、GAPDH抗體(貨號：PA1-16777)、山羊抗兔IgG(H+L)抗體(貨號：A32734)均購自美國Thermo Scientific公司。FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司；BX61電動顯微鏡購自日本Olympus公司。

RSV混懸液的制備將RSV凍存液于37 ℃快速融化，按照0.05病毒感染復數(shù)計算病毒接種量，接種于Hela細胞上，收集感染病毒的細胞，在-80 ℃冰箱中反復凍融3次，然后在4 ℃下以1000 r/min(r=13.5 cm)的速率離心10 min，取上清液，空斑法測定病毒滴度，并調(diào)整病毒滴度為1×106PFU/ml，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗動物與分組6～8周齡SPF級BALB/c雄性小鼠60只(體重18～22 g)購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司，合格證號為SCXK(魯)2019 0003。在標準條件下進行喂養(yǎng)，保持12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，溫度(25±2) ℃，濕度50%～70%，自由進食和飲水。參照文獻[15]方法制備細支氣管炎小鼠模型：于小鼠兩側(cè)鼻內(nèi)滴入100 μl RSV混懸液，對照組于相同部位滴入100 μl Hela細胞培養(yǎng)液，1 次/d，連滴2 d，第3天觀察到滴入RSV混懸液的小鼠出現(xiàn)咳喘、呼吸急促、活動減少，且口唇和四肢發(fā)紺的現(xiàn)象，說明模型制備成功。采用隨機數(shù)字表法將60只BALB/c小鼠分為對照組、模型組、低劑量橙皮苷組(18 mg/kg)、高劑量橙皮苷組(36 mg/kg)[16]、高劑量橙皮苷(36 mg/kg)+Jagged1(1 mg/kg)組[17]，每組12只。低、高劑量橙皮苷組小鼠分別灌胃18、36 mg/kg橙皮苷，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠在灌胃36 mg/kg橙皮苷的同時腹腔注射1 mg/kg Jagged1，對照組與模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

肺泡巨噬細胞分離小鼠使用10%水合氯醛麻醉，暴露氣管并在中間切開，通過氣管插管用0.8 ml無菌PBS灌洗肺3次，并收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，每只小鼠約1.5 ml。以1500 r/min(r=13.5 cm)轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于-20 ℃保存，同時將沉淀的細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

ELISA檢測BALF中炎癥相關因子水平取-20 ℃保存的各組小鼠BALF上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α的表達水平。

流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞M1/M2型極化取原代小鼠肺泡巨噬細胞調(diào)整濃度為1×107個/ml細胞懸液，4%多聚甲醛固定15 min。分別加入兔抗CD11b-FITC抗體(10 μl)、F4/80-PerCP-Cy5.5抗體(10 μl)、CD86-PE抗體(10 μl)和CD206-APC抗體(10 μl)4 ℃避光孵育10 min。采用流式細胞儀檢測M1和M2型巨噬細胞的比例。M1型巨噬細胞為F4/80、CD11b、CD86表達陽性，而CD206呈陰性表達；M2型巨噬細胞為F4/80、CD11b、CD206表達陽性，而CD86呈陰性表達。

HE染色與過碘酸希夫染色小鼠處死后取出肺組織，4%多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，評估氣道周圍炎癥細胞的浸潤情況。采用5級評分標準：0分：無炎癥；1分：少量炎癥細胞浸潤；2分：炎癥細胞形成環(huán)狀，1個細胞層深，肺泡壁輕度增厚；3分：炎癥細胞形成環(huán)狀，2～4個細胞層深，肺泡壁顯著增厚；4分：炎癥細胞形成環(huán)狀，超過4個細胞層深，肺泡壁顯著增厚。采用過碘酸希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色評估杯狀細胞分泌黏液的情況。評分標準：0分：陰性或染色面積<5%；1分：染色面積5%～25%；2分：染色面積26%～50%；3分：染色面積51%～75%；4分：染色面積>75%。

qRT-PCR檢測肺組織iNOS、Arg-1、Jagged1和Notch1 mRNA的表達qRT-PCR測定肺組織iNOS、Arg-1、Jagged1、Notch1 mRNA的表達，引物序列見表1。采用Trizol法提取肺組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參進行相對定量。反應條件：95 ℃預變性10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 34 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算相對定量值。ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，其中ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

Western blot檢測肺組織iNOS、Arg-1和Jagged1/Notch1通路相關蛋白的表達使用含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液制備肺組織裂解物，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。在10% SDS-PAGE上分離等量蛋白質(zhì)(30 μg/孔)，轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗iNOS(1∶1000)、Arg-1(1∶1000)、Jagged1(1∶500)、Notch1(1∶500)、GAPDH(1∶2000)4 ℃孵育過夜，洗滌后再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶4000)，室溫孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光法顯色，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的條帶的相對表達水平。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

BALF中IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10的表達水平與對照組相比，模型組小鼠BALF中IL-4[(3.65±0.29)pg/ml比(0.87±0.13)pg/ml；q=38.234，P<0.001]、IL-6[(54.07±3.72)pg/ml比(11.36±2.04)pg/ml；q=48.280，P<0.001]、TNF-α[(46.95±4.21)pg/ml比(10.42±1.55)pg/ml；q=40.261，P<0.001]水平顯著升高，IL-10水平顯著降低[(1.37±0.21)pg/ml比(2.56±0.30)pg/ml；q=17.049，P<0.001]；與模型組相比，低、高劑量橙皮苷組小鼠BALF中IL-4[(2.77±0.31)pg/ml比(3.65±0.29)pg/ml；q=12.103，P<0.001和(1.86±0.24)pg/ml比(3.65±0.29)pg/ml；q=24.619，P<0.001]、IL-6[(38.53±3.29)pg/ml比(54.07±3.72)pg/ml；q=17.567，P<0.001和(23.61±2.55)pg/ml比(54.07±3.72)pg/ml；q=34.432，P<0.001]、TNF-α[(34.08±3.36)pg/ml比(46.95±4.21)pg/ml；q=14.185，P<0.001和(21.63±2.52)pg/ml比(46.95±4.21)pg/ml；q=27.906，P<0.001]水平顯著降低，IL-10水平顯著升高[(2.04±0.23)pg/ml比(1.37±0.21)pg/ml；q=9.599，P<0.001和(2.52±0.27)pg/ml比(1.37±0.21)pg/ml；q=16.476，P<0.001]；與高劑量橙皮苷組相比，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠BALF中IL-4[(2.54±0.25)pg/ml比(1.86±0.24)pg/ml；q=9.352，P<0.001]、IL-6[(35.98±3.41)pg/ml比(23.61±2.55)pg/ml；q=13.983，P<0.001]、TNF-α[(32.21±3.41)pg/ml比(21.63±2.52)pg/ml；q=11.661，P<0.001]水平顯著升高，IL-10水平顯著降低[(1.91±0.1)pg/ml比(2.52±0.27)pg/ml；q=8.740，P<0.001]。

M1/M2型巨噬細胞比例與對照組相比，模型組小鼠M1型巨噬細胞比例顯著升高[(31.00±2.46)%比(0.52±0.07)%；q=51.061，P<0.001]，M2型巨噬細胞比例顯著降低[(5.12±0.70)%比(14.95±1.62)%；q=22.699，P<0.001]；與模型組相比，低、高劑量橙皮苷組小鼠M1型巨噬細胞比例顯著降低[(20.24±2.15)%比(31.00±2.46)%；q=18.025，P<0.001和(11.61±1.89)%比(31.00±2.46)%；q=32.483，P<0.001]，M2型巨噬細胞比例顯著升高[(12.56±1.37)%比(5.12±0.70)%；q=17.180，P<0.001和(20.80±2.15)%比(5.12±0.70)%；q=36.208，P<0.001]；與高劑量橙皮苷組相比，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠M1型巨噬細胞比例顯著升高[(18.53±2.67)%比(11.61±1.89)%；q=11.593，P<0.001]，M2型巨噬細胞比例顯著降低[(11.42±1.28)%比(20.80±2.15)%；q=21.660，P<0.001](圖1)。

圖1 流式細胞儀測定M1和M2型巨噬細胞的比例Fig 1 Proportions of M1-and M2-type macrophages determined by flow cytometry

肺組織病理變化HE和PAS染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織炎癥細胞數(shù)量明顯增多，伴有大量的支氣管周圍炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生，且黏液分泌增加，炎癥評分(3.26±0.35比0；q=45.078，P<0.001)和黏液分泌評分(2.34±0.25比0；q=44.182，P<0.001)顯著升高；與模型組相比，低、高劑量橙皮苷組小鼠肺組織支氣管周圍炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生明顯減輕，黏液分泌減少，炎癥評分(2.45±0.28比3.26±0.35；q=11.200，P<0.001和1.62±0.20比3.26±0.35；q=22.677，P<0.001)和黏液分泌評分(1.82±0.21比2.34±0.25；q=9.818，P<0.001和1.29±0.16比2.34±0.25；q=19.825，P<0.001)顯著降低；與高劑量橙皮苷組相比，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠肺組織炎癥評分(2.31±0.27比1.62±0.20；q=9.541，P<0.001)和黏液分泌評分(1.75±0.19比1.29±0.16；q=8.685，P<0.001)顯著升高(圖2)。

圖2 HE與過碘酸希夫染色檢測肺組織病理變化(×200)Fig 2 Pathological changes in lung tissue detected by HE and periodic acid-Schiff staining (×200)

肺組織iNOS、Arg-1、Jagged1和Notch1 mRNA表達水平與對照組相比，模型組小鼠肺組織iNOS(2.41±0.28比1.00±0.00；q=23.913，P<0.001)、Jagged1(2.85±0.33比1.00±0.00；q=28.028，P<0.001)和Notch1(3.32±0.40比1.00±0.00；q=27.089，P<0.001)mRNA表達水平顯著升高，而Arg-1 mRNA表達水平顯著降低(0.37±0.06比1.00±0.00；q=29.699，P<0.001)；與模型組相比，低、高劑量橙皮苷組小鼠肺組織iNOS(1.89±0.23比2.41±0.28；q=8.819，P<0.001和1.32±0.17比2.41±0.28；q=18.486，P<0.001)、Jagged1(2.21±0.24比2.85±0.33；q=9.696，P<0.001和1.46±0.18比2.85±0.33；q=21.059，P<0.001)和Notch1(2.70±0.35比3.32±0.40；q=7.239，P<0.001和1.84±0.26比3.32±0.40；q=17.281，P<0.001)mRNA表達水平顯著降低，而Arg-1 mRNA表達水平顯著升高(0.62±0.07比0.37±0.06；q=11.785，P<0.001和1.24±0.11比0.37±0.06；q=41.012，P<0.001)；與高劑量橙皮苷組相比，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠肺組織iNOS(1.81±0.22比1.32±0.17；q=8.310，P<0.001)、Jagged1(2.09±0.25比1.46±0.18；q=9.545，P<0.001)和Notch1(2.63±0.30比1.84±0.26；q=9.224，P<0.001)mRNA表達水平顯著升高，而Arg-1 mRNA表達水平顯著降低(0.59±0.08比1.24±0.11；q=30.641，P<0.001)。

肺組織iNOS、Arg-1、Jagged1和Notch1蛋白表達水平與對照組相比，模型組小鼠肺組織iNOS(0.45±0.06比0.12±0.02；q=24.828，P<0.001)、Jagged1(0.63±0.08比0.26±0.04；q=21.542，P<0.001)、和Notch1(0.81±0.11比0.40±0.07；q=24.828，P<0.001)蛋白表達水平顯著升高，而Arg-1蛋白表達水平顯著降低(0.11±0.03比0.29±0.05；q=14.305，P<0.001)；與模型組相比，低、高劑量橙皮苷組小鼠肺組織iNOS(0.33±0.05比0.45±0.06；q=9.028，P<0.001和0.20±0.04比0.45±0.06；q=18.809，P<0.001)、Jagged1(0.50±0.06比0.63±0.08；q=7.569，P<0.001和0.35±0.05比0.63±0.08；q=16.302，P<0.001和Notch1(0.70±0.08比0.81±0.11；q=4.771，P=0.012和0.52±0.06比0.81±0.11；q=12.577，P<0.001)蛋白表達水平顯著降低，而Arg-1蛋白表達水平顯著升高(0.21±0.04比0.11±0.03；q=7.947，P<0.001和0.38±0.06比0.11±0.03；q=21.457，P<0.001)；與高劑量橙皮苷組相比，高劑量橙皮苷+Jagged1組小鼠肺組織iNOS(0.32±0.05比0.20±0.04；q=9.028，P<0.001)、Jagged1(0.47±0.06比0.35±0.05；q=6.987，P<0.001)和Notch1(0.64±0.07比0.52±0.06；q=5.204，P=0.005)蛋白表達水平顯著升高，而Arg-1蛋白表達水平顯著降低(0.20±0.03比0.38±0.06；q=14.305，P<0.001)(圖3)。

iNOS：誘導型一氧化氮合酶；Arg-1：精氨酸酶1；1：對照組；2：模型組；3：低劑量橙皮苷組；4：高劑量橙皮苷組；5：高劑量橙皮苷+Jagged1組；Mr：相對分子質(zhì)量iNOS：inducible nitric oxide synthase；Arg-1：arginase 1；1：control group；2：model group；3：low-dose hesperidin group；4：high-dose hesperidin group；5：high-dose hesperidin+Jagged1 group；Mr：relative molecular mass圖3 Western blot檢測肺組織iNOS、Arg-1、Jagged1和Notch1的表達水平Fig 3 Western blot of the expression of iNOS，Arg-1，Jagged1，and Notch1 in lung tissue

討 論

據(jù)報道，RSV引起的細支氣管炎與哮喘的發(fā)病機制相似，超過55%的因細支氣管炎住院的嬰兒在出院后5年內(nèi)易發(fā)展為哮喘[18]。巨噬細胞是肺組織中最豐富的免疫細胞，約占免疫細胞的70%，其在維持肺組織免疫穩(wěn)態(tài)和宿主防御方面發(fā)揮著重要作用。巨噬細胞可分為兩類，即經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1型)和替代活化型巨噬細胞(M2型)，分別表現(xiàn)出促炎和抗炎作用。M1型巨噬細胞可上調(diào)與病原體清除有關的基因表達，促進體內(nèi)促炎癥細胞因子IL-6、IL-12和TNF-α等的表達；而由IL-4和IL-13誘導的M2型巨噬細胞上調(diào)與傷口愈合、清除凋亡細胞以及組織修復有關的基因表達，參與抗炎反應，其特征是產(chǎn)生細胞因子IL-10和Arg-1、CD206[19-20]。本研究結(jié)果顯示，在RSV感染誘導的細支氣管炎小鼠模型中，BALF中IL-4、IL-6和TNF-α水平升高，而IL-10水平降低，且肺泡巨噬細胞中M1型巨噬細胞比例升高，M2型巨噬細胞比例降低，說明細支氣管炎小鼠模型中M1/M2型巨噬細胞極化失衡；同時炎癥細胞明顯聚集到肺組織，伴有大量的支氣管周圍炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生，說明RSV感染小鼠肺組織出現(xiàn)嚴重損傷。有研究顯示調(diào)節(jié)巨噬細胞極化可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應，并改善肺組織炎癥損傷[21-22]。提示調(diào)節(jié)M1/M2型巨噬細胞極化可能是細支氣管炎重要的治療靶點。

橙皮苷主要存在于柑橘類水果中，具有顯著的抗炎作用，前期研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷可作為Th2細胞因子拮抗劑，改善哮喘氣道炎癥[14，16]；并且可抑制脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞中環(huán)氧合酶-2、iNOS蛋白的過度表達和前列腺素E2、一氧化氮的大量生成[23-24]。本研究結(jié)果顯示，橙皮苷干預后，細支氣管炎模型小鼠肺泡巨噬細胞中M1型巨噬細胞比例降低，M2型巨噬細胞比例升高，且BALF中IL-10水平升高，肺組織支氣管周圍炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生明顯減輕；同時，qRT-PCR和Western blot結(jié)果也證實，肺組織M1型巨噬細胞標志物iNOS的mRNA和蛋白水平降低，M2型巨噬細胞標志物Arg-1水平升高，提示橙皮苷可促進M2型巨噬細胞極化以及IL-10的產(chǎn)生，減輕RSV引起的肺組織感染和損傷，但其具體作用機制尚不明確。

研究表明，在RSV感染的小鼠模型中，肺組織Notch1和其配體Jagged1的表達增加，并可通過激活Jagged/Notch1信號通路促進Th2細胞分化[7]。Notch信號可調(diào)節(jié)胚胎和成體組織中祖細胞和干細胞的自我更新。在哺乳動物中，有4個Notch受體(Notch1～4)可以和5種不同的配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4)相互作用，其中Notch1所有配體均可在支氣管上皮細胞中檢測到。Notch信號在巨噬細胞M1/M2型極化中起著關鍵作用，激活Notch信號通路可誘導巨噬細胞極化為M1表型[8，25]，而阻斷Notch信號通路則誘導巨噬細胞極化為M2表型[26]。本研究結(jié)果顯示，RSV感染誘導的細支氣管炎小鼠模型肺組織中Notch1和Jagged1的表達升高，說明Notch信號通路被激活；橙皮苷干預后，Notch1和Jagged1的表達均下降；而在橙皮苷干預的基礎上，使用重組Jagged1蛋白激活Notch信號通路，可顯著減弱高劑量橙皮苷對M2型巨噬細胞極化的促進作用和對肺組織炎癥損傷的改善效果，這表明橙皮苷可能通過抑制Notch信號通路，誘導巨噬細胞極化為M2表型，進而減輕RSV引起的肺組織損傷。

綜上，本研究結(jié)果表明，橙皮苷可減輕RSV引起的細支氣管炎小鼠肺組織炎癥損傷，其作用機制可能與抑制Jagged1/Notch1信號通路、促進巨噬細胞M2型極化有關。但是橙皮苷對巨噬細胞極化的調(diào)控機制仍有待進一步研究。