水培蔬菜營養(yǎng)液微生物變化對蔬菜微生物污染風(fēng)險的影響

宋春宏,顧文佳,葛 宇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,上海 200233)

新鮮蔬菜富含維生素、纖維素、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)元素,是人們膳食中不可缺少的組成部分[1-2],人類身體所需的維生素C和維生素A大部分來自于蔬菜[3]。許多研究表明,經(jīng)常規(guī)律性地進食蔬菜可以減少癌癥、心血管疾病和肥胖癥的發(fā)病風(fēng)險[4-8]。無土栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的高新技術(shù),近年來,營養(yǎng)液栽培的蔬菜面積在我國不斷增加,利用營養(yǎng)液代替土壤直接向植物根系提供生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素的栽培方式,具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、病蟲害輕、不受土壤資源限制、易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點[9]。

營養(yǎng)液是無土栽培中植物生長的主要營養(yǎng)來源,因此營養(yǎng)液的日常管理是無土栽培管理的核心環(huán)節(jié)[10]。由于長期循環(huán)使用,營養(yǎng)液會滋生大量的微生物,使用壽命縮短,增加生產(chǎn)成本。目前,國內(nèi)外關(guān)于營養(yǎng)液廢液的處理方式包括循環(huán)重復(fù)利用和不循環(huán)排出方式。營養(yǎng)液廢液循環(huán)重復(fù)利用是指已經(jīng)使用過的營養(yǎng)液廢液經(jīng)消毒過濾和營養(yǎng)復(fù)配等一系列措施,重新回流到原栽培系統(tǒng)循環(huán)中再被植物吸收利用,該方式已被歐盟等發(fā)達國家廣泛應(yīng)用[11]。不循環(huán)利用是由于受到技術(shù)和成本等因素限制只能將利用一次后的廢液直接排入環(huán)境,這種方式造成了大量未被植物吸收利用的氮、磷、鉀、NO2-3和其他化學(xué)物質(zhì)的浪費,同時也會造成河流等水體的富營養(yǎng)化問題,對地表和地下水造成污染。未經(jīng)處理的營養(yǎng)液廢液二次利用時容易造成病蟲害在栽培體系中廣泛傳播,會造成不可估量的損失。因此,科學(xué)的營養(yǎng)液廢液循環(huán)利用成為目前無土栽培研究中的一個熱點問題[12-15]。

目前,臭氧、紫外線已廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)液的殺菌消毒,具有低毒、無殘留、環(huán)保的特點,但對其在無土栽培過程中微生物變化影響的研究較少。本試驗在水培菠菜培育至成熟的過程中,對其營養(yǎng)液供液端和回液端的菌落總數(shù)、大腸菌群等指示菌數(shù)據(jù)進行跟蹤和對比,并對這一過程中營養(yǎng)液及成熟蔬菜的菜葉和菜根所含的菌落進行初步鑒定,以期為后續(xù)水培蔬菜微生物風(fēng)險的評估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水培菠菜

菠菜品種‘綠冠三號’由上海綠立方農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與儀器

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、李斯特菌選擇性添加劑瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、改良EC肉湯培養(yǎng)基、改良山梨醇麥康凱瓊脂、大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基、尿素瓊脂(以上培養(yǎng)基和試劑均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供)、緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、四硫磺酸鈉煌綠、亞硫酸鉍瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、李氏菌增菌肉湯(以上培養(yǎng)基和試劑均由無錫賽微生物技術(shù)有限公司提供)、BP瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

SMI12生化培養(yǎng)箱(美國Shellab公司),均質(zhì)機(法國Interscience公司),AUTOF MS2000e MALDITOF MS(鄭州安圖生物工程股份有限公司),全自動細菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菠菜生長過程中營養(yǎng)液和蔬菜的微生物監(jiān)測

將菠菜小苗在基質(zhì)中培植一周后定植到栽培床上,根據(jù)外界氣候與作物特點,通過備風(fēng)機、濕簾、天窗等環(huán)境管控設(shè)施對棚內(nèi)溫濕度及光照環(huán)境進行控制,以維持相對穩(wěn)定的最佳生長環(huán)境條件。對于營養(yǎng)液,使用紫外強度100 μW∕cm2的紫外線對混入施肥機之前的水源進行消毒(每日18:00至次日5:00每小時開啟20 min);在回液端通過濾棉先把營養(yǎng)液里的雜質(zhì)過濾掉,再通過4—5 mg∕L的臭氧對回流到封閉水箱的營養(yǎng)液進行消毒(每日18:00至次日5:00每小時開啟20 min),之后營養(yǎng)液循環(huán)到供液端,以維持菠菜生長環(huán)境的相對潔凈。

分別于菠菜移栽到栽培床后的1—7周每周對供液端和回液端的營養(yǎng)液進行無菌采樣(用無菌袋直接接取100 mL營養(yǎng)液,封好無菌袋,防止污染),對營養(yǎng)液進行菌落總數(shù)和大腸菌群計數(shù),并于培育的第1周和第7周對營養(yǎng)液和水培菠菜的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌進行檢測。菌落總數(shù)檢測按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[16],大腸菌群檢測按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》[17],沙門氏菌檢測按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》[18],金黃色葡萄球菌檢測按照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[19],單核細胞增生李斯特氏菌檢測按照GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[20],大腸埃希氏菌O157:H7∕NM檢測按照GB 4789.36—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7∕NM檢驗》[21]。

1.2.2 營養(yǎng)液和成品蔬菜中菌相鑒定

將第7周供液端營養(yǎng)液、回液端營養(yǎng)液稀釋至適宜濃度,涂布至平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板上;將成品蔬菜的菜根和菜葉分別均質(zhì)后稀釋至適宜濃度,涂布至平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板上。將上述涂布平板置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,從供液端營養(yǎng)液平板、回液端營養(yǎng)液平板、菜根平板、菜葉平板上分別隨機挑取不同形態(tài)的菌落,接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上,36℃培養(yǎng)24 h。用1 μL無菌接種環(huán)蘸取少量菌落直接涂抹于飛行質(zhì)譜靶板樣本孔位上,取1 μL 70%甲酸涂敷于樣本孔位上,徹底干燥后再滴加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)基質(zhì)液,室溫干燥后,進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDITOF MS)鑒定[22]。對鑒定結(jié)果9.0(種水平置信)以下的菌落,輔助以全自動細菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)進行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 七周內(nèi)營養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化

養(yǎng)殖戶反映患病牛發(fā)病較為突然，發(fā)病初期表現(xiàn)為精神萎靡不振，鼻鏡干燥，采食量下降，隨著病情的發(fā)展，患病牛食欲廢絕，反芻減少，直至停止，從口腔中分泌出粘稠的唾液，存在明顯的酸臭味。牛會出現(xiàn)間歇性鼓氣，自主收縮能力減弱，瘤胃蠕動能力減弱，用手觸摸瘤胃，內(nèi)部充滿粘膩感、呈粥狀的內(nèi)容物，觸診瘤胃內(nèi)容物松軟，患病牛胃部存在疼痛感，用手輕輕按壓瘤胃存在指痕?；疾∨Ｅ疟懔恐饾u減少，糞便干硬呈現(xiàn)深褐色，排出的糞便呈現(xiàn)球狀，有時在糞便表面附著大量粘液。

使用線性回歸法對營養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化進行統(tǒng)計學(xué)分析,觀察其變化是否有統(tǒng)計學(xué)意義。分別將菌落總數(shù)(logCFU∕mL)∕大腸菌群(logCFU∕mL)與各個時間點擬合直線,進行線性回歸分析,通過t檢驗法進行判斷。

1.3.2 供液端和回液端中菌落總數(shù)和大腸菌群的變化

采用獨立樣本studentt檢驗比較每個時間點兩組間菌落總數(shù)∕大腸菌群數(shù)的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜生長過程中營養(yǎng)液菌落總數(shù)、大腸菌群的動態(tài)變化

由圖1可以看出,無論是供液端還是回液端,其營養(yǎng)液在菠菜成熟的7周過程中菌落總數(shù)始終保持穩(wěn)定(P=0.862,P=0.802);從圖2可以看出,大腸菌群數(shù)值第1周到第7周的下降趨勢經(jīng)t檢驗分析有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002,P=0.01)。隨著菠菜生長時間延長,營養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)循環(huán)殺菌后,菌落總數(shù)沒有顯著增長,大腸菌群的數(shù)量反而下降,說明在菠菜生長過程中營養(yǎng)液的微生物增殖情況得到了有效控制。

圖1 1—7周營養(yǎng)液的菌落總數(shù)Fig.1 Total number of colonies of nutrient solution in 1—7 weeks

圖2 1—7周營養(yǎng)液的大腸菌群數(shù)量Fig.2 Number of coliforms of nutrient solution in 1—7 weeks

營養(yǎng)液殺菌消毒前后各個時間段供液端和回液端的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量均出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),說明使用臭氧殺菌的方法對減少營養(yǎng)液中菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)量有效果,避免了微生物在蔬菜生長過程中的大量繁殖,減少了后續(xù)成品蔬菜微生物污染的風(fēng)險。

2.2 菠菜生長過程中營養(yǎng)液和蔬菜的致病菌檢測

在培育過程中的第1周和第7周,分別對營養(yǎng)液(供液端、回液端)和水培菠菜進行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7∕NM等致病菌的檢測,結(jié)果均未檢出。

2.3 菌種鑒定

從供液端營養(yǎng)液平板、回液端營養(yǎng)液平板、菜根平板、菜葉平板上分別隨機挑取有不同菌落形態(tài)的菌落79株、85株、100株、80株,經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定,輔助以全自動細菌鑒定藥敏分析系統(tǒng),結(jié)果見表1—4。

表1 營養(yǎng)液回液端菌株鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of bacterial strains at the return end of nutrient solution

從表1和表2可以看出,回液端的營養(yǎng)液經(jīng)4—5 mg∕L的臭氧殺菌后,其所含的微生物種類有明顯減少;其中占比最大的食酸菌屬病原細菌是一種主要危害葫蘆科植物的細菌[23],經(jīng)殺菌后,占比并未減少,說明此種殺菌方法對該菌屬的殺滅效果不明顯;而易引起蔬菜腐爛變質(zhì)的假單胞菌屬的細菌數(shù)量由占比31.9%大幅降低至17.7%,殺菌效果明顯;葡萄球菌等革蘭氏陽性菌經(jīng)臭氧殺菌后在供液端未檢出。以上結(jié)果說明,該濃度的臭氧對營養(yǎng)液中部分有害細菌起到了明顯的殺滅作用,可降低微生物污染風(fēng)險。

表2 營養(yǎng)液供液端菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of bacterial strains at the supply end of nutrient solution

菠菜在移栽入栽培床時會將部分基質(zhì)、土壤一并帶入,這可能成為細菌生長的溫床,并可能污染成品菜的葉片。從表3和表4可以看出,菠菜的根部分離出泡囊短波單胞菌、洛菲不動桿菌、惡臭假單胞菌等致病菌,但在菜葉中上述幾種菌并未檢出,且分離出的菌落種類從28種減少為19種,提示菠菜成熟后及時去除根部能有效減少致病性微生物交叉污染的風(fēng)險,降低病害發(fā)生的可能性。在去根之后的菜葉細菌鑒定結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬的比例占50%以上,該菌屬的細菌具有很強的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力,且增殖速度極快,極易造成蔬菜腐敗,這也是葉菜相對不易存放的一個重要因素。

表3 菜根菌株鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of bacterial strains in vegetable roots

表4 菜葉菌株鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of bacterial strains in vegetable leaves

3 結(jié)論與討論

蔬菜的微生物污染是食源性疾病的主要風(fēng)險來源,國外已發(fā)生多起食用生鮮蔬果引起的食源性疫情。如2011年美國18個州因食用被單增李斯特菌污染的哈密瓜暴發(fā)食源性疫情,導(dǎo)致146人患病,30人死亡;2016年美國因黃瓜暴發(fā)沙門氏菌疫情,導(dǎo)致至少907人感染,其中,204人住院,6人死亡;2018年美國32個州因生菜污染大腸桿菌O157:H7暴發(fā)疫情,導(dǎo)致172人食物中毒[24-25]。微生物污染可以發(fā)生在蔬菜供應(yīng)鏈的不同環(huán)節(jié),其中種植和加工是污染風(fēng)險最大的環(huán)節(jié)[26]。無土栽培相對土壤種植能夠更有效地控制微生物污染。研究發(fā)現(xiàn),不同基質(zhì)栽培的櫻桃、番茄根際微生物菌落總數(shù)在土壤、稻殼、營養(yǎng)液栽培中依次減少;在用不同基質(zhì)栽培甜瓜的研究中也發(fā)現(xiàn),微生物數(shù)量表現(xiàn)為土壤＞碳化稻殼＞稻殼＞珍珠巖＞營養(yǎng)液[27],這些研究都說明水培方式相對于其他栽培方式更加安全可控。臭氧是一種非常強的氧化劑,具有很強的氧化力,如果有足夠的曝氣時間和濃度,可以殺死水中的所有生物,因此可以用來對營養(yǎng)液進行消毒[28]。本研究顯示,在菠菜生長第1周至第7周成熟過程中,使用臭氧對營養(yǎng)液進行殺菌,營養(yǎng)液中微生物菌落總數(shù)始終保持相對穩(wěn)定,大腸菌群數(shù)量有明顯下降趨勢,常見致病菌的檢測均未檢出;回液端的營養(yǎng)液經(jīng)臭氧殺菌后,細菌種類明顯減少,腐敗菌占比明顯下降,以上均說明水培蔬菜可以通過臭氧殺菌環(huán)節(jié)殺滅部分有害細菌,較好地控制種植環(huán)境,降低成品蔬菜的微生物污染風(fēng)險。蔬菜成熟后及時去根加工,能夠有效減少葉片中致病性微生物種類增長的風(fēng)險,在一定程度上預(yù)防了交叉污染的可能性。建議企業(yè)在運輸、貯存、加工蔬菜之前及時去根,以降低成品蔬菜的微生物污染風(fēng)險。

本試驗從水培蔬菜的營養(yǎng)液種植環(huán)境控制和成品菜去根加工兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)對微生物污染風(fēng)險進行了研究分析,為水培蔬菜微生物污染風(fēng)險的后續(xù)研究提供了參考數(shù)據(jù)。