石墨烯量子點與細(xì)胞免疫相關(guān)性研究新進(jìn)展*

徐亞棟 李志強(qiáng)

石墨烯量子點（graphene quantum dots，GQDs）是納米碳材料家族的最新成員，由PONOMARENKO等[1]在2008年被研發(fā)成功。它是一種零維石墨烯材料，為橫向尺寸小于100納米的石墨烯薄片，包含一個或多個（2～10層）石墨烯層。其具有優(yōu)異的化學(xué)、物理和生物特性，在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，如：具有很強(qiáng)且可協(xié)調(diào)的熒光特性，可用于熒光生物成像和生物傳感；具有類芳香化合物的高負(fù)載能力，可用于小分子藥物傳遞，甚至基因傳遞；以及具有光輻射下產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的能力，可用于光熱和光動力療法治療癌癥[2]。研究表明，石墨烯及其衍生物可影響巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化發(fā)育[3]，在疫苗、免疫制劑制備方面也具有潛在用途[4]。而GQDs作為石墨烯的衍生物，有更小的體積，不僅具有石墨烯的特性[5]，同時具有更高的生物相容性，故可作為治療炎性疾病的潛在藥物[6]。

1石墨烯量子點的生物相容性 生物相容性的總體定義是材料不引起意外生物反應(yīng)的情況下執(zhí)行其預(yù)期功能的能力，但材料的生物相容性范圍取決于具體的應(yīng)用[7]。許多碳基納米顆粒會因為相互聚集而產(chǎn)生毒性，這限制了其在生物體中的應(yīng)用，但GQDs表面存在-OH和-COOH等富氧基團(tuán)，這些極性成分使GQDs具有優(yōu)異的水溶性[8]，有利于其生物利用，而且GQDs為碳基顆粒，不用擔(dān)心金屬殘留的毒性問題。

1.1石墨烯量子點具有低細(xì)胞毒性：碳基納米顆粒的生物相容性在很大程度上取決于它們的表面化學(xué)性質(zhì)[4]。GQDs主要通過小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被細(xì)胞內(nèi)化，體外研究表明，被-NH2，-COOH，-CHO-N-（CH3）2，聚乙二醇（PEG）等基團(tuán)修飾的GQDs在濃度高達(dá)200 μg/mL時顯示出低毒性，而-OH修飾的GQDs在100 μg/mL以上時表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性[9-11]。GQDs還顯示出較低的遺傳毒性，以往的研究中，碳納米管[12]和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）[13]都被發(fā)現(xiàn)在低濃度下會導(dǎo)致DNA損傷，WU等[14]研究發(fā)現(xiàn)GQDs對MCF-7和MGC803細(xì)胞的DNA有輕微的損傷，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于GO，GO在亞G1期便引發(fā)顯著的細(xì)胞聚集，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。

1.2石墨烯量子點的血液相容性：血液不僅是靜脈注射給藥的納米顆粒的第一接觸點，也是通過其他途徑給藥的所有納米顆粒到達(dá)其目標(biāo)組織或器官的通道。因此評估GQDs的血液細(xì)胞相容性也非常重要。對于這方面的研究較少，KIM等[15]將人血紅細(xì)胞與不同官能團(tuán)修飾的GQDs（非官能化、羥基化和羧化GQDs）共同孵育發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度低于500 μg/mL時，紅細(xì)胞的溶血率和流變學(xué)沒有明顯改變；而當(dāng)濃度＞750 μg/mL時，羧基化GQDs造成了溶血，并導(dǎo)致紅細(xì)胞的變形和聚集。然而體內(nèi)血液循環(huán)中，GQDs與血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血漿蛋白直接接觸，并可能相互影響，體外單種血細(xì)胞的評估不能完全反映GQDs的血液相容性，但在小鼠模型中，短期應(yīng)用還未觀察到明顯的血栓及心血管并發(fā)癥。

1.3石墨烯量子點在生物模型中的毒性：NURUNNABI等[16]單次給小鼠靜脈注射羧基GQDs，觀察其生物分布和細(xì)胞毒性以及體內(nèi)器官成像，發(fā)現(xiàn)GQDs從12 h開始被逐漸清除。并且連續(xù)給藥21 d（5或10 mg·kg-1·d-1）后沒有明顯的器官損傷或損傷。CHONG等[11]發(fā)現(xiàn)對小鼠靜脈和腹腔注射聚GQDs-PEG（20 mg·kg-1·d-1）14 d不會產(chǎn)生任何明顯毒性。同樣，在斑馬魚和秀麗隱桿線蟲中也未觀察到GQDs的明顯毒性[17-18]。

1.4石墨烯量子點在體內(nèi)清除和降解：給小鼠靜脈和皮下注射GQDs發(fā)現(xiàn)，GQDs在腎臟內(nèi)積聚，然后通過尿液排出[19]。口服時，GQDs通過糞便排出，不會遷移到大腦或性器官[20]。超小尺寸的GQDs（＜5 nm）可以穿過腎臟濾過屏障并通過尿液排出，但是羧基GQDs雖然大小為3～6 nm，卻不能穿過腎濾過屏障，而是分布在肝臟和脾臟[21]。另外，研究表明，GQDs可被人髓過氧化物酶（MPO）和嗜酸性過氧化物酶（EPO）降解[22]。這可能是小鼠靜脈注射羧基GQDs沒有發(fā)現(xiàn)明顯毒性的部分機(jī)制。

總之，目前的研究顯示，GQDs具有較低的毒性，這成為了它作為治療藥物的前提。

2石墨烯量子點的抗氧化性 ROS是一組由機(jī)體各種細(xì)胞產(chǎn)生的不穩(wěn)定分子，包括過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH-）、單線氧（1O2）和超氧化物（O2-）等，在機(jī)體抵抗病原體和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起著重要作用，但他們?nèi)绻荒芗皶r清除并在細(xì)胞內(nèi)蓄積，會破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，造成氧化損傷[23]。研究表明，GQDs在生物系統(tǒng)中既具有ROS猝滅活性，又具有產(chǎn)生活性[24-25]。在光激發(fā)下，GQDs通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平從而降低細(xì)胞活力表現(xiàn)出顯著的光毒性，而在無光激發(fā)的情況下GQDs可以有效地清除大量ROS，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[26]，如圖1。如：NILEWSKI等[27]報道了GQDs-PEG對細(xì)胞具有低毒性并且有顯著的抗氧化作用。ROSTAMZADEH等[28]發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌埂死模型中GQDs-PEG能緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

圖1 在光激發(fā)下，GQDs可產(chǎn)生活ROS，而在無光激發(fā)的情況下GQDs可有效地清除ROS

2.1GQDs的清除活性氧的機(jī)制：石墨烯的sp2雜化的碳原子蜂窩網(wǎng)絡(luò)是其他碳同素異形體的基本組成部分。簡單來說蜂窩網(wǎng)格結(jié)構(gòu)包裹形成零維富勒烯，卷起形成一維的碳納米管，堆疊形成三維的石墨，切割形成零維的GQDs，如圖2?；钚匝蹩梢越Y(jié)合到GQDs的sp2碳結(jié)構(gòu)域，GQDs的π-π共軛性質(zhì)和豐富的邊緣缺陷位點促進(jìn)了活性氧和GQDs之間的電荷轉(zhuǎn)移，從而消除活性氧。此外，GQDs表面豐富的含氧官能團(tuán)（-OH、-COOH等）促進(jìn)了GQDs中的自由電子離域化，表現(xiàn)出供氫能力，來消除ROS。

圖2 石墨烯及其衍生物結(jié)構(gòu)示意圖

2.2氧化程度和氧含量對石墨烯量子點活性氧清除能力的影響：氧化程度和氧含量會影響石墨烯基材料的加合物形成、電荷轉(zhuǎn)移和供氫能力，從而影響其活性氧清除能力。一方面，引入的氧原子可以破壞GQDs原有的結(jié)構(gòu)（電子轉(zhuǎn)移的主要場所），降低ROS清除能力。然而，另一方面，含氧官能團(tuán)，例如-OH、C=O和-COOH，可以促進(jìn)ROS的吸附，并有利于ROS與石墨烯基材料之間加合物的形成和電子轉(zhuǎn)移[29]。GQDs表面含有豐富的含氧基團(tuán)，研究表明GQDs表面的含氧基團(tuán)可以有效清除ROS，并且C-OH和C=O基團(tuán)比C-O-C基團(tuán)更具清除ROS的活性[30]。WANG等[31]設(shè)計了一種表面富含-OH的類酚基團(tuán)功能化GQDs具有高效的ROS清除活性，并且在急性腎損傷小鼠模型中，僅使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）十六分之一劑量就可以有效保護(hù)腎臟免受氧化損傷。

2.3元素?fù)诫s對石墨烯量子點活性氧清除能力的影響：一般來說，摻雜富電子元素（如N、P、Se、S和Cl）可以提高自由基清除能力[32-33]。WANG等[34]合成了氯摻雜的GQDs（Cl-GQDs），其ROS的清除能力是未摻雜GQDs的7倍。RUIZ等[35]發(fā)現(xiàn)表面具有豐富含氮基團(tuán)（C-N和C=N）的GQDs具有極高的供氫能力和抗氧化活性。LI等[36]人報道了磷摻雜的GQDs的DPPH·清除活性（79.1%）是未摻雜GQD（35.5%）的2倍以上。BYEONGTAEK等[37]合成了硫醇化石墨烯量子點（SH-GQDs）能有效清除巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS。

3石墨烯量子點的免疫調(diào)節(jié)性 ROS是免疫細(xì)胞中氧化應(yīng)激和氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵媒介[38]，GQDs對ROS的調(diào)控可能對免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。此外，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的功能受到自噬的調(diào)控[39-41]。多項研究表明GQDs可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[10,42-44]，如圖3。因此，GQDs可能通過清除ROS和誘導(dǎo)自噬兩方面作用調(diào)節(jié)免疫。

圖3 GQDs誘導(dǎo)自噬的作用機(jī)制示意圖

3.1石墨烯量子點與T細(xì)胞 T細(xì)胞作為最重要的免疫細(xì)胞之一，與多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究表明GQDs可影響T細(xì)胞亞群的分化發(fā)育并緩解炎癥性疾病。VOLAREVIC等[6]利用GQDs治療刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎，發(fā)現(xiàn)GQDs能抑制T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化和巨噬細(xì)胞活化來緩解炎癥，并且大顆粒GQDs（寬度大于40 nm）和小顆粒GQDs（寬度5～30 nm）表現(xiàn)出相似的治療效果。TOSIC等[45]大鼠神經(jīng)炎癥模型中，發(fā)現(xiàn)GQDs能通過調(diào)節(jié)MAPK/Akt信號通路和Th1免疫應(yīng)答來緩解免疫介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

3.2石墨烯量子點與巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞在具有高度功能異質(zhì)性的先天免疫應(yīng)答中起著重要作用。它是一種來源于組織中單核細(xì)胞的白細(xì)胞，能以不動細(xì)胞或自由細(xì)胞的形式吞噬和消化死亡細(xì)胞和入侵病原體的碎片，從而激活淋巴細(xì)胞和其他類型的免疫細(xì)胞，加速其對入侵病原體作出反應(yīng)。巨噬細(xì)胞將在不同的微環(huán)境中極化，產(chǎn)生促進(jìn)炎癥的經(jīng)典M1型巨噬細(xì)胞和抑制炎癥的選擇性M2型巨噬細(xì)胞。ROS有利于誘導(dǎo)M1型促炎巨噬細(xì)胞。自噬缺陷導(dǎo)致炎癥M1型巨噬細(xì)胞過度激活[46]，因此GQDs的ROS清除作用和自噬誘導(dǎo)作用可能影響巨噬細(xì)胞亞群的分化。LEE等[47]發(fā)現(xiàn)GQDs可改善右旋糖酐硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，并在體內(nèi)外的試驗中證明了GQDs不僅能夠直接抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，還可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M0向M2亞型的分化，使小鼠結(jié)腸局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的浸潤增加，并間接抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化。

3.3石墨烯量子點與DC細(xì)胞：抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）和T淋巴細(xì)胞之間的相互作用是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。DC是最重要的APC，能夠感知微環(huán)境并遷移到淋巴結(jié)，從而激活抗原特異性T細(xì)胞[48]。除了誘導(dǎo)針對入侵病原體的有效免疫反應(yīng)外，DC還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能，以維持中樞和外周的免疫耐受。耐受性DC與其未成熟表型相關(guān)，表面含有少量共刺激分子，并分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，促使T細(xì)胞分化為抗炎的Treg[49]。DC和T細(xì)胞的功能都受自噬調(diào)節(jié)，并與其他信號通路發(fā)生復(fù)雜的相互作用[50]。自噬可以限制DCs的成熟及其分泌促炎細(xì)胞因子的能力[51-53]。哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[54]，在DC分化發(fā)育中也起著關(guān)鍵作用。SAID等[52]發(fā)現(xiàn)了GQDs誘導(dǎo)耐受性DC細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫功能的機(jī)制。GQDs被DC細(xì)胞攝取后可通過mTOR依賴的自噬誘導(dǎo)機(jī)制抑制人單核細(xì)胞源性DC的發(fā)育和功能，使其分化為耐受性DC。從而抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化，使其向Th2和Treg細(xì)胞的分化。此外，研究還發(fā)現(xiàn)GQDs不僅降低了DC中活性氧的產(chǎn)生，而且還減少了NF-kB的核轉(zhuǎn)位，推測可能是對產(chǎn)生耐受性DC細(xì)胞起到了積極的作用。但在此研究中并未發(fā)現(xiàn)GQDs對T細(xì)胞分化的直接影響，這與LEE等[47]的研究結(jié)果有出入。

總的來說，GQDs除了能直接影響T細(xì)胞的分化發(fā)育之外，還能通過作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞這些具有抗原遞呈作用的細(xì)胞間接影響T細(xì)胞的分化發(fā)育來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，如圖4。

圖4 GQDs調(diào)節(jié)免疫作用示意圖

4總結(jié)與展望 GQDs作為一種碳基納米材料，在藥物輸送、生物傳感、生物成像和光化學(xué)治療的應(yīng)用中得到了廣泛研究，但它的物理化學(xué)及生物學(xué)特性使它本身成為一種具有治療活性的藥物。GQDs的高水溶性、低毒性、抗氧化性以及免疫調(diào)節(jié)活性，使它具有治療炎性疾病的潛力。由于炎性疾病的主要治療目標(biāo)是改善過度的免疫反應(yīng)，注射的顆粒需要不對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生額外的刺激，GQDs的表面結(jié)構(gòu)使其帶有負(fù)電荷，許多研究表明帶負(fù)電荷的納米顆粒具有低免疫原性[53]。另外，GQDs具有較大的比表面積以及特殊的理化結(jié)構(gòu)（可以與各種官能團(tuán)、靶向配體和生物活性分子進(jìn)行結(jié)合），是藥物靶向輸送的理想納米載體[2]，有利于提高藥物療效和減少免疫抑制藥物的全身不良反應(yīng)。例如：KHODADADEI等[57]報道了負(fù)載甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）的氮摻雜GQDs納米載體能夠作為有效的抗癌藥物傳遞系統(tǒng)，能夠有效傳遞抗癌藥物至靶細(xì)胞，并減少對正常細(xì)胞的傷害。目前GQDs的藥物運輸研究主要是腫瘤化療藥物運輸及基因治療，未來GQDs可負(fù)載抗體及免疫調(diào)節(jié)藥物在炎性疾病的治療方面具有巨大的潛力。除此之外，GQDs還具有多種治療活性，抗菌活性、抗阿爾茨海默病、抗帕金森病和抗糖尿病活性也有報道。

需要注意的是GQDs是一種相對較新的材料，目前對于影響GQDs免疫調(diào)節(jié)影響因素（結(jié)構(gòu)、大小、官能基團(tuán)等）的研究較少，各個研究的GQDs表征數(shù)據(jù)存在差異，如QIN等[43]報道的GQDs在THP-1人單核細(xì)胞系中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和促炎癥反應(yīng)。與前文所述諸多報道：GQDs具有清除ROS和免疫抑制作用不吻合。這可能是由于單一細(xì)胞的體外實驗的特殊性或者GQDs的物理化學(xué)特征差異造成的。另一方面，短期的體外和生物模型的毒性試驗還遠(yuǎn)不足以證明GQDs在哺乳動物甚至人體中的安全性，需要更廣泛和長期的毒理性研究，才確保GQDs更安全更可靠地應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突