毛細管離心術(shù)在胎母血型不一致的臨床大量FMH綜合征的診斷價值*

張源秦 徐璐 馬怡然 楊融輝 郝一文 程大也 叢桂敏

胎母輸血（fetomaternal hemorrhage，F(xiàn)MH）是指一定量的胎兒紅細胞通過破損的胎盤和（或）絨毛膜間隙進入母體血液循環(huán)，可以發(fā)生在懷孕的各個階段[1]。FMH綜合征指的是出血量較大，引發(fā)一系列不同程度的胎兒貧血和母親溶血性失血反應(yīng)的一種臨床癥候群[2]。國內(nèi)外尚無大量FMH的出血量普遍接受的診斷閾值，目前普遍認為胎兒出血量≥30 mL對孕產(chǎn)婦血型免疫（特別是RhD抗原的同種免疫）、胎兒及新生兒預(yù)后具有意義[3-4]。大量FMH的診斷主要依靠流式細胞術(shù)、酸洗脫實驗和HbF測定等，由于對實驗設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的要求高且操作復(fù)雜，難以在臨床常規(guī)開展[5-6]。我們前期通過在體外模擬實驗發(fā)現(xiàn)毛細管離心術(shù)對胎母ABO血型不一致的大量FMH具有一定的診斷價值[7]。本研究通過選取臨床疑似為大量FMH綜合征的臨床標(biāo)本對上述指標(biāo)進行驗證，以評估毛細管離心術(shù)對胎母血型不一致的大量FMH綜合征的輔助診斷價值、臨床適用性。

資料與方法

1一般資料 選取2020年7月～2021年7月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和沈陽市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科分娩，臨床有大量FMH綜合征典型表現(xiàn)的孕產(chǎn)婦25例。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會及相關(guān)合作部門的批準(zhǔn)（倫理批號: AF-SOP-07-1.1-01），所有孕產(chǎn)婦常規(guī)實驗均知情同意并簽署相關(guān)知情同意書，充分了解檢測目的和過程以及可能存在的風(fēng)險。

2病例納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：1）孕婦出現(xiàn)不明原因死胎；2）孕婦主訴胎動減少或消失；3）胎心監(jiān)護異常（出現(xiàn)正弦波、胎心基線變異減少、晚期減速）；4）B超提示胎兒生長受限、胎兒貧血、水腫和（或）肝脾腫大；5）血管彩超發(fā)現(xiàn)MCA-PSV≥1.5 MoM ；6）新生兒進行性貧血；7）孕婦門診為O型（丈夫血型為A型、B型或AB型）或孕婦門診血型為RhD陰性（丈夫血型為RhD陽性）且產(chǎn)后母親與新生兒血型不一致；滿足1和7或2、3、4和7的臨床表現(xiàn)、超聲高度懷疑胎母輸血綜合征。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）血液病（如遺傳性血紅蛋白病、鐮狀細胞性貧血和β-地中海貧血等）；2）惡性腫瘤?。?）有腦部或精神類疾病患者；4）近三個月有輸血史的孕婦；5）拒絕抽血配合者，資料不全。

3方法 所有納入研究的可疑大量FMH的孕產(chǎn)婦同時行流式細胞術(shù)和毛細管離心術(shù)兩種方法加以相互印證。

3.1毛細管離心術(shù)

1）將孕產(chǎn)婦新鮮EDTA-K2抗凝血用生理鹽水洗滌3次，最后1次用1 000 g離心9 min，盡可能去掉上清后混勻；

2）將洗滌后的RBC吸出后混勻，加入2根比積管，留出5 mm長度封口備用；

3）血液加入端用橡皮泥封死管底，擠出的血液用紗布吸走，放入帶有編號的離心槽，注意平衡，擰緊內(nèi)蓋，關(guān)上離心機外蓋12 000 r/min離心20 min；

4）在距紅細胞柱頂（遠心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為胎兒紅細胞；在距紅細胞柱底（近心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為母體新鮮紅細胞。近心端、遠心端切開的紅細胞比積管用生理鹽水洗滌3次后進行試管法ABO血型正定型鑒定。

5）采用試管法對分離的遠心端紅細胞及近心端紅細胞進行ABO血型正定型檢測，如果不一致，表明毛細管離心術(shù)實驗陽性，提示此孕婦發(fā)生了大量FMH。近心端紅細胞ABO血型鑒定結(jié)果為O型，遠心端紅細胞ABO血型鑒定結(jié)果與臍帶血標(biāo)本中的紅細胞血型一致（A型或B型）時證明毛細管離心技術(shù)分離成功。

以上參考《AABB技術(shù)手冊》和《輸血技術(shù)操作規(guī)程（輸血科部分）》[8-9]。

3.2胎兒血紅蛋白HbF的流式檢測

1）用O型育齡期非妊娠健康女性捐獻者EDTAK2抗凝血2 mL加入容量占比為5%的臍帶血作為質(zhì)量控制標(biāo)本（陽性對照和陰性對照）；

2）實驗血標(biāo)本和對照血標(biāo)本（孕產(chǎn)婦新鮮EDTA-K2抗凝血）的RBC計數(shù)在血常規(guī)計數(shù)儀上測定，并用PH=7.4的PBS調(diào)節(jié)至終濃度為2.5×106/mL；

3）取2×107個RBC在室溫下用pH=7.4的PBS新配置成0.05%戊二醛溶液固定10 min；

4）用PBS將細胞洗滌3次，并在室溫下用0.1%TritonX-100的PBS滲透5 min；

5）用PBS將細胞再次清洗后，試驗管和陽性對照管?。?～2）×105個細胞與10 μL抗HbF抗體混合；陰性對照管?。?～2）×105個細胞與10 μL PBS混合；

6）各管均補充加入70 μL 0.1%牛血清白蛋白（PBS-BSA），將細胞在黑暗中干燥15 min；

7）用PBS將細胞洗滌3次，然后重懸于0.5 mL的1%多聚甲醛中，并在8 h內(nèi)上機檢測；

8）在Flowjo上分析計算胎兒血紅蛋白HbF占比；

以上參考文獻[10-11]。

3.3胎兒出血量的計算：流式分析檢測的胎兒出血量=孕婦血容量×胎兒HbF（%）[12-13]。

4指標(biāo)觀察與數(shù)據(jù)收集 通過查閱臨床電子病歷系統(tǒng)，記錄孕產(chǎn)婦年齡、胎齡、孕產(chǎn)次、主要診斷、胎心監(jiān)護和計數(shù)胎動情況；記錄新生兒Apgar評分、主要診斷、治療及預(yù)后。

5統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計數(shù)資料以例數(shù)、百分比（n，%）表示；以流式細胞術(shù)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)計算毛細管離心術(shù)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陽性似然比和符合率。

結(jié)果

1大量FMH綜合征孕產(chǎn)婦一般情況 2020年7月～2021年7月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和沈陽市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科分娩的孕產(chǎn)婦共12 017名。臨床表現(xiàn)疑似大量FMH綜合征25例，其中流式確診出血量≥30 mL的FMH綜合征孕產(chǎn)婦有15例，大量FMH綜合征的發(fā)病率為1.25‰；15例大量FMH綜合征中11例用毛細管離心術(shù)分離并鑒定出遠心端胎兒紅細胞血型。上述15例大量FMH綜合征的年齡范圍27～45歲，平均年齡33.73±4.83歲；孕次1～7次，平均懷孕3.2±1.373次；孕周33+6～39+2，平均孕周38.01±1.48；均為經(jīng)產(chǎn)婦，剖宮產(chǎn)。15例大量FMH綜合征均出現(xiàn)不同程度的胎心監(jiān)護異常，其中13例出現(xiàn)胎動減少，見表1。

2新生兒情況 在15例出血量≥30 mL的大量FMH綜合征的孕產(chǎn)婦中，有14例足月兒，1例出生時發(fā)生宮內(nèi)死產(chǎn)。體重范圍為1 500～3 810 g，平均體重2 685±727 g。2例發(fā)生新生兒Rh溶血（母嬰Rh血型不合；新生兒溶血三項實驗中，抗體釋放試驗和直接抗球蛋白實驗陽性），8例高膽紅素血癥（早產(chǎn)兒血清膽紅素＞225 μmol/L，足月兒血清膽紅素＞220.6 μmol/L，每日膽紅素升高超過85 μmol/L）[14]，5例顱內(nèi)出血，2例呼吸困難、窒息，13例經(jīng)過了輸血等治療恢復(fù)良好后出院。新生兒死亡率13.35%（2/15），見表2。

表2 新生兒一般情況

3毛細管離心術(shù)在大量FMH綜合征（FMH≥30mL）的診斷結(jié)果 在25例高度懷疑發(fā)生大量FMH綜合征的孕婦中，胎兒出血量≥30 mL有15例，其中13例胎兒與母親ABO血型不一致，2例胎兒與母親RhD血型不一致，毛細管檢測出近心端與遠心端血型不一致的陽性有11例且與產(chǎn)后胎母血型一致，詳見表3。

表3 毛細管離心術(shù)診斷結(jié)果

4毛細管離心術(shù)在大量FMH綜合征（出血量≥30 mL）的診斷效能評價 在25例高度懷疑發(fā)生大量FMH綜合征的孕婦中，胎兒出血量≥30 mL有15例。毛細管檢測出近心端與遠心端血型不一致的陽性有15例，其中胎兒出血量≥30 mL有11例，還有4例胎兒出血量＜30 mL也出現(xiàn)了毛細管近心端遠心端不一致的結(jié)果。因此，毛細管離心術(shù)在大量FMH 綜合征（出血量≥30 mL）敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陽性似然比、符合率，見表4。

表4 毛細管離心術(shù)對FMH綜合征（出血量≥30 mL）診斷性效能評價

討論

大量FMH綜合征，如急性失血量超過胎兒血容量的50%，可導(dǎo)致胎兒發(fā)生低血容量休克和心衰、甚至死亡；慢性失血時可出現(xiàn)除胎盤外的胎兒水腫、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩甚至胎死宮內(nèi)。慢性FMH的胎兒即使存活，可能會出現(xiàn)新生兒貧血、足月小樣兒。此外，胎母血型不一致的大量FMH是造成孕婦同種免疫及新生兒溶血病發(fā)生的重要機制之一[15]。大量FMH刺激母體產(chǎn)生大量IgG抗體可導(dǎo)致胎兒嚴(yán)重溶血、甚至新生兒溶血病和高膽紅素血癥的發(fā)生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害、呼吸窘迫、持續(xù)性肺動脈高壓、失血性休克或死產(chǎn)等[16-20]。大量FMH發(fā)生時，母親可因胎母血型不合而發(fā)生溶血，出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)等溶血性輸血反應(yīng)。

在15例出血量≥30 mL的大量FMH綜合征孕婦中，有2例妊娠糖尿病，2例妊娠貧血，1例完全性前置胎盤，2例抗篩陽性（存在抗D抗體）；有13例出現(xiàn)了胎動減少，2例出現(xiàn)了胎動頻繁；15例均出現(xiàn)胎心監(jiān)護異常，3例出現(xiàn)正弦曲線，4例無反應(yīng)或反應(yīng)差，5例出現(xiàn)減速，4例變異或變異差；14例新生兒均發(fā)生不同程度貧血，1例胎死宮內(nèi)，1例重度貧血放棄治療，新生兒死亡率為13.3%（2/15）；8例出生后高膽紅素血癥，2例Rh系統(tǒng)溶血，2例出現(xiàn)呼吸困難和窒息，3例出現(xiàn)顱內(nèi)出血，1例凝血功能異常；13例新生兒出現(xiàn)了不同程度的貧血，經(jīng)過少量多次的輸血治療后預(yù)后較好。綜上可見，大量FMH綜合征嚴(yán)重危害胎兒和新生兒的健康和生命安全。

本研究以流式細胞術(shù)為金標(biāo)準(zhǔn)，流式細胞術(shù)診斷出血量≥30 mL的胎母輸血綜合征有15例，同步進行毛細管離心術(shù)檢測，其中有11例出現(xiàn)了近心端和遠心端胎母血型不一致的陽性結(jié)果，還有4例胎兒出血量＜30 mL母親體重較輕血容量小也出現(xiàn)了毛細管近心端遠心端不一致的結(jié)果。毛細管離心術(shù)在臨床病例的大量FMH（出血量≥30 mL）的敏感度為73.3%，特異度60%，陽性預(yù)測值73.3%，符合率60%等指標(biāo)都高于我們前期模擬實驗中兩個大量FMH組對應(yīng)指標(biāo)數(shù)值[6]，說明毛細管離心術(shù)在臨床大量FMH病例的篩查效能更高。分析原因可能為模擬實驗中孕婦血容量較大，胎兒紅細胞在母血中所占比容較低；臨床病例的被檢孕婦血容量比模擬實驗的血容量普遍較低，胎兒紅細胞在母血中所占比容較高，更容易被毛細管離心所分離。毛細管離心術(shù)靈敏度為73.3%，如果實驗結(jié)果陰性，也不能排除FMH綜合征，應(yīng)予以密切監(jiān)護，必要時進行流式分析等其他檢測方法加以實驗室診斷；如果實驗結(jié)果陽性，基本能證實胎兒出血量比較大，應(yīng)予以密切監(jiān)護，指導(dǎo)產(chǎn)科醫(yī)生盡早干預(yù)并進行下一步治療。

本研究中有4例孕產(chǎn)婦發(fā)生大量FMH綜合征且胎兒出血量≥30 mL，毛細管離心術(shù)并未出現(xiàn)陽性結(jié)果，分析原因可能是部分孕產(chǎn)婦發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重的大量FMH綜合征，檢測時距離發(fā)生胎母輸血的時間過長，胎兒紅細胞被母親體內(nèi)免疫性抗體破壞清除，以至于未檢測出胎兒紅細胞。PENG[21]通過體外模擬大量FMH模型發(fā)現(xiàn)當(dāng)攜帶父親抗原的胎兒紅細胞（最重要的是ABO系統(tǒng)血型抗原）可能與母體的血漿不相容，可能被母親體內(nèi)天然的抗體清除。KIM[17]也認為在O型母體攜帶A、B或AB型胎兒的體內(nèi)，天然存在異型抗血清會加速母體循環(huán)中胎兒紅細胞的清除，因此在夫婦ABO血型不相容的情況下，建議在高度懷疑FMH綜合征時應(yīng)立即進行試驗。

隨著我國“三胎”政策的放開，F(xiàn)MH、大量FMH綜合征的發(fā)病率會顯著增加，因此大量FMH的早期診斷和早期干預(yù)是改善妊娠結(jié)局、保障孕產(chǎn)婦、胎兒及新生兒身體健康的必要措施。雖然毛細管離心術(shù)不是診斷FMH綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)，但對在臨床上出現(xiàn)可疑FMH綜合征的臨床表現(xiàn)的大量篩查對預(yù)防胎母同種免疫可能至關(guān)重要。如果不能及時識別及診斷FMH綜合征，不及時進行干預(yù)及治療，可能導(dǎo)致胎兒及新生兒不良結(jié)局。我們建議有高危FMH風(fēng)險且夫婦血型不一致的孕產(chǎn)婦，若孕婦產(chǎn)前血型已知，排除ABO亞型和抗原減弱等情況下，在妊娠中晚期用毛細管分離發(fā)現(xiàn)母體ABO的異型血細胞抗原，毛細管離心術(shù)實驗結(jié)果陽性，結(jié)合FMH綜合征的臨床表現(xiàn)，可以認為發(fā)生了大量FMH綜合征，指導(dǎo)產(chǎn)科醫(yī)生早期進行干預(yù)及進一步治療（如終止妊娠或輸血治療或保胎治療），避免了漏診和誤診。毛細管離心術(shù)簡便、快速、易操作、不需要復(fù)雜的試劑，無侵入性，1～2 h即可回報結(jié)果，特別是在一些偏遠地區(qū)缺乏FMH確診的金標(biāo)準(zhǔn)時，更有可行性和經(jīng)濟適應(yīng)性。

胎母血型不合的FMH綜合征包括ABO血型不合、Rh血型不合及其他稀有血型不合。本臨床研究僅針對胎母ABO血型系統(tǒng)和RhD血型進行了毛細管離心術(shù)的分離及檢測研究，對于夫妻ABO血型一致，但其他血型系統(tǒng)不一致的FMH沒有進行檢測及研究。后期我們將增加高危FMH的毛細管離心術(shù)的檢測病例數(shù)，了解臨床真實的FMH發(fā)病率，特別是有臨床意義的大量FMH發(fā)病率；對毛細管離心術(shù)篩查陰性病例但高度懷疑的FMH病例增加其他血型系統(tǒng)的檢測，提高檢出率，并探討研究毛細管離心術(shù)結(jié)合ABO血型及其他血型檢測對FMH綜合征的出血量檢出閾值、篩查的靈敏度及特異性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突