MC1R在食管鱗癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)

周笑世，常 江，彭立雄，柳溪林，尉發(fā)正，徐健峰，章沙沙，，胡 盼，柳增善，張國軍

1吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，人與動(dòng)物共患傳染病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130062；2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033；3盤錦檢驗(yàn)檢測中心，遼寧 盤錦124010

食管癌（EC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國分別位居第6位和第4位［1］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，食管癌的發(fā)病率具有男性高于女性的特點(diǎn)，男女比例約為3∶1［2］。食管癌的組織學(xué)類型主要為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌［3］，其中食管鱗癌（ESCC）是我國食管癌患者的常見類型［4］。由于食管鱗癌缺乏早期臨床癥狀及特異性診斷方法，故臨床確診時(shí)多已為中晚期，錯(cuò)過患者最佳的治療時(shí)期，致使治愈率和五年生存率較低［5］。因此，探索可用于食管鱗癌診斷的分子標(biāo)志物具有重要意義。

黑色素皮質(zhì)I型受體（MC1R）基因是人類黑色素合成過程中的關(guān)鍵基因［6］。近些年來，越來越多的研究表明MC1R與黑色素瘤、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生相關(guān)［7-9］，其主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9-11］。迄今為止，暫無MC1R在食管鱗癌細(xì)胞或組織中表達(dá)量變化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但柳溪林等［12］在對(duì)靶向MC1R重組毒素進(jìn)行不同細(xì)胞系的殺傷作用分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該毒素對(duì)人食管中段鱗癌細(xì)胞ECA109細(xì)胞的殺傷能力很強(qiáng)，且MC1R在該細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上調(diào)，但沒有進(jìn)行臨床病例分析。MC1R 在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中表達(dá)量的差異，表明其具有作為診斷或靶向治療標(biāo)志物的潛力［13］。

因此，為了進(jìn)一步探究MC1R在食管鱗癌臨床中的意義，我們使用RT-PCR、Western blotting和IHC等方法探究MC1R在食管鱗癌中的表達(dá)情況，并分析MC1R表達(dá)量與臨床病理參數(shù)如年齡、分化程度、分期等的關(guān)系，以初步探討MC1R在食管鱗癌診斷或預(yù)后中的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 基于UALCAN 平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析

使用基于TCGA數(shù)據(jù)庫的UALCAN 平臺(tái)（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）驗(yàn)證MC1R 在食管癌和正常食管組織中的表達(dá)情況［14］。在UALCAN平臺(tái)中設(shè)置限定條件如下：gene symbol:MC1R;TCGA dataset:Esophageal carcinoma。

1.2 組織樣本與細(xì)胞

選取2019年～2021年吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院收治的接受食管癌根治手術(shù)治療且病理和臨床資料完整的食管鱗癌患者51例，其中男性47例，女性4例。所選取術(shù)后組織標(biāo)本均由臨床和病理確診為食管鱗癌，包括19 例食管鱗癌組織和配對(duì)的食管癌旁組織（距癌灶3～5 cm）以及32例食管鱗癌組織切片和配對(duì)的癌旁組織切片。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性食管癌，且經(jīng)病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；（2）患者接受食管癌根治手術(shù)，男女均可；（3）患者依從性好，臨床資料完整；（4）患者同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并患有其他部位惡性腫瘤的患者；（2）合并患有其他可能影響腫瘤標(biāo)志物表達(dá)的疾病；（3）存在精神類疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、妊娠、哺乳等可能影響本研究結(jié)果的患者；（4）術(shù)前曾進(jìn)行放化療及其他針對(duì)食管癌的治療［15,16］。受地域因素影響，所獲取的樣本男女比例差異較大，但鑒于食管癌男女性皆可發(fā)病及其流行病學(xué)特征，故未將性別作為排除標(biāo)準(zhǔn)。參照AJCC制訂的惡性腫瘤臨床分期（第八版）中食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行臨床分期，并分別從年齡、腫瘤位置、分化程度及TNM分期等7個(gè)臨床特征進(jìn)行分析。本研究獲得吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可（倫理號(hào)：20220118012）。

人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1、ECA109、KYSE150購自湖南豐暉生物科技有限公司，人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE510購自上海譽(yù)弛生物科技有限公司，人食管鱗癌細(xì)胞系TE-13、EC9706購自寧波明舟生物科技有限公司，以RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；人食管上皮細(xì)胞BAr-T、人胃癌細(xì)胞系SGC7901購自寧波明舟生物科技有限公司，以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基中均含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素混合液，細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑及材料

TRIzol試劑（Invitrogen）；PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）；2×M5 HiPer Plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）、M5 Prestained Protein Ladder（10 000-180 000）with 45 000、M5 DL2000 DNA Marker（北京聚合美生物科技）；RIPA 裂解液（碧云天生物技術(shù)）；PMSF、BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技）；兔源MC1R多克隆抗體、鼠源β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體（Immunoway）；即用型免疫組化UltraSensitive TM SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程）。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Sequence of RT-PCR primers

1.4 食管鱗癌細(xì)胞及組織總RNA提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取細(xì)胞和食管癌臨床組織樣品中的總RNA［17］。按照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）操作說明書進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.5 食管鱗癌細(xì)胞及組織總蛋白提取

將食管癌臨床組織樣品進(jìn)行充分研磨，使用含有1%PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞和食管癌臨床組織樣品中的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測量其濃度［18］。

1.6 食管鱗癌細(xì)胞及組織基因水平MC1R表達(dá)情況的RT-PCR分析

以1.3 所述的cDNA 為模板，以β-actin 為內(nèi)參基因［19］，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×M5 HiPer Plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）10 μL、cDNA2 μL、正向引物和反向引物各1 μL、DEPC水6 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。用雙蒸餾水（ddH2O）作為空白對(duì)照，以排除體系污染。PCR 產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Image J軟件對(duì)核酸表達(dá)進(jìn)行半定量分析［20］。

1.7 食管鱗癌細(xì)胞及組織蛋白水平MC1R表達(dá)情況的Western blotting分析

將提取的細(xì)胞或組織總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過PVDF 膜以200 mA 濕轉(zhuǎn)2 h，兔源MC1R多克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶300，鼠源β-actin單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶500。二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體，以1∶3000 的稀釋倍數(shù)進(jìn)行孵育。經(jīng)TBST洗膜后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Microchemi 4.0顯影，使用Image J軟件測定顯影密度并對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析［21］。選擇食管鱗癌患者癌組織MC1R表達(dá)量的中位數(shù)0.773為閾值，小于等于此值計(jì)入低表達(dá)組，高于此值計(jì)入高表達(dá)組［9］。

1.8 食管鱗癌組織切片中MC1R的表達(dá)情況分析

采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法分析MC1R在食管鱗癌組織切片中的表達(dá)情況。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，經(jīng)由不同濃度的乙醇水化后，使用EDTA緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。后續(xù)操作按照即用型免疫組化UltraSensitiveTMSP試劑盒的說明書進(jìn)行，其中切片在4 ℃與MC1R抗體（Immunoway,1∶50）孵育過夜。并按照DAB顯色試劑盒的說明書進(jìn)行顯色，自來水沖洗后用蘇木精復(fù)染。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并記錄。

依據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和組織中陽性細(xì)胞百分比綜合判斷染色情況。染色強(qiáng)度評(píng)分為0（陰性）；1（弱）；2（中等）；3（強(qiáng)）。染色程度取決于陽性細(xì)胞的百分比，評(píng)分為0（0%～5%）；1(6%～25%)；2(26%～50%)；3（51%～75%）；4（76%～100%）。將染色強(qiáng)度得分和染色程度得分相乘計(jì)算最終得分，0～4分為低表達(dá)；4分以上為高表達(dá)［22］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用t檢驗(yàn)比較組間MC1R表達(dá)量的差異［23］，以確定MC1R 的差異表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Fisher's精確檢驗(yàn)分析MC1R表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系［24］，以確定MC1R 在食管鱗癌中的臨床意義。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌與MC1R表達(dá)的生物信息學(xué)分析

使用UALCAN平臺(tái)驗(yàn)證TCGA數(shù)據(jù)庫中MC1R在正常食管組織和食管癌組織中的差異表達(dá)情況，結(jié)果表明，MC1R在食管癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05，圖1）。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中MC1R在正常食管組織和食管癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of MC1R in normal esophageal and esophageal carcinoma tissues in TCGA(*P＜0.05).

2.2 細(xì)胞MC1R表達(dá)情況

MC1R在食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150中的表達(dá)量與BAr-T相當(dāng)，在TE-1中的表達(dá)量略高于BAr-T，食管鱗癌細(xì)胞系ECA109、KYSE30、KYSE510、TE-13、EC9706和胃癌細(xì)胞系SGC7901中MC1R表達(dá)量顯著高于人食管上皮細(xì)胞BAr-T（P＜0.01，圖2）。

圖2 MC1R細(xì)胞水平相對(duì)表達(dá)分析Fig.2 Analysis of relative MC1R expression in 7 esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)cell lines,gastric cancer cell line SGC7901 and esophageal epithelial cell BAr-T.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001 vs BAr-T cells.

2.3 組織MC1R表達(dá)情況

分別使用RT-PCR和Western blotting檢測MC1R在19例食管鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，圖3A、B分別為8組病例的RT-PCR和Western blotting 檢測結(jié)果，其中超過50%（10/19 對(duì)）的病例癌組織MC1R表達(dá)量高于癌旁組織。但t檢驗(yàn)結(jié)果（圖3C、D）顯示，RT-PCR和Western blotting檢測的MC1R 表達(dá)量在癌組織與癌旁組織中差異不顯著（P＞0.05）。

使用IHC的方法檢測32對(duì)食管鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織切片中MC1R的表達(dá)量，其中有93.75%（30/32對(duì)）的癌組織切片MC1R表達(dá)量高于相應(yīng)的癌旁組織切片。使用t檢驗(yàn)比較兩組組織之間MC1R的表達(dá)量差異，結(jié)果如圖3E所示，食管鱗癌切片樣本中癌組織MC1R表達(dá)量顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。6例代表性病例的IHC檢測結(jié)果中，F(xiàn)為食管癌旁組織，鏡下可見鱗狀上皮增生，上皮腳下延，細(xì)胞排列整齊，層次清晰，無異型性，整體呈顏色較淺的背景色；G為MC1R低表達(dá)（IHC Score=3）的病例，鏡下可見癌組織不規(guī)則片狀排列，間質(zhì)少許纖維組織內(nèi)慢性炎性細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度相較于癌旁食管組織略深，胞漿呈淺黃色，鏡下陽性細(xì)胞數(shù)60%+；H、I為MC1R較高表達(dá)（IHC Score=8）的病例，鏡下可見癌細(xì)胞多角形，不規(guī)則巢片狀排列，癌巢與間質(zhì)邊界清楚，核分裂象易見，間質(zhì)纖維組織中有炎性細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕黃色，鏡下陽性細(xì)胞數(shù)約76%+；J、K為MC1R高表達(dá)（IHC Score=12）病例，可見癌細(xì)胞多角形，呈大小不一的巢片狀排列，浸潤性生長，間質(zhì)纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕褐色，鏡下陽性細(xì)胞數(shù)約90%+（圖3F～K）。

圖3 MC1R在食管鱗癌臨床組織中的表達(dá)情況Fig.3 MC1R expression in clinical samples of ESCC.A: MC1R mRNA expression in 8 pairs of representative cases detected by RT-PCR (T: ESCC tissue.N: Paracancerous tissue).B: MC1R expression in 8 pairs of representative cases detected by Western blotting.C:Analysis of MC1R mRNA expression in 19 pairs of ESCC and adjacent tissues detected by RT-PCR.D:Analysis of MC1R expression in 19 pairs of ESCC and adjacent tissues detected by Western blotting.E:Analysis of differential expression of MC1R in 32 pairs of ESCC and adjacent tissue sections detected by IHC.F-K:MC1R expression in 6 representative cases detected by IHC(Original magnification:×100).****P＜0.0001.

2.4 患者臨床信息統(tǒng)計(jì)

食管鱗癌組織與切片樣品取自51名食管癌患者。所有患者均接受了手術(shù)切除，且臨床病歷與樣品相匹配。患者的中位年齡為63（45～81）歲。根據(jù)第八版食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，共有26名患者診斷為I/II 期，25名患者為III/IV 期?；颊叩木唧w臨床信息見表2。

表2 51例食管鱗癌患者的臨床病理參數(shù)Tab.2 Clinicopathological parameters of 51 patients with ESCC

2.5 MC1R表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

將Western blotting和IHC方法檢測的組織樣品分別按1.7和1.8中所述的判定標(biāo)準(zhǔn)分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。MC1R在不同的年齡、腫瘤原發(fā)部位、細(xì)胞分化程度和TNM 分期中的表達(dá)狀態(tài)如表3所示。

表3 食管鱗癌中MC1R表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between expression of MC1R and clinicopathological features in ESCC

在隨機(jī)抽取的食管鱗癌患者中，MC1R高表達(dá)更易發(fā)生于60歲以上的老年患者以及胸中段食管鱗癌和中分化食管鱗癌患者。將MC1R表達(dá)與TNM分期結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)MC1R高表達(dá)主要存在于T3期病例。

為了進(jìn)一步確定MC1R表達(dá)在食管鱗癌臨床中的意義，采用Fisher's精確檢驗(yàn)分析MC1R表達(dá)水平與年齡、腫瘤原發(fā)部位、細(xì)胞分化程度和TNM 分期等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析顯示W(wǎng)estern blotting方法檢測的冷凍組織樣品中MC1R 表達(dá)水平與T 分期相關(guān)（P＜0.05），與其他已獲得的臨床病理參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）；IHC方法檢測的切片組織樣品中MC1R表達(dá)水平與已獲得的臨床病理參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）。

3 討論

食管鱗癌是食管癌中最常見的類型，約占所有食管癌病例的90%［25］，因其現(xiàn)有標(biāo)志物的臨床診斷效果存在局限性［26］，故仍以CT、胃鏡和活檢等作為主要診斷方式。近年來，有關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物的研究逐漸增多，其中MC1R已被認(rèn)為是黑色素瘤的重要標(biāo)志物，在黑色素瘤中高表達(dá)且可作為黑色素瘤靶向治療的靶點(diǎn)［27,28］。迄今為止，有關(guān)MC1R與食管鱗癌的研究還未見報(bào)道，但實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞系ECA109中存在MC1R高表達(dá)的現(xiàn)象［12］。使用UALCAN平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析同樣顯示MC1R在食管癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05）。在此基礎(chǔ)上，本研究首次探討了MC1R在食管鱗癌中的表達(dá)及其在食管鱗癌臨床上的意義。

首先，為了確定MC1R在食管鱗癌細(xì)胞系的普遍表達(dá)水平，我們購買了大部分可購得的食管鱗癌細(xì)胞系，并分別利用RT-PCR方法與Western blotting方法檢測MC1R在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，除KYSE150之外的其他食管鱗癌細(xì)胞MC1R表達(dá)量均高于人食管上皮細(xì)胞BAr-T，且在所檢測的7株食管鱗癌細(xì)胞系中，5株食管鱗癌細(xì)胞MC1R表達(dá)量顯著高于食管上皮細(xì)胞BAr-T。因此，我們初步認(rèn)為MC1R的表達(dá)可能與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。

為了進(jìn)一步探究臨床食管鱗癌患者組織中MC1R的表達(dá)情況，對(duì)已獲得的19對(duì)冷凍保存的食管鱗癌組織及癌旁組織分別提取RNA和蛋白質(zhì)，并利用RT-PCR和Western blotting 檢測食管鱗癌組織中MC1R 在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，超過半數(shù)（10/19對(duì)）的樣品檢測結(jié)果為癌組織MC1R表達(dá)量高于癌旁組織，但采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，癌組織與癌旁組織間MC1R表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

為了提高樣本量，我們還抽取了32對(duì)食管鱗癌及癌旁組織的病理石蠟切片，通過IHC方法檢測組織切片中的MC1R表達(dá)情況。結(jié)果顯示大部分（30/32對(duì)）癌組織MC1R表達(dá)量高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩種組織之間MC1R表達(dá)量的差異分析，結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)癌旁組織相比，食管鱗癌組織樣本中MC1R表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。鏡下觀察免疫組化染色后的組織，可見癌旁食管組織鱗狀上皮增生，細(xì)胞排列整齊，層次清晰，無異型性，整體呈較淺的背景色；食管鱗癌組織不規(guī)則巢片狀排列，癌灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕黃色至棕褐色，細(xì)胞核未著色，說明MC1R在食管鱗癌細(xì)胞中呈漿陽性表達(dá)。這可能是因?yàn)镸C1R具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域［29］，抗體的免疫原即抗體針對(duì)的肽段也是多次跨膜的區(qū)域，導(dǎo)致抗體結(jié)合位點(diǎn)可能在細(xì)胞膜內(nèi)從而出現(xiàn)漿陽性的情況；此外，由于組織中細(xì)胞密度較高，在普通光學(xué)顯微鏡下難以明確辨別具體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，后續(xù)可使用膜蛋白特異性的Marker共染，來確認(rèn)是否為細(xì)胞膜表達(dá)。但整體而言，MC1R在食管鱗癌中表達(dá)呈陽性，且與對(duì)應(yīng)的食管癌旁組織相比表達(dá)量顯著升高。

食管鱗癌組織病理切片的IHC檢測結(jié)果顯示，癌組織與癌旁組織MC1R表達(dá)量具有極顯著差異（P＜0.01），而WB檢測結(jié)果未見顯著差異。造成這種現(xiàn)象的可能原因如下：一是IHC病理切片要求組織離體后置于福爾馬林溶液中固定，以保持細(xì)胞原有的成分，防止細(xì)胞溶解、抗原丟失［30］；而冷凍的組織受運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)的影響，存在抗原丟失的可能，進(jìn)而導(dǎo)致表達(dá)量檢測不夠精確。二是Western blotting通常檢測游離蛋白，而IHC可原位檢測組織切片的某個(gè)蛋白，在病理診斷中的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異性更高，漏診率低［31］。盡管如此，仍有78.4%（40/51）的病例食管鱗癌組織MC1R表達(dá)量高于癌旁組織，因此，我們認(rèn)為MC1R在食管鱗癌中普遍存在高表達(dá)現(xiàn)象。這表明MC1R在食管鱗癌的發(fā)生中處于活躍狀態(tài)，預(yù)示著MC1R與食管鱗癌的發(fā)生可能有潛在相關(guān)性，即對(duì)食管鱗癌的發(fā)生可能有促進(jìn)或抑制作用，MC1R有可能作為食管鱗癌潛在的分子標(biāo)志物。

食管鱗癌不同臨床治療措施的選擇很大程度上依賴于臨床病理參數(shù)［32］，如年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期等。因此，本研究分析了MC1R表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MC1R高表達(dá)更易發(fā)生在老年患者中，且以胸中段和中分化食管鱗癌較為普遍。此外，MC1R高表達(dá)主要存在于T3期，此時(shí)腫瘤已侵犯食管纖維膜，浸潤程度較深，不利于食管組織的徹底恢復(fù)［33］，這暗示了MC1R對(duì)于食管鱗癌的預(yù)后可能具有指示意義，MC1R高表達(dá)的食管鱗癌患者預(yù)后情況可能較差。

為了進(jìn)一步確定MC1R表達(dá)在食管鱗癌臨床中的意義，運(yùn)用Fisher's精確檢驗(yàn)分析MC1R表達(dá)水平與年齡、腫瘤原發(fā)部位、細(xì)胞分化程度和TNM分期等之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)分析顯示W(wǎng)estern blotting方法檢測的冷凍組織樣品中MC1R表達(dá)水平與T分期相關(guān)（P＜0.05），與其他已獲得的臨床病理參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）；IHC方法檢測的切片組織樣品中MC1R表達(dá)水平與已獲得的臨床病理參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）。這可能是由于獲取的樣品中低表達(dá)MC1R的數(shù)量較少、男性所占比例較大等原因，導(dǎo)致研究對(duì)象選擇性偏倚，因此在分析MC1R與臨床病理參數(shù)的關(guān)系時(shí)結(jié)果有所偏差。出現(xiàn)這種性別偏倚的現(xiàn)象主要是因?yàn)槭彻馨┰诎l(fā)病率和死亡率上都具有男性高于女性［34］的特點(diǎn)，導(dǎo)致難以獲取足夠的女性樣本，整體樣本量受到局限（包括樣本數(shù)量和樣本類型），未來需要大量女性患者的臨床病例研究以深入探討MC1R與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。此外，癌組織存在較正常組織更為復(fù)雜的生物學(xué)性狀，僅上述病理參數(shù)并不能充分反映食管鱗癌病灶內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)特征。目前可用于食管鱗癌臨床診斷的腫瘤標(biāo)志物有限，缺乏特異的診斷標(biāo)志物，很多病例缺乏相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的檢測，因此無法與其他腫瘤標(biāo)志物相結(jié)合以進(jìn)行更深入的分子生物學(xué)分析。但上述研究結(jié)果表明，MC1R在食管鱗癌發(fā)生中的異常表現(xiàn)值得關(guān)注，其表達(dá)量升高可能與T分期有關(guān)。在未來的研究中，我們將通過大規(guī)模的臨床研究，來進(jìn)一步評(píng)估食管鱗癌中MC1R表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

本研究分析了食管鱗癌中MC1R的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在食管鱗癌細(xì)胞系和食管鱗癌組織中的表達(dá)量較正常細(xì)胞和組織明顯升高，且MC1R高表達(dá)現(xiàn)象主要存在于老年、胸中段、中分化、T3期食管鱗癌患者中。綜上所述，MC1R與食管鱗癌的發(fā)生具有一定的關(guān)系，MC1R有可能作為食管鱗癌診斷的輔助分子標(biāo)志物，但其機(jī)制和具體臨床意義目前尚不明確，仍需進(jìn)一步探索。